碘甘油微生物限度檢查方法的建立

李 軍 ，蔡 虎 ，曹寒梅 ，何 晴 ，馬曉娟 ，薛瑞坤

（1.陜西省藥品技術(shù)審核查驗(yàn)中心，陜西 西安 710065； 2.陜西省醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，陜西 咸陽(yáng) 712046；3.陜西浩瀚管理技術(shù)咨詢有限公司，陜西 西安 710065； 4.陜西盛德泰林生物安全技術(shù)檢測(cè)有限公司，陜西西安 710077）

碘甘油是由碘、甘油、薄荷腦和水機(jī)碘化鉀等組成。其中，碘可與微生物的蛋白質(zhì)結(jié)合并使其變性，同時(shí)可氧化細(xì)胞胞漿的活性酶，抑制微生物的正常代謝和生長(zhǎng)繁殖，具有廣譜抑菌性，對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒、芽孢等微生物及一些原蟲(chóng)有較強(qiáng)的殺滅作用［1-2］。碘甘油具有很好的抑菌防腐作用，能有效促進(jìn)潰瘍面愈合，適應(yīng)證為用于口腔黏膜潰瘍、牙齦炎及冠周炎，味微甜且無(wú)異味，患兒易接受，是兒童口腔科常規(guī)用藥［1，3］，也可用于子宮頸糜爛、耳真菌病及預(yù)防褥瘡等［4］。本研究中根據(jù)2015年版《中國(guó)藥典（四部）》通則1105、1106非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查方法，建立了碘甘油的微生物限度檢查方法?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HFsafe-1800TEⅡ型B2生物安全柜（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；LDZX-80KCS型壓力蒸汽滅菌器，LDZX-30KCS型壓力蒸汽滅菌器，均購(gòu)自上海申安醫(yī)療器械廠；BSD-TX345型臺(tái)式恒溫振蕩器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；XY500JC型電子天平（常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司）；HH-系列電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；MJ 250FI型霉菌培養(yǎng)箱，LRH-250F型生化培養(yǎng)箱，均購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；VORTEX-5型渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；Midi Plus移液器（德國(guó)賽多利斯公司）；FC752型薄膜過(guò)濾器（杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥

碘甘油（規(guī)格為1%，每瓶20 mL，批號(hào)為170302，某制藥公司）；氯化鈉（天津市百世化工有限公司，批號(hào)為 20150309）。

1.3 菌種

銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa〔CMCC（B）10104〕，金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus〔CMCC（B）26003〕，枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis〔CMCC（B）63501〕，白色念珠菌Candida albicans〔CMCC（F）98001〕，黑曲霉Aspergillus niger〔CMCC（F）98003〕，大腸埃希菌Escherichia coli〔CMCC（B）44102〕，均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，工作用菌株為第3代［5］。

1.4 培養(yǎng)基及試劑

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)為1702042），胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號(hào)為1703102），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)為1704064），沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（批號(hào)為 150914），pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液（批號(hào)為1702242），蛋白胨培養(yǎng)基（批號(hào)為170208），麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)為161213），甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)為160112），麥康凱液體培養(yǎng)基（批號(hào)為1612222），溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)為170103），均由北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司提供，培養(yǎng)基適用性檢查均符合2015年版《中國(guó)藥典》要求。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備

在生物安全柜中操作，將銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌置50 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，于30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h；將白色念珠菌接種至50 mL沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，于20～25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d；上述新鮮培養(yǎng)物用無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液稀釋成適宜濃度的菌懸液，等待接種。將黑曲霉接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基斜面上，于20～25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d或直至產(chǎn)生豐富的孢子［6］，加入少量含0.05%（L/L）聚山梨酯80的無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液，洗脫孢子，也可借助無(wú)菌長(zhǎng)柄棉簽輕輕擦拭孢子，收集孢子懸液［7］；用含 0.05% （L/L）聚山梨酯80的無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液將黑曲霉稀釋成適宜濃度的孢子懸液，等待接種。

