雙孢蘑菇采后不同組織部位植物激素的產(chǎn)生規(guī)律

孟德梅 王華東 張亞璇 楊 瑞 樊振川 生吉萍

（1 省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 天津300457 2 天津市大健康生物技術(shù)國際聯(lián)合研究中心 天津300457 3 中國人民大學(xué)農(nóng)業(yè)與農(nóng)村發(fā)展學(xué)院 北京100872）

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus Lange Sing），又名白蘑菇、洋蘑菇，是世界上栽培最廣，產(chǎn)量銷量最多，消費(fèi)最普遍的一種食用菌[1]。雙孢蘑菇具有極高的營養(yǎng)價(jià)值[1]，它具有含水量高，呼吸旺盛，生理和營養(yǎng)物質(zhì)代謝快等特點(diǎn)[2]。在采后品質(zhì)下降方面主要表現(xiàn)為失水萎焉、組織褐變、破膜開傘3 個(gè)方面[3-4]。相比于其它果蔬，雙孢蘑菇常溫貨架期僅為3～4d[5]。目前，食用菌的保鮮方法大多為低溫冷藏法、氣調(diào)保鮮法、化學(xué)保鮮法等[6-7]，存在成本和能耗高、化學(xué)殘留和商業(yè)化程度低等[4，8]方面的問題。尋找并有針對(duì)性調(diào)控雙孢蘑菇自身發(fā)育和衰老機(jī)制中的關(guān)鍵點(diǎn)，是控制雙孢蘑菇采后品質(zhì)下降的重要方法。

果蔬后熟衰老與植物激素的關(guān)系已得到廣泛關(guān)注和深入研究，人們將植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)（比如激素）應(yīng)于生產(chǎn)實(shí)際中來控制果蔬完熟[9-11]。在五大類植物內(nèi)源激素中，乙烯和其它激素，如脫落酸（ABA）、赤霉素（GA）、生長素（IAA）和細(xì)胞分裂素（CTK）都從不同方面、不同程度地影響果蔬的后熟衰老[12]。衛(wèi)曉軼等[13]研究表明，GA 和IAA 均可調(diào)控?zé)煵葜仓甑募?xì)胞伸長。張?jiān)奇玫萚14]研究表明ABA 與草莓果實(shí)的成熟軟化有關(guān)。王云莉等[15]報(bào)道細(xì)胞分裂素6-BA 和激動(dòng)素能夠延緩青花菜的衰老。與果蔬相比，食用菌中同樣存在內(nèi)源激素生長調(diào)節(jié)因子，比如hercynine（組氨酸三甲基內(nèi)鹽）、10-氧-反式-8-癸烯酸（ODA）、CTK 和乙烯。研究報(bào)道，ODA 能夠刺激雙孢蘑菇、平菇等食用菌菌絲的生長、菌柄的伸長和子實(shí)體的形成[16]，外源細(xì)胞分裂素（benzyladenine）處理可以延緩雙孢蘑菇的開傘[17]，雙孢蘑菇培養(yǎng)料中乙烯釋放量的變化與子實(shí)體的出菇和生長發(fā)育可能有密切聯(lián)系[18-19]。這些結(jié)果說明植物激素可能在食用菌的生長發(fā)育和衰老中發(fā)揮重要作用。截止目前，有關(guān)食用菌中激素的報(bào)道非常少，對(duì)于內(nèi)源激素在食用菌采后貯藏中的產(chǎn)生規(guī)律和不同組織中的產(chǎn)生規(guī)律均不清楚。本文采用食用菌中的模式材料——雙孢蘑菇為試驗(yàn)對(duì)象，分別取不同貯藏期、不同組織部位的蘑菇樣品，進(jìn)行內(nèi)源激素含量的檢測(cè)，以期掌握雙孢蘑菇采后貯藏過程中不同組織部位內(nèi)源激素的產(chǎn)生規(guī)律，為尋找有效控制雙孢蘑菇采后品質(zhì)下降的新方法提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

未開傘成熟度的雙孢蘑菇 （菌株編號(hào)為F258）子實(shí)體采自煙臺(tái)久發(fā)食用菌有限公司，采后當(dāng)天運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。

