新疆額爾齊斯河冷水性鯉魚腸道細(xì)菌多樣性分析

黃麗麗 孫海龍 倪永清 周 紅*

（1 石河子大學(xué)食品學(xué)院 新疆石河子832000 2 江南大學(xué)食品學(xué)院 江蘇無錫214122）

鯉魚（Cyprinus carpio），俗稱鯉子，屬于硬骨魚綱，鯉形目，鯉科，是分布最廣、歷史最為悠久的淡水魚之一。其適應(yīng)環(huán)境的能力比較強(qiáng)，可在低溫及溶氧條件下存活。鯉魚喜歡生活在營養(yǎng)豐富的底層或水草滋生繁茂的水域，常棲息于水流緩慢的河川、湖泊、水庫、池塘等地區(qū)。鯉魚是雜食性魚類，主要以藻類、水生植物以及各種浮游生物和底棲動物等為食[1]。魚類生活的環(huán)境（水體）、食物中存在著大量的微生物，在魚類生長發(fā)育過程中，這些微生物隨著魚類的飲水或進(jìn)食進(jìn)入其消化道，由此建立起復(fù)雜的腸道微生物區(qū)系[2-4]。

魚腸道內(nèi)寄生著的各種微生物，對魚體的營養(yǎng)、健康和免疫等發(fā)揮著極其重要的作用[3，5-7]。魚腸道最初只是一個相對簡單而密閉的腔道，在胚胎時期開始逐漸地變長、彎曲，最后發(fā)育成熟[8]。剛孵化的魚仔的腸道是無菌的[2]，之后孵化出的幼魚開始攝食和飲水，這樣魚腸道內(nèi)就逐漸形成了一個由好氧、厭氧和兼性厭氧的微生物組成菌群[9-10]。魚類的腸道微生物菌群并不是對其棲息環(huán)境中微生物的簡單反映[11]。正常生理?xiàng)l件下，定植在魚腸道中的各種微生物保持平衡狀態(tài)，是一個多種群動態(tài)變化的系統(tǒng)[4，10，12]。魚腸道菌群結(jié)構(gòu)的組成與魚的種類、生存環(huán)境和捕食習(xí)性等因素密切相關(guān)[12-14]。研究表明，在淡水魚類的腸道中，比較常見的微生物主要有擬桿菌屬（Bacteroide）、鄰單胞菌屬（Plesiomonas）、氣單胞菌屬（Aeromonas）、腸桿菌屬（Enterobacter）、不動桿菌（Acinetobacter）和假單胞菌屬（Pseudomonas），海水魚中主要是假單胞菌（Pseudomonas）、微 球 菌 屬（Micrococcus）、無 色桿菌屬（Achromobacter）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、交替單胞菌屬 （Alteromonas）、黃桿菌屬（Flavobacterium）和弧菌（Vibrio）[15]。而在鯉魚腸道中，擬桿菌門（Bacteroidetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）和變形菌門（Proteobacteria）是其優(yōu)勢菌群[16]。Han 等[17]對生存于相同環(huán)境中的雜食性鯉魚、鯽魚以及其它食性的8 種魚的腸道微生物區(qū)系進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明魚類的營養(yǎng)水平不同會顯著影響其腸道微生物組成與多樣性。另外，不同區(qū)段的魚腸道中，微生物菌落結(jié)構(gòu)有所不同。Moran 等[18]利用末端限制片段長度多態(tài)性（Terminal restriction fragment length polymorphism，TRFLP） 技術(shù)分析草食性海水魚 （Kyphosus sydneyanus）腸道菌群的多樣性，發(fā)現(xiàn)后腸中的細(xì)菌群落的多樣性比較復(fù)雜。也有研究顯示，淡水類鯉科魚的腸道細(xì)菌數(shù)量從前腸至后腸逐漸增多，這有可能是腸道內(nèi)容物由前向后推進(jìn)，或者是后腸的腸道內(nèi)容物和環(huán)境更適合細(xì)菌的生長繁殖[19]。目前有關(guān)鯉魚腸道細(xì)菌多樣性的報(bào)道主要集中在人工養(yǎng)殖的鯉魚，對野生鯉魚腸道細(xì)菌研究較少，尤其與冷水性鯉魚相關(guān)的報(bào)道幾乎為零。

