補中益氣丸（水丸）的中藥指紋圖譜研究

張永昕 ，李莎恩 ，段付軍 ，張 瑩 ，陳 雋 ，王振華

（1.中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院，廣東 廣州 510602； 2.廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣東 廣州 510006）

補中益氣丸由金元時期李東垣所創(chuàng)，載于《脾胃論》，由黃芪、黨參、白術、甘草、當歸、陳皮、升麻和柴胡組方［1］。具有補中益氣、調理脾胃、升陽舉陷的功效，是臨床常用的益氣健脾代表方，適宜于脾胃虛弱、中氣下陷所引起的疾病。目前，市場上補中益氣丸產品較多，由于藥味較多，缺乏統(tǒng)一、規(guī)范的制作標準，造成質量參差不齊，又缺乏統(tǒng)一的質量評價標準。中藥指紋圖譜是一種可量化的鑒定手段，通過對指紋圖譜的整體特征與已知數(shù)據(jù)進行比對，可對其作出宏觀分析，對辨別真?zhèn)斡兄笇б饬x［2-6］。本研究中利用化學計量學知識，選取12批不同批次的補中益氣丸（水丸），考察其6種主要指標成分，利用高效液相色譜（HPLC）法對這些成分的指紋圖譜信息進行采集和分析，建立一種能科學、準確地控制補中益氣丸（水丸）質量的研究方法，為其品質的優(yōu)劣評定及質量控制提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

儀器：LPG-3400SDN型液相系統(tǒng)（Thermo公司）；U300型高效液相色譜儀（賽默飛公司）；BSA224S型分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；U系列純水機（Aquapro公司）；JJ1000型電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；FQ3200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-SⅡ-N14B型電熱恒溫水溶鍋（北京精科華瑞儀器有限公司）；DHG-9145A型電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；FZ-230型家用萬能粉碎機（溫嶺市牧嶼百樂機床廠）。

試藥：補中益氣丸（水丸，北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，規(guī)格為每袋 6 g，批號分別為13061479，14080835，14082972，15071479，15080026，15080047，15081358，15082109，15082417，15082679，15111047，16080747，編號為 S1～S12）；橙皮苷、甘草苷、阿魏酸、異阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草酸銨對照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，純度均為98.00% ，批號分別為 C-006-150318-4，G-009-141110，A-002-140727，Y-044-140801，M-020-150130-1，G-003-150314）；乙腈、甲醇（色譜純，美國霍尼韋爾國際公司）；水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

取干燥至恒重的毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、甘草苷、異阿魏酸、橙皮苷、甘草酸銨對照品，以甲醇溶液分別配制成質量濃度分別為 0.728 6，1.000 0，1.040 0，1.040 0，0.400 0，1.000 0 g/L 的對照品貯備液。分別精密量取上述對照品貯備液 50，15，150，150，3 000，570μL，置10mL容量瓶中混勻，加甲醇溶液并定容，得混合對照品溶液。稱取充分研磨后的粉末狀各批樣品2.00g，加100mL 100%甲醇溶液，在具塞錐形瓶中充分混勻，準確稱定，記錄各樣品質量，超聲（功率為250 W，頻率為40 kHz）30min，前后進行2次，放冷，稱定質量，補足減失的質量，搖勻，經0.22μm微孔濾膜濾過，將續(xù)濾液轉移至100mL容量瓶中，定容，充分搖勻，得供試品溶液。根據(jù)處方量及其生產工藝，分別取去除陳皮、當歸和升麻、甘草、黃芪的4組藥品約4 g，精密稱定，按供試品溶液制備方法，分別制得橙皮苷、阿魏酸和異阿魏酸、甘草苷和甘草酸銨、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的4組陰性對照品溶液。

2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Diamosil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-3%乙腈的0.1%磷酸鹽水溶液（B），梯度洗脫（見表 1）；流速：0.8mL/min；檢測波長：270nm，柱溫：30℃；進樣量：10μL。在此色譜條件下的色譜圖見圖1。

表1 流動相梯度洗脫程序

圖1 系統(tǒng)適用性試驗高效液相色譜圖

2.3 方法學考察

專屬性試驗：取混合對照品溶液、供試品溶液和各陰性對照品溶液，注入高效液相色譜儀檢測，進樣量為10 μL，結果各成分陰性對照品溶液相應保留時間處無顯著吸收峰，表明專屬性良好，色譜圖見圖2。

圖2 專屬性試驗高效液相色譜圖

線性關系考察：精密吸取2.1項下混合對照品溶液各 3，5，8，10，14，17，20 μL，按擬訂色譜條件進樣測定。結果見表2。

精密度試驗：取樣品（批號為15080026）適量，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件依次進樣測定6次，每次進樣10 μL，以橙皮苷為參照峰，指定其峰值為1.000 0，記錄6種指標成分的相對峰面積。結果的RSD分別為 0.682 2% ，2.026 0% ，1.146 0% ，0.170 5% ，0%，1.284 7%（n=6），表明儀器精密度良好。

圖3 12批樣品的高效液相色譜疊加指紋圖譜

表2 6種成分線性范圍及線性回歸方程（n=7）

穩(wěn)定性試驗：取同一批（批號為15080026）樣品，依法制備供試品溶液，分別于室溫下放置 0，4，8，12，18，24 h時按擬訂色譜條件進樣測定，每次進樣10 μL，以橙皮苷為參照峰，指定其峰值為1.000 0，記錄6種指標成分的相對峰面積，結果的RSD分別為0.920 0%，2.071 5% ，2.637 2% ，1.823 6% ，0% ，0.952 5% ，表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩(wěn)定。