酶聯(lián)免疫試劑盒，上海酶聯(lián)試劑盒檢測(cè)測(cè)定中心。

ABA、GA、IAA 和ZR 的標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma 公司。

其它常用試劑和藥品為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 分別選取形狀端正、大小均勻（3～4 cm）、無病蟲害及機(jī)械傷的雙孢蘑菇，放于聚乙烯塑料筐中，每個(gè)筐裝相同數(shù)量的雙孢蘑菇并在筐表面覆蓋保鮮膜，置于（20±1）℃，相對(duì)濕度85%～90%的陰涼環(huán)境中貯藏。貯藏0，1，2，3 d 和4 d 后，分別取10 個(gè)子實(shí)體，按照如圖1所示的4個(gè)蘑菇組織（菌皮、菌褶、菌蓋和菌柄）進(jìn)行分組織取樣，并迅速切成丁狀，用液氮冷凍5 min，然后儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱中。

1.2.2 開傘指標(biāo)測(cè)定

開傘度（%）=∑（開傘級(jí)別×該級(jí)別子實(shí)體個(gè)數(shù)）/（5×子實(shí)體總數(shù)）×100%

0 級(jí)，菇體無開傘；1 級(jí)，菇體開傘脹開度在0～5%；2 級(jí)，菇體開傘脹開度在5%～20%；3 級(jí)，菇體開傘脹開度在20%～50%；4 級(jí)，菇體開傘脹開度在50%～80%；5 級(jí)，菇體開傘脹開度在80%～100%。

1.2.3 激素含量測(cè)定 參考喬中全等[20]、赫冬梅等[21]報(bào)道的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）對(duì)采后雙孢蘑菇不同組織部位中ABA、GA、IAA 和ZR 含量進(jìn)行檢測(cè)，并加以修改。以ABA 測(cè)定為例，取1 g 不同組織部位的冷凍樣品，加入4 mL 預(yù)冷的提取液，在冰浴條件下研磨均勻后轉(zhuǎn)入10 mL 的試管中。在4 ℃環(huán)境過夜，4 ℃，12 000 r/min 離心10 min，上清即提取液。將上述樣品提取液經(jīng)C18萃取柱純化后，氮?dú)獯蹈?。根?jù)ELISA 試劑盒使用說明，經(jīng)過包被抗原、競(jìng)爭(zhēng)和加入二抗等4 個(gè)步驟，最后加入底物顯色，檢測(cè)490 nm 處的吸光值。用Logit 曲線[22]計(jì)算激素質(zhì)量濃度（μg/L），進(jìn)而換算出樣品中激素的含量（ng/g-1Fw）。ZR 與ABA 的測(cè)定方法相同。而在測(cè)定GA 與IAA 時(shí)，樣品經(jīng)C18萃取柱純化，參照畢會(huì)濤[23]的方法，加甲醇溶解，對(duì)樣品進(jìn)行甲酯化，然后經(jīng)氮?dú)獯蹈?，用ELISA 試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用Excel 2013 軟件分析所有數(shù)據(jù)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差并制圖。應(yīng)用SPSS 18.0 軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（ANOVA），利用鄧肯（Ducan）多重比較法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著分析，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙孢蘑菇貯藏過程中的形態(tài)變化

雙孢蘑菇子實(shí)體采后的繼續(xù)發(fā)育及衰老是造成其采后質(zhì)量損失的最重要因素[24]。雙孢蘑菇與一般的果蔬不同，是一種特殊真菌，釋放孢子是其主要的功能。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在貯藏20 ℃環(huán)境中，隨著子實(shí)體的繼續(xù)發(fā)育，子實(shí)體膨大，在貯藏1 d時(shí)菌膜開始破裂，出現(xiàn)開傘現(xiàn)象。貯藏2 d 時(shí)成熟菌褶暴露，貯藏3 d 后開始產(chǎn)生并釋放孢子 （圖2b）。雙孢蘑菇伴隨其子實(shí)體繼續(xù)發(fā)育，從未開傘到完全開傘（圖2a），菌褶逐漸擴(kuò)張并暴露，最終產(chǎn)生孢子，進(jìn)入衰老階段。

圖1 雙孢蘑菇子實(shí)體貯藏前、后不同組織取樣部位（菌皮、菌蓋、菌褶、菌柄）Fig.1 Different sampling tissues （pileipellis，pileus，gill and stipe） of A.bisporus fruiting bodies before and after storage