額爾齊斯河流域 （47°00′～49°10′N，85°31′～90°31′E）位于我國新疆北部，屬于中高緯度地區(qū)，水質(zhì)清澈（基本無污染），河內(nèi)水生生物豐富多樣。額爾齊斯河平均水溫常年低于20 ℃，棲居著大量的冷水性魚類，長期以來一直為我國漁業(yè)行業(yè)所關(guān)注。鯉魚作為額爾齊斯河主要冷水性魚類之一，主要分布在額爾齊斯河布爾津河段。本研究采用Illumina MiSeq 測序技術(shù)對新疆額爾齊斯河流域的野生冷水性鯉魚腸道中不同區(qū)段細(xì)菌微生物組進(jìn)行比較研究，以期了解鯉魚腸道細(xì)菌群落的組成差異及其多樣性，為額爾齊斯河冷水魚資源的保護(hù)、開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與主要試劑

1.1 材料與試劑

2014年8月，在新疆額爾齊斯河采集成年野生鯉魚（Cyprinus carpio），編號LY，體重（8.00 ±0.3）kg，分為3 組，置于4 ℃冷藏，12 h 內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。

相關(guān)生理生化試驗(yàn)試劑，天津市巴斯夫化學(xué)試劑廠；DNA 提取試劑盒（Qiagen，Germany）QIAGEN 公司。

1.2 主要儀器和設(shè)備

凝膠成像系統(tǒng) （Gel DOC XR），Bio Rad 公司；超微量紫外分光光度計(jì) （NanoDrop 2000），Thermo 公司；水平電泳儀（Power Pac Universal），Bio Rad 公司；高速冷凍離型機(jī) （Fresco21 型），Thermo 公司。

2 方法

2.1 樣品處理

新鮮的鯉魚樣品先用70%的酒精漂洗，在無菌操作臺上解剖，得到鯉魚腸道。腸道外表面再用70%的酒精擦拭，在無菌條件下每條魚按照前腸（Q）、中腸（Z）和后腸（H）將其腸道分為3 段[20]，然后收集腸道樣品放入已滅菌的離心管中，于4 ℃條件下保存。

2.2 樣品總DNA 的提取

準(zhǔn)確稱取鯉魚腸道樣品1 g 于10 mL 無菌PBS（pH 7.4） 緩沖液中，使樣品充分溶解。取混合液在4 ℃條件2 000 r/min 離心5 min，棄沉淀。吸取上層液體于另一干凈的無菌離心管中，4 ℃下10 000 r/min 離 心10 min，收 集 沉 淀。按 照TIANamp Stool DNA Kit 試劑盒要求提取沉淀中的細(xì)菌總DNA。提取的DNA 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析后，用超微量紫外分光光度計(jì)檢測總DNA 的濃度和純度，最后將DNA 于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 PCR 擴(kuò)增及高通量測序

以樣品總DNA 為模板，對細(xì)菌16Sr RNA 基因的V4 區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，上游引物515F：5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’，下游引物806R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’，并引入接頭。PCR 擴(kuò)增體系25 μL，預(yù)混液（5×Prime Hot Master Mix） 10 μL，引物各0.5 μL，DNA 模板1 μL，補(bǔ)足ddH2O 至25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，（94 ℃45 s；50 ℃60 s；72 ℃90 s）×35 次循環(huán)，后72 ℃終延伸10 min[21]。PCR 產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，并利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化產(chǎn)物，采用Illumina MiSeq 測序平臺進(jìn)行高通量測序。

