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    改良QuEChERS法與LC-MS/MS聯(lián)用測定水產(chǎn)品中13種農(nóng)藥殘留

    2019-12-03 03:27:50李麗春劉書貴馬麗莎鄭光明
    中國食品學(xué)報(bào) 2019年11期
    關(guān)鍵詞:甲酸水產(chǎn)品乙腈

    尹 怡 趙 城 余 權(quán) 李麗春 劉書貴 單 奇 馬麗莎 鄭光明*

    (1 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室(廣州)/農(nóng)業(yè)部休閑漁業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣州510380 2 廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所 廣州510030

    我國是水產(chǎn)品生產(chǎn)大國,連續(xù)多年我國水產(chǎn)品生產(chǎn)總量居世界首位。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃發(fā)展,養(yǎng)殖水產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留問題日益突出,已成為社會(huì)關(guān)注的食品安全熱點(diǎn)問題之一。水產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留通常來源于兩個(gè)方面:一是養(yǎng)殖過程施用藥物來防治水產(chǎn)品的疫病和蟲害,二是在環(huán)境施用的農(nóng)藥隨雨水沖淋流入養(yǎng)殖水體。大部分農(nóng)藥具有親脂性特點(diǎn),養(yǎng)殖水體中的農(nóng)藥被水產(chǎn)品富集并通過食物鏈蓄積。為保護(hù)人類健康,各國政府加強(qiáng)了水產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留的監(jiān)控,制定了嚴(yán)格的最高殘留限量。例如:日本政府制定的肯定列表制度中大部分農(nóng)藥的限量值為0.01 mg/kg。建立水產(chǎn)品中靈敏、可靠、多組分農(nóng)藥殘留同時(shí)檢測的技術(shù)十分必要。

    多組分農(nóng)藥殘留分析一般采用氣相色譜(GC)[1-2]、液相色譜(LC)[3]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)[4-7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)[8-11]和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)[12-14]等。前處理過程多采用均質(zhì)振蕩[4,9]、加速溶劑萃?。ˋSE)[1-2]等技術(shù)提取,凝膠滲透色譜(GPC)[1-2,6-7]、固相萃取(SPE)[10]等技術(shù)凈化。分散固相萃取法(QuECh-ERS)具有快速、簡易、低價(jià)等特點(diǎn),在蔬菜、水果的農(nóng)藥多殘留檢測中應(yīng)用廣泛[9-11]。近年來也用于測定動(dòng)物源性食品中的農(nóng)藥殘留[6-8]。QuEChERS方法在排除樣品基質(zhì)干擾和多殘留分析方面具有顯著優(yōu)勢,乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、C18和石墨化炭黑(GCB)等填料及其組合能有效去除基質(zhì)干擾,然而這些填料普遍存在價(jià)格高、用量大等缺點(diǎn),不利于推廣和應(yīng)用。發(fā)展價(jià)格低廉、快速高效、凈化效果優(yōu)越的改良吸附劑的QuEChERS 方法顯得尤為重要。聚苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)是一種重要的人工合成材料,具有比表面積大,剛性強(qiáng),耐酸堿,耐高溫,使用壽命長及非特異性吸附低等特點(diǎn),目前尚未見在QuEChERS 技術(shù)中應(yīng)用。本文對QuEChERS 方法進(jìn)行改良,選擇體積分?jǐn)?shù)1%的乙酸-乙腈溶液為提取溶劑,PS-DVB 和PSA 為QuEChERS 分散吸附劑,采用LC-MS/MS測定,建立水產(chǎn)品中氯嘧磺隆、異丙草胺、嘧菌酯、咪酰胺、烯酰嗎啉、甲磺隆、三唑酮、噻嗪酮、唑螨酯、烯唑醇、多菌靈、噻菌靈和抑霉唑等13 種農(nóng)藥的分析方法。

    1 材料與方法

    1.1 主要儀器與設(shè)備

    API4000 三重四級桿質(zhì)譜儀,美國AB 公司;1200 型高效液相色譜儀,美國Agilent 公司;旋渦混勻器,德國IKA 公司;超純水機(jī),美國Millipore公司;TDL-5-A 型離心機(jī),上海安亭公司;N-EVAP 24 型氮吹儀,美國Organomation 公司;振蕩器,德國IKA 公司。

    1.2 主要材料與試劑

    乙腈、甲醇和甲酸為色譜純,德國Merck 公司;PSA,天津Agela 公司;PS-DVB,蘇州賽分公司;氯嘧磺隆、異丙草胺、嘧菌酯、咪酰胺、烯酰嗎啉、甲磺隆、三唑酮、噻嗪酮、唑螨酯、烯唑醇、多菌靈、噻菌靈和抑霉唑等13 種標(biāo)準(zhǔn)品,德國Dr.Ehrenstorfer 公司;無水醋酸鈉和無水硫酸鎂(分析純),廣州化學(xué)試劑廠。

    1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

    分別準(zhǔn)確稱取適量的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),用甲醇溶解并定容,配得質(zhì)量濃度約為1 000 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,于-20 ℃以下保存,保存期6 個(gè)月。

