高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定銀菊清肝解毒顆粒中綠原酸和迷迭香酸含量

肖 健，劉旺培，陳華龍 △

（1.粵北人民醫(yī)院，廣東 韶關(guān) 512026； 2.廣東省韶關(guān)市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 韶關(guān) 512028）

銀菊清肝解毒顆粒由金銀花、夏枯草、桑葉、菊花4味藥材組方，具有清肝明目，疏風(fēng)散熱，除濕、痹，解瘡毒，功效用于治療感冒風(fēng)熱、目赤頭痛、高血壓、咽喉腫痛、疔瘡腫毒等。金銀花和夏枯草為主藥，綠原酸和迷迭香酸分別為金銀花和夏枯草的主要成分。綠原酸具有廣譜抗菌、抗病毒、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫及解毒抗炎作用［1-2］；迷迭香酸具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎活性和免疫抑制活性、抗血栓等作用［3-5］。目前，銀菊清肝解毒顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中未見含量測(cè)定方法，國(guó)內(nèi)已有文獻(xiàn)記載金銀花和夏枯草或其制劑中的綠原酸和迷迭香酸的含量測(cè)定方法［6-14］；2015 年版《中國(guó)藥典（一部）》金銀花和夏枯草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)已分別制訂了綠原酸和迷迭香酸的含量測(cè)定方法［15］。本研究中采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定銀菊清肝解毒顆粒中綠原酸和迷迭香酸的含量，對(duì)處方中金銀花和夏枯草以綠原酸和迷迭香酸計(jì)的含量進(jìn)行研究，為更好地監(jiān)控和評(píng)價(jià)銀菊清肝解毒顆粒的質(zhì)量提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1200型高效液相色譜儀（包括G1311A四元梯度泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，G1314B VWD紫外檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫公司）；XSE205型電子天平（瑞士梅特勒公司）；HT-300BQ型數(shù)控超聲波清洗器（濟(jì)寧恒通超聲電子設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥

綠原酸對(duì)照品（批號(hào)為110753-201817，含量為96.8% ），迷迭香酸對(duì)照品（批號(hào)為 111871-201706，含量為90.5%），均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；銀菊清肝解毒顆粒（粵北人民醫(yī)院自制，批號(hào)分別為171030，180620，181106）；乙腈（色譜純，美國(guó) TIDDI公司，批號(hào)為17090576）；磷酸（分析純，廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)為20171101）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：菲羅門 Luna? C18（2）100A 柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.4%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～12 min、12%A，12.1～25 min、30%A，25.1～35 min、12%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液制備

混合對(duì)照品溶液：分別取綠原酸、迷迭香酸對(duì)照品適量，加50%甲醇制成每1 mL含0.106 67 mg綠原酸、0.051 4 mg迷迭香酸的混合對(duì)照品溶液。

供試品溶液：取銀菊清肝解毒顆粒研細(xì)，精密稱取細(xì)粉約2g，置燒杯中，加甲醇50mL，超聲（功率為150W，頻率為50 kHz）處理10 min，靜置，上清液過(guò)濾；藥渣加甲醇20 mL，超聲處理10 min，靜置，過(guò)濾，合并濾液，濾液置水浴中揮干，殘?jiān)?0%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，即得。

陰性樣品溶液：按處方和制備工藝要求分別制作缺金銀花和缺夏枯草的陰性樣品，按供試品溶液制備方法分別制備缺金銀花和缺夏枯草的陰性樣品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：分別吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，對(duì)系統(tǒng)適用參數(shù)進(jìn)行考察，綠原酸、迷迭香酸色譜峰的保留時(shí)間分別為10.14 min和22.12 min；2個(gè)色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，綠原酸、迷迭香酸色譜峰的理論板數(shù)分別為10 963和384 181。色譜圖見圖1。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)高效液相色譜圖

陰性干擾試驗(yàn)：金銀花中含有綠原酸、木犀草苷等成分，夏枯草中含有迷迭香酸、咖啡酸等成分。分別取缺金銀花和缺夏枯草的陰性樣品溶液，按擬訂色譜條件，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果陰性樣品溶液色譜圖中未出現(xiàn)綠原酸、迷迭香酸色譜峰，表明處方中的其他成分對(duì)綠原酸、迷迭香酸的檢測(cè)無(wú)干擾。色譜圖見圖2。

圖2 陰性對(duì)照試驗(yàn)高效液相色譜圖

線性范圍考察：分別精密吸取混合對(duì)照品溶液適量，加 50% 甲醇稀釋 100，50，10，5，1 倍，分別精密吸取上述溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以質(zhì)量濃度（）為橫坐標(biāo)，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，綠原酸、迷迭香酸的回歸方程分別為Y綠=60.568 70綠-14.109 61，r=0.999 9；Y迷=61.275 07迷+4.257 22，r=0.999 9。結(jié)果表明，綠原酸、迷迭香酸質(zhì)量濃度分別在1.0667～106.6700μg/mL和 0.514 0 ～ 51.400 0 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

最低檢測(cè)限考察：將混合對(duì)照品溶液逐步稀釋后，分別精密量取20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以信噪比（S/N）=3考察最低檢測(cè)限。結(jié)果綠原酸、迷迭香酸的最低檢測(cè)限分別為0.2133μg/mL和0.1028μg/mL。

精密度試驗(yàn)：取混合對(duì)照品溶液，精密量取20 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果綠原酸、迷迭香酸峰面積的RSD分別為0.33%和0.52%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同批樣品（批號(hào)為171030）6份，依法制備供試品溶液，照含量測(cè)定項(xiàng)方法進(jìn)樣測(cè)定，分別計(jì)算含量。結(jié)果，綠原酸、迷迭香酸含量的RSD分別為1.12%和1.31%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，置室溫下，分別于0，2，4，6，10，12，24 h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果綠原酸、迷迭香酸峰面積的RSD分別為 0.82% 和 1.22% （n=7），表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品約1.0 g，精密稱定，置50mL容量瓶中，分別加入對(duì)照品溶液適量，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.4 樣品含量測(cè)定

分別取3批樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以外標(biāo)法對(duì)峰面積定量，代入線性回歸方程，計(jì)算綠原酸、迷迭香酸的含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 提取方法選擇

銀菊清肝解毒顆粒不僅含金銀花、夏枯草、桑葉、菊花4味藥材，還含較多的糖和淀粉。本研究中采用甲醇作為提取溶劑，即有效除去糖、淀粉等大量雜質(zhì)，又保證了目標(biāo)成分綠原酸和迷迭香酸能有效溶出。殘?jiān)?0%甲醇溶解可有效去除綠原酸和迷迭香酸色譜峰的溶劑效應(yīng)，使綠原酸峰和迷迭香酸峰更好地與相鄰雜質(zhì)分離，測(cè)量結(jié)果更準(zhǔn)確。

3.2 流動(dòng)相選擇

迷迭香酸與綠原酸的極性相差較大，迷迭香酸的極性較小，當(dāng)流動(dòng)相中有機(jī)相比例較小時(shí)，迷迭香酸將不能被洗脫出來(lái)；當(dāng)流動(dòng)相中有機(jī)相比例較大時(shí)，綠原酸峰出峰太早，難與雜質(zhì)分離。經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，本研究中以乙腈-0.4%磷酸溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，既保證迷迭香酸能被洗脫出來(lái)且分離度良好，又保證綠原酸能與相鄰雜質(zhì)分開。

3.3 小結(jié)

采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定銀菊清肝解毒顆粒中綠原酸和迷迭香酸的含量，簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可提高銀菊清肝解毒顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為其質(zhì)量監(jiān)控提供參考。