3 結(jié)果與分析

3.1 鯉魚腸道樣品的DNA 預(yù)定量

提取的樣品DNA 用超微量紫外分光光度計(jì)測定濃度與純度，并依據(jù)OD260/OD280值檢測DNA純度。由表1可知，樣品DNA 的OD260/OD280值在1.8～2.0 之間，OD260/OD230值均大于2.0，符合測序要求。

3.2 鯉魚腸道門水平細(xì)菌組成及其多樣性

利用Illmina miseq 高通量測序?qū)︴庺~腸道樣品的16S rDNA 基因V4 區(qū)進(jìn)行分析，獲得35 289個優(yōu)化序列。按照97%的相似度進(jìn)行OTU 分類，共劃分158 個OTU，見圖1。通過計(jì)算多樣性指數(shù)發(fā)現(xiàn)，鯉魚后腸的ACE 指數(shù)和Chao 指數(shù)明顯高于前腸和中腸，說明后腸中物種豐度最高。此外，后腸的Shannon 指數(shù)最小，Simpson 指數(shù)最大，表明鯉魚后腸中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜。而鯉魚前腸和中腸中ACE、Chao、Shannon 和Simpson 指數(shù)幾乎相同，兩者差異不顯著。

表1 樣品DNA 的濃度與純度Table 1 The concentration and purity of DNA in the samples

圖1 鯉魚腸道不同區(qū)段的細(xì)菌多樣性指數(shù)Fig.1 Bacterial diversity index in different segments of carp intestine

根據(jù)各樣品OTU 分類結(jié)果進(jìn)行物種注釋，分別在門和綱水平下統(tǒng)計(jì)樣品物種的豐度。從鯉魚腸道中共鑒定出12 個細(xì)菌門，分別是酸桿菌門（Acidobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、藍(lán)菌門（Cyanobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、浮霉菌門（Planctomycetes）、變形菌門（Proteobacteria）、互養(yǎng)菌門（Synergistetes）、硝化螺菌門（Nitrospira）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、未分類菌群（Others）（圖2a）。其中，變形菌門（38.80%）是鯉魚腸道中最豐富的類群，其次是厚壁菌門（31.86%）；擬桿菌門（7.47%）和放線菌門（7.26%）等豐度也較高，且鯉魚腸道不同區(qū)段均有分布。在前腸和中腸中最占優(yōu)勢的菌群門也是變形菌門，占各自樣本序列的56.24%和55.85%；其次是擬桿菌門，分別占其樣本序列的11.04%和11.42%。鯉魚后腸中厚壁菌門為其優(yōu)勢菌，其所占比例達(dá)到58.06%；變形菌門是其第二大優(yōu)勢菌群。如圖2b 所示，對鯉魚腸道的主要細(xì)菌類群做進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，變形菌門主要由α-變形菌綱（Alphaproteobacteria），β-變形菌綱 （Betaproteobacteria），δ-變形菌綱（Deltaproteobacteria），γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）構(gòu)成，厚壁菌門主要以芽孢桿菌綱（Bacilli）和梭菌綱（Clostridia）為主，而黃桿菌（Flavobacteria）是擬桿菌門的主要構(gòu)成部分。γ-變形菌綱在鯉魚腸道中占主要優(yōu)勢，其次是β-變形菌門和桿菌。前腸的綱類群有α-變形菌綱，β-變形菌綱，δ-變形菌綱，γ-變形菌綱，黃桿菌和互養(yǎng)菌綱等，其中γ-變形菌綱豐度最高，占其樣本序列的29.94%。在中腸豐度最高也是γ-變形菌綱 （27.74%），其中有12.07%的樣本序列被劃分為葉綠體（類似于藍(lán)藻細(xì)菌），這些序列可能是來源于食物成分中植物的葉綠體序列，此外檢測到β-變形菌綱（11.68%），δ-變形菌綱（11.08%）等。而后腸中卻只檢測到酸桿菌綱、芽孢桿菌綱、梭菌綱和Negativicutes 綱，4者的占比分別為24.42%，64.55%，10.88%和0.14%。由此可以看出，鯉魚腸道中不同區(qū)段的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有所不同，前腸和中腸細(xì)菌的組成和豐度比例較為相似，與后腸存在顯著差異。