    準(zhǔn)確移取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于棕色容量瓶中,用甲醇稀釋定容配制10 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液,于-20 ℃以下保存,保存期1 個(gè)月。準(zhǔn)確移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液,加入空白樣品提取液,配成系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,4℃避光保存,保存期1 周。

    1.4 試驗(yàn)條件

    1.4.1 色譜條件 色譜柱:ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm,50 mm×2.1 mm);流動(dòng)相:A 為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸-水溶液,B 為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸-乙腈溶液;流速:0.30 mL/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:10 μL,梯度洗脫程序見表1。

    表1 梯度洗脫程序Table 1 Program of gradient elution

    1.4.2 質(zhì)譜條件 電離方式:電噴霧電離ESI+;采集模式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);氣簾氣:276 kPa;碰撞氣:中等;離子源溫度:500 ℃;Gas1 壓力:276 kPa;Gas2 壓力:414 kPa;離子噴霧電壓:5 000 V。其它參數(shù)見表2。

    表2 質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Optimized ESI MRM-MS instrument parameters

    (續(xù)表2)

    1.5 樣品處理

    準(zhǔn)確稱?。?±0.05)g 已絞碎混勻的水產(chǎn)肌肉組織于50 mL 具塞離心管中,加入20 mL 1%(體積分?jǐn)?shù))乙酸-乙腈溶液,并加入1 g 無水醋酸鈉和1 g 無水硫酸鎂,渦旋混勻2 min,水平振蕩提取10 min,5 000 r/min 離心5 min。

    將上清液移入含800 mg PS-DVB 和200 mg PSA 填料的50 mL 具塞離心管中,旋渦混合2 min,取10 mL 上清液于15 mL 離心管中,40 ℃水浴氮吹濃縮至近干。殘留物用1.0 mL 流動(dòng)相溶解,渦旋混合1 min 后,過0.22 μm 微孔濾膜,供LC-MS/MS 上機(jī)檢測。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 優(yōu)化的色譜條件

    研究了水、甲酸分別和乙腈、甲醇組合的流動(dòng)相體系對目標(biāo)物的峰形及信號強(qiáng)度的影響,結(jié)果表明,用體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸-乙腈溶液為流動(dòng)相時(shí),大部分目標(biāo)組分有較好的響應(yīng)且峰形尖銳對稱。其原因是:流動(dòng)相中加入適量的甲酸,不僅促進(jìn)目標(biāo)物的電離,提高離子化效率和靈敏度,還抑制目標(biāo)物與液相色譜柱固定相中硅羥基之間的作用,改善峰形,提高分離度。多殘留分析中流動(dòng)相基本為梯度洗脫,為保證梯度變化過程中酸的濃度和離子化氛圍穩(wěn)定,采用體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液作為流動(dòng)相。采用LCMS/MS 分析13 種農(nóng)藥,MRM 譜圖見圖1。

    2.2 提取溶劑

    農(nóng)藥常用的提取溶劑為甲醇、丙酮和乙腈等溶劑,部分化合物需要加酸調(diào)節(jié)提取溶劑的pH值。為了保證提取效率,根據(jù)目標(biāo)組分的化學(xué)性質(zhì),分別采用甲醇、乙腈、1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸-甲醇溶液、1%(體積分?jǐn)?shù)) 乙酸-甲醇溶液、1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸-乙腈溶液和1%(體積分?jǐn)?shù))乙酸-乙腈溶液為提取溶劑,得到使用不同溶劑時(shí)13 種目標(biāo)組分在加標(biāo)蝦肉中的回收率。采用甲醇為提取溶劑時(shí),提取效率在30%~70%之間,可能是由于甲醇極性較強(qiáng),鹽析效果不佳。采用乙腈為提取溶劑時(shí),目標(biāo)組分有較好的溶解性,無機(jī)鹽的加入使乙腈與水相分層,提高提取效率。同時(shí),乙腈具有沉淀蛋白的作用,可大大減小雜質(zhì)的影響。甲酸的酸性比乙酸強(qiáng),部分農(nóng)藥在使用1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸-乙腈溶液提取時(shí)回收率較低,而1%(體積分?jǐn)?shù)) 乙酸-乙腈溶液在13 種目標(biāo)組分的平均回收率在70%~120%之間。最終選擇1%(體積分?jǐn)?shù))乙酸-乙腈溶液作為13 種農(nóng)藥的提取溶劑。

    圖1 13 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM 譜圖Fig.1 MRM chromatograms of the 13 pesticide standards

    2.3 凈化過程的優(yōu)化

    水產(chǎn)樣品含有大量的蛋白、脂肪和色素,這些雜質(zhì)在提取過程中隨目標(biāo)物一起被提取出來,產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng),影響檢測結(jié)果。QuEChERS 方法中常用的吸附凈化劑有PSA、C18及GCB。PSA 用于去除脂類和糖類物質(zhì),C18可去除油脂及弱極性雜質(zhì),GCB 可去除色素。PS-DVB 在QuEChERS 方法中的應(yīng)用報(bào)道較少。其具有高容量、穩(wěn)定的機(jī)械強(qiáng)度,與C18對比具有更強(qiáng)的吸附性能,且PSDVB 價(jià)格低廉,僅為傳統(tǒng)吸附劑的1/5~1/3。