圖2 雙孢蘑菇貯藏過程（20 ℃）中子實(shí)體的開傘情況（a）及外觀形態(tài)變化（b）Fig.2 Changes on the cap opening （a） and appearance （b） of A.bisporus fruiting bodies during storage at 20 ℃

2.2 ABA 在雙孢蘑菇不同組織中的產(chǎn)生規(guī)律

ABA 是目前公認(rèn)的內(nèi)源激素之一，在抑制生長和加速衰老方面有重要作用[25]。蘑菇采后貯藏期分為繼續(xù)發(fā)育和衰老兩個(gè)時(shí)期[26]，這兩個(gè)生理過程是導(dǎo)致食用菌品質(zhì)下降的重要因素。從圖3可以看出，4 種組織中的ABA 含量均于貯藏2 d 時(shí)出現(xiàn)峰值，與成熟菌褶暴露的時(shí)間相吻合，說明ABA可能在啟動(dòng)雙孢蘑菇采后衰老過程中發(fā)揮調(diào)控作用。此外，貯藏3 d 后在4 種組織中的ABA 含量均呈增加趨勢(shì)，說明ABA 參與雙孢蘑菇衰老過程的調(diào)控。從分組織來看，貯藏2 d 時(shí)菌柄（圖3d）中ABA 含量表現(xiàn)出顯著的增加趨勢(shì)，為貯藏前的1.6倍，說明相比采后菌褶和菌蓋的繼續(xù)擴(kuò)張，ABA 對(duì)采后菌柄的伸長發(fā)揮更為重要的調(diào)控作用。

圖3 雙孢蘑菇20 ℃貯藏過程中菌皮 （a）、菌褶 （b）、菌蓋 （c）和菌柄 （d）中ABA 含量的變化Fig.3 The change of ABA content in pileipellis （a），gill （b），pileus （c） and stipe （d） of A.bisporus fruiting bodies during storage at 20 ℃

2.3 GA 在雙孢蘑菇貯藏過程不同組織中的產(chǎn)生規(guī)律

GA 最顯著的生理效應(yīng)是通過細(xì)胞數(shù)目的增加和細(xì)胞的伸長來促進(jìn)果實(shí)的生長發(fā)育[27]。由圖4可以看出，子實(shí)體4 種組織中的GA 含量均在貯藏1 d 時(shí)出現(xiàn)峰值，與雙孢蘑菇破膜開傘時(shí)間（圖2）一致，說明GA 可能調(diào)控雙孢蘑菇采后的繼續(xù)發(fā)育過程，與其破膜開傘關(guān)系密切。其中，菌柄（圖4d）中GA 含量在貯藏1 d 時(shí)增加最為顯著，次之為菌皮（圖4a），分別增至貯藏前的1.82 倍和1.44倍，表明GA 與采后子實(shí)體的繼續(xù)發(fā)育有關(guān)，調(diào)控了子實(shí)體采后的膨大和菌柄的伸長過程。貯藏后期，除菌褶外，其它3 種組織中的GA 含量均呈逐漸增加趨勢(shì)，其中菌蓋（圖4c）中的增加速率最大，說明GA 對(duì)于子實(shí)體采后的完全開傘以及衰老后期孢子的產(chǎn)生起重要的調(diào)控作用。

圖4 雙孢蘑菇20 ℃貯藏過程中菌皮（a）、菌褶（b）、菌蓋（c）和菌柄（d）中GA 含量的變化Fig.4 The change of GA content in pileipellis （a），gill （b），pileus （c） and stipe （d） of A.bisporus fruiting bodies during storage at 20 ℃

2.4 IAA 在雙孢蘑菇采后貯藏過程不同組織中的產(chǎn)生規(guī)律

IAA 是5 種經(jīng)典植物激素之一，隨GA 的發(fā)現(xiàn)而被分離出來[28]。IAA 可直接影響細(xì)胞擴(kuò)大和極性形成等細(xì)胞反應(yīng)，也能夠誘導(dǎo)生長素早期響應(yīng)基因SAUR 的表達(dá)[29]。由圖5所示，與GA 相似，4種組織中的IAA 含量在貯藏1 d 時(shí)均出現(xiàn)峰值。相比于菌皮，菌褶、菌蓋和菌柄3 個(gè)組織中的IAA含量在1 d 的峰值較為顯著，分別增至貯藏前的1.92，2.47 倍和1.89 倍，說明子實(shí)體中內(nèi)源IAA 的水平可能與采后菌褶厚度的增加、菌柄的伸長及菌蓋的擴(kuò)張有關(guān)。此外，在貯藏后期4 種組織中IAA 含量均呈上升趨勢(shì)，說明在孢子產(chǎn)生及釋放過程中IAA 也起到一定的調(diào)控作用。