圖2 門和綱水平不同區(qū)段的鯉魚腸道細(xì)菌組成Fig.2 Bacteria composition in different segments of carp intestine at phylum and class levels

3.3 鯉魚腸道屬水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其組成差異

如圖3所示，屬水平上鯉魚腸道中細(xì)菌主要由乳球菌屬（Lactococcus）、極小單胞菌屬（Pusillimonas）、肉食桿菌屬（Carnobacterium）、棒狀桿菌（Corynebacterium）、腸球菌屬（Enterococcus）、土壤紅桿菌屬 （Solirubrobacter）、伯克氏菌屬（Burkholderia）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、螺菌屬（Leptospirillum）、硫桿菌屬（Acidithiobacillus）、不動桿菌屬 （Acinetobacter）、鹽單胞菌屬（Halomonas）、固氮弧菌 （Azoarcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、紅球菌屬（Rhodococcus）和明串珠菌屬（Trichococcus）等組成。在鯉魚腸道中最占優(yōu)勢的菌群是肉食桿菌屬（14.69%）；其次是硫桿菌屬（10.32%）、乳球菌屬（7.74%）、固氮弧菌（6.75%）、螺菌屬（5.61%）和極小單胞菌屬（4.13%），占樣本總量的近50%。在前腸和中腸中硫桿菌屬占主要優(yōu)勢，分別占各自樣本序列的15.00%和18.77%；其后是固氮弧菌，在樣本中的豐度分別為10.84%和10.77%。而在后腸中，以肉食桿菌屬、乳球菌屬、腸球菌屬和土壤紅桿菌屬等為主，其中肉食桿菌屬占其樣本序列的31.69%，是后腸中的主要菌群，乳球菌屬（10.78%）次之。不同區(qū)段的鯉魚腸道中細(xì)菌數(shù)量有所不同，其中硫桿菌屬、固氮弧菌、螺菌屬、極小單胞菌屬等在腸和中腸中所占比例較高，而在后腸中豐度急劇下降，占比分別降到2.41%，1.92%，0.07%，1.33%和1.10%；而肉食桿菌屬、腸球菌屬、土壤紅桿菌屬、棒狀桿菌、鏈球菌屬、紅球菌、梭菌在后腸豐度較高，在前腸和中腸豐度極低，不足1%，而在后腸則迅速增多。此外，有些類群則僅在特定的樣品中出現(xiàn)，如土壤紅桿菌屬僅在中腸和后腸存在，在中腸豐度較低，而后腸中比例達(dá)5.46%；同樣，前腸和后腸所特有的屬是梭菌屬，在前腸中豐度較低，而后腸中比例為3.91%；與后腸相比，這些菌群在前腸和中腸的相對豐度通常較低，物種豐度也明顯低于后腸。聚類結(jié)果表明鯉魚前腸和中腸的細(xì)菌組成和豐度比例相近，兩樣本具有相似性，而后腸中細(xì)菌的種類和數(shù)量均與前腸和中腸存在差異，這說明不同區(qū)段的鯉魚腸道中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有所不同。由圖4可知，前腸和中腸之間差異比較小，中腸和后腸次之，而前腸和后腸樣本間群落結(jié)構(gòu)差異最大，表明鯉魚前腸和中腸的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)較相似。

圖3 鯉魚腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Heatmap 圖Fig.3 The Heatmap of bacterial community structure in carp intestinal

圖4 不同區(qū)段的鯉魚腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異分析Fig.4 Differential analysis the community structure in different segments of carp intestine