    試驗(yàn)對比PSA、C18及PS-DVB 作為吸附凈化劑的凈化效果??疾爝@3 種吸附凈化劑對13 種目標(biāo)組分的吸附情況,在相同濃度的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別加入100 mg 的3 種吸附劑,旋渦混合1 min,過0.22 μm 微孔濾膜后測定。結(jié)果表明:C18對部分農(nóng)藥的吸附作用較強(qiáng),回收率小于40%;而PSA 與PS-DVB 對大多數(shù)目標(biāo)組分吸附較少,可作為凈化劑進(jìn)一步優(yōu)化。本試驗(yàn)嘗試將PS-DVB 與PSA 作為混合吸附凈化劑,發(fā)現(xiàn)PSDVB 的加入可以改善對蝦樣品中的基質(zhì)效應(yīng)。以ME=Slopi/Slop0 評價(jià)基質(zhì)效應(yīng),ME 為基質(zhì)效應(yīng),Slopi 為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率,Slope0 為純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線的斜率[16]。由表3可知,加入PS-DVB后,氯嘧磺隆、異丙草胺、咪酰胺、烯酰嗎啉、三唑酮、噻嗪酮、多菌靈、噻菌靈和抑霉唑等9 種化合物的基質(zhì)減弱效應(yīng)得到改善。同時(shí)考察了PSDVB 用量(200,400,800 mg 和1 000 mg)對目標(biāo)物回收率的影響,結(jié)果表明,采用200 mg PSA 與800 mg PS-DVB 為凈化劑組合時(shí),基質(zhì)效應(yīng)較小,回收率最佳。

    2.4 方法的線性范圍、定量限、準(zhǔn)確度和精密度

    配制13 種農(nóng)藥的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,質(zhì)量濃度為1,5,20,50 和100 μg/L,進(jìn)樣10 μL。以各農(nóng)藥的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo),定量離子的峰面積(Y)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并做線性回歸分析,結(jié)果顯示:13 種農(nóng)藥在1~100 μg/L 范圍有較好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)>0.99。

    在空白樣品中添加13 種農(nóng)藥,信噪比(S/N)為3 時(shí)計(jì)算最低檢出限(LOD);S/N 為10 時(shí)計(jì)算最低定量限 (LOQ),13 種待測組分的LOD 在0.15~0.75 μg/kg,LOQ 在0.50~2.50 μg/kg,見表3。

    用不含13 種農(nóng)藥的羅非魚與對蝦樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn),樣品前處理過程同1.5節(jié)的步驟。在樣品中分別添加5,20 μg/kg 和50 μg/kg 3 個(gè)含量水平,每個(gè)水平做5 次重復(fù)試驗(yàn),13 種農(nóng)藥的回收率在75%~120%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為6.8%~15.0%,準(zhǔn)確率和精密度均符合殘留檢測的要求。

    表3 13 種化合物在對蝦基質(zhì)中的方法確證數(shù)據(jù)(n=5)Table 3 Methodology validation of 13 pesticides in shrimp(n=5)

    2.5 實(shí)際樣品測定及風(fēng)險(xiǎn)評估

    采用本方法對市售的30 份水產(chǎn)品 (4 份羅非、2 份草魚、2 份鯽魚、2 份生魚、2 份鯪魚和18份對蝦)進(jìn)行測定,結(jié)果在其中的2 份蝦肉中檢出嘧菌酯,含量分別為58.4 μg/kg 和38.6 μg/kg。

    嘧菌酯屬于甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑,最初用于谷物,現(xiàn)廣泛用于農(nóng)作物,具有預(yù)防和治療作用。中國、美國與歐盟僅對多種農(nóng)作物中的嘧菌酯進(jìn)行限量要求,而日本肯定列表中規(guī)定魚肉中的殘留限量為0.08 mg/kg,未對蝦進(jìn)行規(guī)定。嘧菌酯的日允許攝入量(ADI)值為0.2 mg/kg bw,根據(jù)消費(fèi)預(yù)測,2015年城鎮(zhèn)居民人均年水產(chǎn)品消費(fèi)量為19.34 kg[15],人均日消費(fèi)量為53 g。假定60 kg 的成年人食用上述陽性對蝦,嘧菌酯的日攝入量=人均日消費(fèi)量 殘留量/體重=0.052 μg/kg bw,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于ADI 值。

    3 結(jié)論

    本研究建立了水產(chǎn)品中13 種農(nóng)藥殘留的改良QuEChERS/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (LC-MS/MS)檢測方法,方法回收率為75%~120%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15%。本方法簡單、靈敏、快速且價(jià)格低廉,適用于水產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的定性、定量分析。

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