2.5 ZR 在雙孢蘑菇貯藏過程不同組織中的產(chǎn)生規(guī)律

玉米素核苷是常見的細(xì)胞分裂素，可以促進(jìn)細(xì)胞分裂，促進(jìn)芽的生成，阻止葉片衰老[30]。由圖6所示，整個(gè)貯藏期間菌柄（圖6d）中ZR 含量沒有明顯變化，菌褶、菌皮和菌蓋中的ZR 含量分別在貯藏1，3 和3 d 時(shí)出現(xiàn)高峰（圖6A-6C）。尤其菌褶和菌蓋中的峰值水平分別增至貯藏前的2.10倍和2.24 倍，說明ZR 在子實(shí)體采后的細(xì)胞擴(kuò)張和孢子形成中起一定調(diào)控作用，即在雙孢蘑菇采后的繼續(xù)發(fā)育和衰老中發(fā)揮作用。

3 討論

雙孢蘑菇是食用菌研究領(lǐng)域的模式材料，試驗(yàn)首次探究了ABA、GA、IAA 和ZR 4 種激素在雙孢蘑菇采后貯藏過程中不同組織中的產(chǎn)生規(guī)律。試驗(yàn)結(jié)果表明，這4 種激素在雙孢蘑菇子實(shí)體采后繼續(xù)發(fā)育及衰老的生理活動(dòng)等方面發(fā)揮重要調(diào)控作用，并且在菌皮、菌蓋、菌褶和菌柄組織中產(chǎn)生規(guī)律不同，這與葛毅強(qiáng)等[9]對(duì)葡萄采后內(nèi)源激素中的研究一致，說明內(nèi)源激素通過調(diào)控各組織器官的生理生化反應(yīng)，進(jìn)而影響果蔬的生長和衰老。

圖5 雙孢蘑菇20 ℃貯藏過程中菌皮（a）、菌褶（b）、菌蓋（c）和菌柄（d）中IAA 含量的變化Fig.5 The change of IAA content in pileipellis （a），gill （b），pileus （c） and stipe （d） of A.bisporus fruiting bodies during storage at 20 ℃

圖6 雙孢蘑菇20 ℃貯藏過程中菌皮 （a）、菌褶 （b）、菌蓋 （c）和菌柄 （d）中ZR 含量的變化Fig.6 The change of ZR content in pileipellis （a），gill （b），pileus （c） and stipe （d） of A.bisporus fruiting bodies during storage at 20 ℃

開傘是表征雙孢蘑菇形態(tài)質(zhì)量的一個(gè)重要參數(shù)[31]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在20 ℃的貯藏條件下，雙孢蘑菇貯藏1 d 時(shí)菌體繼續(xù)發(fā)育，進(jìn)行新陳代謝和營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化。貯藏第2 天，雙孢蘑菇開始衰老，整個(gè)衰老過程從未開傘的孢子形成，到完全開傘的成熟菌褶暴露，最后到孢子的彈射。試驗(yàn)結(jié)果表明，ABA 參與采后雙孢菇子實(shí)體衰老的全部過程。有研究證明ABA 調(diào)控了番茄[32-33]、芒果[34]和香蕉[35]等呼吸躍變型果實(shí)的成熟衰老[36]，而雙孢蘑菇作為典型的高呼吸強(qiáng)度的躍變型蔬菜[31]，在菌蓋開傘之前出現(xiàn)呼吸高峰，因此推測(cè)ABA 是通過調(diào)節(jié)呼吸作用，啟動(dòng)雙孢蘑菇的成熟衰老進(jìn)程。從分組織來看，相對(duì)于菌褶和菌蓋，ABA 對(duì)于菌柄和菌皮的采后衰老調(diào)控作用更強(qiáng)。這驗(yàn)證了高江曼[37]的試驗(yàn)，ABA 在不同的組織器官中含量不同，并在細(xì)胞生長和衰老過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