根據(jù)鯉魚腸道不同區(qū)段中細(xì)菌的豐度差異，對20 個主要的屬進(jìn)行相關(guān)性分析（圖5），結(jié)果表明樣品中各個細(xì)菌屬之間存在一定的相關(guān)性。由圖5可知，伯克氏菌和硫桿菌與其它屬之間的相關(guān)性都比較低，這3 個屬的數(shù)量隨著鯉魚腸道由前至后呈遞減趨勢。而分枝桿菌（Mycobacterium）、棒狀桿菌、梭菌和土壤紅桿菌之間的正相關(guān)性比較大，其在前腸和中腸所占比例較低，而在后腸中數(shù)量顯著增加，分別為2.65%，2.39%，1.79%，1.26%和2.50%。此外，隨著乳球菌、肉食桿菌等乳酸菌數(shù)量的增加，假單胞菌前腸的3.69%降到中腸的2.82%，最后在后腸中所占比例僅有0.40%，它們之間表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)性；在乳球菌、鏈球菌、腸球菌和肉食桿菌之間數(shù)量變化趨勢一致，而且從前腸到后腸是逐漸增多的。它們中增長趨勢最大是肉食桿菌，在前腸和中場中占比只有0.12%和0.69%，而在后腸中肉食桿菌的比例為31.69%。乳球菌、鏈球菌和腸球菌各自在后腸中的占比為10.78%，1.44%和6.38%，是后腸中的主要菌群。

4 討論

魚類腸道菌群與其宿主形成了相互作用、相互依賴的統(tǒng)一體，是宿主必不可少的關(guān)鍵部分[22]。魚腸道中的微生物種類繁多，數(shù)量極大，包括好氧、專性厭氧和兼性厭氧等微生物。據(jù)報(bào)道，細(xì)菌是魚腸道主要的微生物種類[23]。在魚類的腸道中的細(xì)菌，比較常見的主要有弧菌、氣單胞菌屬、鄰單胞菌、假單胞菌、腸桿菌、微球菌、不動桿菌、梭菌和擬桿菌等[24]。因魚的食性，生存環(huán)境等差異，故在優(yōu)勢菌群和群落結(jié)構(gòu)組成及比例方面均有所不同。Han 等[17]采用高通量測序技術(shù)研究蕪湖野生鯉魚腸道中的細(xì)菌群落，發(fā)現(xiàn)梭菌和擬桿菌是鯉魚腸道中占主要優(yōu)勢的類群。Maartje 等[25]研究人工養(yǎng)殖的鯉魚腸道微生物結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，梭菌、擬桿菌和浮霉菌為其主要的優(yōu)勢菌群。而在本研究中，冷水鯉魚腸道中主要以梭菌、擬桿菌、假單胞菌、氣單胞菌和一些乳酸菌（Lactic acid bacteria）為主。與以上研究相比，優(yōu)勢菌群基本一致，豐度比例卻各有不同，這可能是棲息環(huán)境、營養(yǎng)水平等對鯉魚腸道菌群組成的影響。有研究表明，魚腸道內(nèi)的細(xì)菌，如發(fā)光細(xì)菌、弧菌、細(xì)桿菌、微球菌、不動桿菌、假單胞菌、氣單胞菌以及一些未鑒定出的厭氧菌等都可以分泌蛋白酶、α-淀粉酶等消化酶，促進(jìn)魚類的消化和吸收[7]。另外，乳酸菌也是魚類腸道菌群的重要組成成分，在本研究中檢測到乳球菌、腸球菌、鏈球菌、明串珠菌和肉食桿菌等乳酸菌。研究表明乳酸菌不僅有助于魚類的消化吸收，還能競爭腸壁附著點(diǎn)分泌抑菌物質(zhì)來抑制致病菌的增殖，保持腸道微生物區(qū)系的穩(wěn)定，增強(qiáng)魚類的免疫力[26]。Robertson 等[27]發(fā)現(xiàn)在大馬哈魚腸道中分離出的肉食桿菌能抑制氣單胞菌、黃桿菌和弧菌等病原菌。Carlos 等[28]在虹鱒魚中鑒定出片球菌、乳球菌、魏斯氏菌、肉食桿菌等乳酸菌具有抗菌活性，能抑制主要的魚源性致病菌，減少病原菌在魚腸道內(nèi)的定植，可作為微生物飼料添加劑應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中。