2.2 供試液制備

取供試品10 mL，加入pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液至100 mL，45℃恒溫振蕩15 min，制成1∶10的供試液 A。取1∶10供試液 A 20 mL，加入 80 mL pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液，混勻，制成1∶50的供試液B。

2.3 微生物計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

1）平皿法。試驗(yàn)組：取2.2項(xiàng)下供試液A，B分別置5個(gè)無(wú)菌試管中，每管裝量9.9 mL，再分別加入2.1項(xiàng)下稀釋好的含菌量為103～104cfu/mL的銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉試驗(yàn)菌液0.1 mL；供試品對(duì)照組：取稀釋好的供試液，以稀釋液代替菌液，同試驗(yàn)組操作；菌液對(duì)照組：取相應(yīng)稀釋液替代供試液，同試驗(yàn)組操作。上述制備好的試驗(yàn)組、供試品對(duì)照組及菌液對(duì)照組各吸取1 mL，分別置直徑為90 mm的無(wú)菌平皿中，其中加了銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的試驗(yàn)組、菌液組及供試品對(duì)照組注入溫度不超過(guò)45℃熔化的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基約20 mL；加了白色念珠菌、黑曲霉的試驗(yàn)組、菌液組及供試品對(duì)照組注入不超過(guò)45℃熔化的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基約 20 mL［8-9］。

2）薄膜過(guò)濾法。取 2.2項(xiàng)下供試液 A 1 mL，置含100 mL 0.1%蛋白胨水溶液濾器中，薄膜過(guò)濾，用0.1%蛋白胨水溶液沖洗3次，每次100 mL。在最后1次沖洗液中分別加入不大于100 cfu/mL的銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉試驗(yàn)菌液各1 mL。制備好的濾膜，菌面朝上，貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上［5-6］；同時(shí)，制備供試品對(duì)照組和菌液對(duì)照組［8-9］。

以上各組每株菌平行制備2皿，混勻，凝固，將胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基于30～35℃倒置培養(yǎng)2～3 d，將沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基于25℃霉菌培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3～5 d，計(jì)算各組的平均菌落數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表1至表3。結(jié)果比值=（試驗(yàn)組菌落數(shù)-供試品對(duì)照組菌落數(shù)）÷菌液對(duì)照組菌落數(shù)，比值在 0.5 ～2.0 范圍內(nèi)［10］，即說(shuō)明供試品的需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)的方法適用性試驗(yàn)通過(guò)［5］。

表1 需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法的回收結(jié)果

2.4 控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)

2.4.1 大腸埃希菌

試驗(yàn)組：取2.2項(xiàng)下供試液A 10 mL接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，同時(shí)接入含菌量不大于100 cfu的大腸埃希菌試驗(yàn)菌液1 mL，混勻，35℃培養(yǎng)18 h。取上述培養(yǎng)物1 mL接種至100 mL麥康凱液體培養(yǎng)基中，42℃培養(yǎng)24 h［11］。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，35℃培養(yǎng)18 h。陽(yáng)性對(duì)照組：用稀釋液代替供試液，按試驗(yàn)組方法操作加入試驗(yàn)菌液，所用培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件與試驗(yàn)組一致。陰性對(duì)照組：用稀釋液代替供試液，不加試驗(yàn)菌，其他操作同試驗(yàn)組［12-14］。結(jié)果見(jiàn)表 4。

表2 需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法的回收結(jié)果

表3 霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)方法的回收結(jié)果

表4 控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

2.4.2 金黃色葡萄球菌

試驗(yàn)組：取2.2項(xiàng)下供試液A 10 mL接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，同時(shí)接入含菌量不大于100 cfu的金黃色葡萄球菌試驗(yàn)菌液1 mL，混勻，35℃培養(yǎng)18 h。取上述培養(yǎng)物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上，35℃培養(yǎng) 18 h［5］。陽(yáng)性對(duì)照組：用稀釋液代替供試液，按試驗(yàn)組方法操作加入試驗(yàn)菌液，所用培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件與試驗(yàn)組一致。陰性對(duì)照組：用稀釋液代替供試液，不加試驗(yàn)菌，其他操作同試驗(yàn)組［14］。結(jié)果見(jiàn)表4。