子實(shí)體菌蓋的擴(kuò)張和菌柄的伸長是雙孢蘑菇采后貯藏過程中繼續(xù)發(fā)育的典型特征[24]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌柄組織中GA 含量在開傘時(shí)增長最多，說明GA 對(duì)菌柄的生長調(diào)控有著重要作用。值得注意的是，菌柄富含纖維素，推測(cè)GA 對(duì)菌柄生長的促進(jìn)作用是對(duì)纖維素形成的正調(diào)控。劉尊英等[38]研究表明GA 對(duì)纖維素的形成以及品質(zhì)的變化有一定的影響。同時(shí)，與ABA 峰值出現(xiàn)時(shí)間相比較，GA 在不同組織中的峰值出現(xiàn)時(shí)間均提前至貯藏后1d，說明GA 在雙孢蘑菇的采后破膜開傘過程中，起到重要的調(diào)控作用。隨著貯藏時(shí)間的推移，后期GA 含量在所有組織中都呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢(shì)，說明GA 對(duì)衰老過程中孢子的產(chǎn)生起調(diào)控作用。綜合起來看，GA 可能對(duì)雙孢蘑菇的采后繼續(xù)發(fā)育以及子實(shí)體的衰老都發(fā)揮重要的調(diào)控作用。薛夢(mèng)林等[39]研究表明，外源GA 能顯著延緩脆棗果實(shí)硬度的下降，并通過抑制相關(guān)酶的活性延緩果實(shí)的衰老，這與本研究結(jié)果相一致，均表明GA 對(duì)果蔬的衰老及品質(zhì)具有一定的調(diào)控作用。

作為常見的植物激素之一的生長素，幾乎控制著果蔬生長發(fā)育的全部過程[40]。原牡丹等[41]在草莓果實(shí)中發(fā)現(xiàn)，不同組織部位中的IAA 含量有差異。在雙孢蘑菇采后貯藏1 d 時(shí)，菌褶、菌蓋和菌柄中IAA 含量的增加量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過菌皮，這說明雙孢蘑菇中內(nèi)源IAA 的水平可能與采后子實(shí)體的繼續(xù)發(fā)育有關(guān)。而往往激素對(duì)生物體的調(diào)控不是單一的，是多種激素共同作用的結(jié)果[13]。多篇文獻(xiàn)報(bào)道IAA 與GA 有著協(xié)同作用，在豌豆[42]、煙草[43]和大麥[44]中驗(yàn)證了IAA 和GA 能相互促進(jìn)生長。而本試驗(yàn)結(jié)果也表明，IAA 與GA 含量的變化規(guī)律相似，推測(cè)二者很有可能在雙孢蘑菇子實(shí)體采后繼續(xù)發(fā)育和衰老中發(fā)揮相互協(xié)調(diào)的作用。

ZR 相比較IAA、GA 和ABA，在雙孢蘑菇子實(shí)體中呈現(xiàn)更為明顯的組織差異性。采后第1 天的菌褶和第3 天的菌蓋中ZR 含量明顯增加，說明ZR 與開傘和孢子形成密切相關(guān)，在調(diào)控采后繼續(xù)發(fā)育和衰老中有一定的重要作用。齊飛艷等[45]研究結(jié)果顯示：ZR 能夠調(diào)控促進(jìn)毛竹的發(fā)育，而且在開花毛竹各器官中呈現(xiàn)明顯的組織差異性（花＞枝＞稈＞鞭）。在本研究中也發(fā)現(xiàn)內(nèi)源ZR 含量在雙孢蘑菇子實(shí)體組織中的差異性較大，能對(duì)生長發(fā)育有一定的作用。

4 結(jié)論

綜上所述，ABA 啟動(dòng)并參與了雙孢蘑菇采后整個(gè)衰老生理過程，尤其在菌柄組織采后的衰老過程中作用更為突出。IAA 與GA 含量在雙孢蘑菇采后貯藏中的變化規(guī)律相似，協(xié)同調(diào)控了菌皮和菌柄組織采后的繼續(xù)發(fā)育過程，并與子實(shí)體采后的破膜開傘和后期孢子產(chǎn)生的過程有關(guān)。此外，ZR 在子實(shí)體采后菌褶和菌蓋的擴(kuò)張及孢子形成中均發(fā)揮重要的調(diào)控作用。