圖5 鯉魚腸道細(xì)菌群落屬間相關(guān)性分析Fig.5 Correlation analysis the community of carp intestinal at genus level

研究顯示，魚類的腸道微生物群落的組成和功能在不同的腸道區(qū)域和器官各不相同[29]。Ni等[30]發(fā)現(xiàn)魚類的腸道菌群不只受外界環(huán)境的影響，其所處的腸道部位的不同微生物群落組成也有所不同。對成年大比目魚（Scophthalmus maximus）的腸道微生物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其胃、前腸、后腸和直腸中的細(xì)菌群落存在明顯差異，具有地域特異性，并且細(xì)菌群落的多樣性從胃到直腸依次降低[31]。Moran 等[32]也證實(shí)了草食性海水魚（Kyphosus sydneyanus）腸道的不同部位的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)不同，其中后腸細(xì)菌多樣性高于前腸。本研究中，通過計(jì)算多樣性指數(shù)發(fā)現(xiàn)冷水性鯉魚后腸物種豐度高于前腸和中腸，后腸的細(xì)菌多樣性最復(fù)雜。其中梭菌、乳球菌、棒狀桿菌、腸球菌、鏈球菌、紅球菌、Solirubrobacter、明串珠菌、漫游球菌和肉食桿菌等菌群隨著鯉魚腸道從前腸到后腸逐漸增多，這可能是由于后腸更利于細(xì)菌的生長繁殖的緣故。研究表明鯉魚前腸中的細(xì)菌大多數(shù)依賴于宿主的營養(yǎng)而生存，而后腸中細(xì)菌的生長繁殖主要靠吸收食物中的營養(yǎng)成分[33]。此外，Kihara 等[34]發(fā)現(xiàn)鯉魚腸道中的細(xì)菌能分解利用飲食中酶不消化性低聚糖產(chǎn)生短鏈脂肪酸（Short Chain Fatty Acid，SCFA），包括乙酸、丙酸和丁酸等。本研究中發(fā)現(xiàn)后腸中乳酸菌的數(shù)量較多，是后腸中的主要菌群，這可能是因?yàn)槭澄镌诤竽c發(fā)酵產(chǎn)生的酸環(huán)境更利于乳酸菌的定植。另外，乳球菌、肉食桿菌等乳酸菌常被作為益生菌添加于飼料中，可以提高魚類的免疫功能[26]。假單胞菌、氣單胞菌和黃桿菌是常見的魚類致病菌[27]。本研究中發(fā)現(xiàn)隨著乳酸菌數(shù)量的增加，假單胞菌、伯克氏菌等病原菌減少，推測這可能是乳酸菌在腸道中代謝產(chǎn)生的細(xì)菌素等活性物質(zhì)會抑制病原菌的生長。乳球菌鏈球菌、肉食桿菌、腸球菌各種乳酸菌之間的還表現(xiàn)出協(xié)同作用，這為混合益生菌飼料添加劑的開發(fā)和研究提供理論依據(jù)。

本文對額爾齊斯河冷水性鯉魚冷水鯉魚不同區(qū)段腸道的細(xì)菌微生物組進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)鯉魚腸道細(xì)菌群落組成復(fù)雜多樣，前腸和中腸的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成較為相似，與后腸細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性差異顯著。這將為進(jìn)一步開展有關(guān)鯉魚腸道菌群的研究提供理論依據(jù)。