2.4.3 銅綠假單胞菌

試驗(yàn)組：取2.2項(xiàng)下供試液A 10 mL接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，同時(shí)接入含菌量不大于100 cfu的銅綠假單胞菌試驗(yàn)菌液1mL，混勻，35℃培養(yǎng)18h。取上述培養(yǎng)物劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上，35℃培養(yǎng) 18 h［5］。陽(yáng)性對(duì)照組：用稀釋液代替供試液，按試驗(yàn)組方法操作加入試驗(yàn)菌液，所用培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件與試驗(yàn)組一致。陰性對(duì)照組：用稀釋液代替供試液，不加試驗(yàn)菌，其他操作同試驗(yàn)組［14-15］。結(jié)果見(jiàn)表4。

計(jì)算試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值與菌液對(duì)照組菌落數(shù)的比值。由表1和表3可知，采用稀釋（1∶50）時(shí)，枯草芽孢桿菌試驗(yàn)菌的回收比值達(dá)到1.0；需氧菌銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉試驗(yàn)菌在常規(guī)法（1 ∶10）和稀釋法（1 ∶50）的試驗(yàn)中，回收比值均為0，霉菌和酵母菌在常規(guī)法（1∶10）的試驗(yàn)中，回收比值均為0，說(shuō)明不可采用1∶10，1∶20，1∶50供試液1 mL傾注平皿（直徑為90 mm）進(jìn)行該供試品的需氧菌總數(shù)及霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)。由表2和表3可知，當(dāng)薄膜過(guò)濾法的沖洗量為300 mL時(shí)，可使銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉的回收比值均達(dá)到0.9，可消除碘甘油的抑制作用，表明可采用該方法作為需氧菌總數(shù)及霉菌和酵母菌的計(jì)數(shù)方法。由表4可知，采用常規(guī)法，即可檢出3種陽(yáng)性試驗(yàn)菌，且陰性對(duì)照試驗(yàn)無(wú)菌生長(zhǎng)，說(shuō)明可采用該方法作為控制菌大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌檢查的方法。

3 討論

碘甘油中的甘油在制劑中除了有助溶、矯味、增稠多種作用外，還有抗菌防腐作用。碘除作治療藥和其他方面的用途外，在碘甘油藥劑中主要用作殺菌消毒劑和抑菌防腐劑，所以碘甘油對(duì)銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉都有一定抑菌作用［16-17］。通過(guò)稀釋法（1 ∶50）也不能完全消除對(duì) 5 種菌的抑制，采用薄膜過(guò)濾法可高效地消除碘甘油的抑菌性。故對(duì)于碘甘油的微生物限度檢查，首先建立方法適用性試驗(yàn)時(shí)應(yīng)消除碘甘油中的抑菌作用，以免出現(xiàn)假陰性。消除制劑的抑菌性，一般的試驗(yàn)順序是稀釋法、含中和劑的稀釋法、薄膜過(guò)濾法、含中和劑的薄膜過(guò)濾法。在進(jìn)行控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)時(shí)，為消除制劑的抑菌效力，可通過(guò)增大培養(yǎng)基體積，添加中和劑及薄膜過(guò)濾的方法來(lái)探索［18］。在試驗(yàn)探索過(guò)程中，應(yīng)首先注意制劑的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)，如碘甘油霉菌和酵母菌總數(shù)的限度標(biāo)準(zhǔn)為10 cfu/mL，在選擇稀釋法時(shí)，最大稀釋級(jí)只能為1∶10。