重復性試驗：精密稱取樣品（批號為15080026）2.0g，共5份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件依次進樣測定6次，每次進樣10 μL，以橙皮苷為參照峰，指定其峰值為1.0000，記錄6種指標成分的相對峰面積，結果的RSD在0～0.990 1%之間，表明該方法重復性良好。

2.4 指紋圖譜生成與共有峰的相關性和相似度分析

HPLC指紋圖譜的生成：取12批樣品，依法進行處理及提取，選取10 μL供試品溶液，按優(yōu)化的色譜條件進樣檢測。采用中藥指紋圖譜相似度軟件2012年版《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》，導入數(shù)據(jù)，分析得到相同廠家不同批次樣品的指紋圖譜匹配圖。詳見圖3。

共有峰確證及相關性分析：采用上述方法分別處理12批次樣品，得到相應的指紋圖譜，作為其指紋圖譜共有模式，并依據(jù)供試品溶液檢測圖譜中的檢測結果，標定出19個峰形較好、穩(wěn)定出現(xiàn)的共有峰，成功構建該批次補中益氣丸（水丸）的指紋圖譜共有模式。詳見圖4。

圖4 12批補中益氣丸（水丸）指紋圖譜的共有模式圖譜

指紋圖譜參照峰選擇：在對照指紋圖譜及供試品溶液檢測圖譜中，各色譜圖記錄有100多個峰，由于各樣品間的對比和描述較困難，選擇圖4中7號峰（峰面積較大、出峰時間適中且穩(wěn)定），經對照，鑒定為橙皮苷，故選為參照峰。

相對保留時間（RRT）和相對峰面積（RPA）：19個共有峰中，以7號峰為參照，其保留時間和峰面積均為1.000 0，計算各共有峰的RRT及 RPA，結果見表3和表4。各共有峰相對保留時間的RSD均小于1.32%，相對峰面積的RSD均小于4.98%，表明12批樣品差異較小。

表3 12批補中益氣丸（水丸）特征圖譜共有峰的相對保留時間

2.5 特征指紋圖譜相似度分析

采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)研究版（2004 A）軟件，分別以12批樣品的HPLC指紋圖譜作對照，對其整體相似度進行評價，以橙皮苷為參照峰，其保留時間和峰面積均為1.000，計算其他共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，12批樣品的相似度分 別 為 0.960，0.981，0.977，0.960，0.950，0.977，0.977，0.977，0.951，0.978，0.968，0.963，相似度平均值為0.968，12批補中益氣丸（水丸）的指紋圖譜相似度均在0.95以上，說明補中益氣丸（水丸）各批次間差異較小，質量穩(wěn)定性較好。

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)選

檢測波長選擇：補中益氣丸中有效的化學成分較多，主要成分為生物堿類、酚類、揮發(fā)油類，中藥中大部分吸收波長為254 nm，其他黃酮有機酸吸收波長多為230～360 nm，發(fā)現(xiàn)在 230，250，270，285 nm 波長下，各成分的吸收強度差異較大，經比對，在270 nm波長處基線平穩(wěn)，色譜峰信息較完全，故選擇其為檢測波長。

表4 12批補中益氣丸（水丸）特征圖譜共有峰的相對峰面積

色譜柱選擇：本研究選取2個不同品牌色譜柱對樣品進行測定，結果表明，通過Diamosil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）分離出的色譜峰之間分離度高，特征峰明顯且穩(wěn)定性好，故選擇其作為色譜柱［7］。

柱溫選擇：為了選擇分離效果適宜的柱溫條件，確保指紋圖譜的分離度和穩(wěn)定性良好，控制在不同柱溫下進行試驗。柱溫為25，27，30℃時，主要成分的色譜峰之間分離度及吸收強度均較好，柱溫為30℃時，阿魏酸色譜峰與雜峰分離度最好［8］。

流速選擇：分別采用流速為1.0mL/min和0.8mL/min進行試驗，結果表明，當流速為0.8mL/min時主成分的色譜峰與周圍各峰的分離更明顯。

3.2 樣品溶液制備方法優(yōu)選

曾采用薄層色譜法考察不同提取溶劑的分離效果，甲醇的效果優(yōu)于乙醇，故選用甲醇；為了考察不同溶劑濃度下的分離效果，采用70%甲醇溶液和100%甲醇回流提取2種方法，通過對比所生成的2組圖譜，結果表明，100%甲醇回流提取效率較高，特征峰面積總和較大，各特征峰分離度較好，故被選定。

指紋圖譜能表征組方中藥味較多、成分復雜的中藥制劑的整體信息，在中藥質量的評價中應用較多。補中益氣丸方中藥味較多且成分復雜，本研究中選擇其中具有代表性的6種指標成分進行考察，選擇12個不同批次的樣品丸劑，通過試驗驗證并建立了HPLC的分析方法，證實了該廠家該藥物質量符合要求，為進一步對補中益氣丸進行產品質量評估，從整體上有效且穩(wěn)定地控制生產質量，以及建立一個快速、有效的評價中藥成方制劑的質量控制方法打下基礎，更需要合理修改一些現(xiàn)行的中藥成方制劑的質量評價標準，能對藥品質量的控制更加準確、穩(wěn)定和嚴格，滿足臨床對有效性和安全性的需求［9-13］。所建立的補中益氣丸（水丸）的中藥指紋圖譜為中藥質量控制提供了理論依據(jù)，同時初步建立了補中益氣丸（水丸）的HPLC指紋圖譜，為加強對補中益氣丸（水丸）這類經典中藥名方內在質量控制的摸索提供一種較全面的分析手段。