白及主要活性成分Militarine對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的安全性評(píng)價(jià)*

陳 浩，劉 慧，鄭 林，李月婷，李勇軍，鞏仔鵬，黃 勇，劉麗娜

（貴州醫(yī)科大學(xué)·貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550004）

白及為蘭科植物白及Bletilla striata（Thunb.）Reiehb.f.的干燥塊莖，又名連及草、紫蘭等，最早見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，1963年后收藏于各個(gè)版本的《中藥藥典》，野生品主產(chǎn)于貴州、四川等地［1］。白及具有收斂止血、消腫生肌之功效，臨床主治咯血、吐血、肺結(jié)核咳血、外傷出血、潰瘍疼痛、湯火灼傷、皮膚皸裂和瘡瘍腫毒等，療效顯著［2］。Militarine為白及中含量較高的活性成分，在白及藥材中的含量為 1.45% ～ 3.32%［3］。Mili-tarine能改善慢性腦缺血大鼠的認(rèn)知功能障礙，減輕腦白質(zhì)缺血性損傷，舒張血管［4］。模式生物斑馬魚近年來(lái)成為藥物評(píng)價(jià)和毒性篩選的首選模型［5-6］。作為一種脊椎動(dòng)物模型，斑馬魚與人類基因相似度高達(dá)87%［7-8］，且具有完整的組織器官，其胚胎及幼魚對(duì)大多數(shù)藥物的反應(yīng)與人類臨床反應(yīng)相似［9-10］。斑馬魚胚胎在母體外發(fā)育，發(fā)育時(shí)間短，數(shù)量大，早期胚胎透明，可直接在顯微鏡下觀察各組織臟器的形態(tài)變化及血液流動(dòng)情況，能極大地彌補(bǔ)體內(nèi)試驗(yàn)與體外試驗(yàn)之間的間隙［11］。本研究中選擇以斑馬魚胚胎為模型，研究白及主要活性成分Militarine對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的毒性作用，為Militarine的創(chuàng)新藥物研發(fā)、臨床安全用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

儀器：奧林巴斯CX41RF型電子顯微鏡（奧林巴斯株式會(huì)社）；DH6000BⅡ型電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；AE240電子天平（十萬(wàn)分之一，梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；超純水機(jī)（四川沃特爾科技發(fā)展有限公司）；超聲波清洗器（功率為250W，頻率為27～34 kHz，北京醫(yī)療設(shè)備二廠）；微量移液器（德國(guó)Eppendorf股份公司）。

試藥與動(dòng)物：Militarine對(duì)照品（批號(hào)為ps171128-04，含量≥98%，成都普思生物科技股份有限公司）；德國(guó)Tubingen野生型斑馬魚胚胎，由貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院斑馬魚平臺(tái)提供。

1.2 方法

1.2.1 溶液制備

Militarine貯備液：稱取Militarine適量，溶于斑馬魚培養(yǎng)液（0.06 g/L海鹽、亞甲基藍(lán)）中，超聲溶解，配成5 g/L的貯備液，置4℃冰箱中儲(chǔ)存。

Militarine樣品溶液：根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，用培養(yǎng)液將貯備液稀釋至 0.025，0.050，0.100，0.200，0.400，0.800，1.600，3.200 g/L，作為 Militarine溶液組。

Militarine樣品溶液處理斑馬魚胚胎：除去未受精卵、糞便、死胎等雜物，置28℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育至受精后6 h，選取正常發(fā)育的胚胎，轉(zhuǎn)入含有2.5 mL不同質(zhì)量濃度（0.025，0.050，0.100，0.200，0.400，0.800，1.600，3.200 g/L）的 Militarine 溶液（12 孔板），每孔分別放入24枚受精卵，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)置3個(gè)平行組且設(shè)空白對(duì)照組。將挑選好的胚胎放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h更換1次溶液，試驗(yàn)過程中應(yīng)及時(shí)將死亡的胚胎挑出，以防對(duì)其余胚胎產(chǎn)生影響。

1.2.2 檢測(cè)指標(biāo)

Militarine對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的影響：以斑馬魚胚胎培養(yǎng)液中發(fā)育的胚胎為空白對(duì)照組，通過電子顯微鏡分別于 24，48，72，96，144 受精后小時(shí)（hpf）時(shí)間點(diǎn)觀察各胚胎的形態(tài)變化與發(fā)育情況，并詳細(xì)記錄，統(tǒng)計(jì)不同時(shí)間終點(diǎn)的死亡數(shù)、畸形數(shù)，并拍照記錄狀態(tài)。

斑馬魚胚胎 48 hpf心率［12］：記錄 48 hpf胚胎 10 s內(nèi)心率，每一質(zhì)量濃度下隨機(jī)取6枚胚胎進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

斑馬魚胚胎孵化率［12］：分別選擇 48，72，96 hpf統(tǒng)計(jì)胚胎的孵化率。統(tǒng)計(jì)應(yīng)用Militarine后斑馬魚胚胎的孵化率。孵化率（%）=每孔已孵化胚胎/每孔總胚胎個(gè)數(shù)×100%。

斑馬魚死亡率和畸形率［13］：分別于 72，96，144 hpf時(shí)統(tǒng)計(jì)胚胎的畸形和死亡情況。畸形率（%）=（畸形數(shù)+死亡數(shù)）/胚胎總數(shù)×100%，死亡率（% ）=死亡數(shù)/胚胎總數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。試驗(yàn)結(jié)果用表示，組間采用單因素方差分析比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的影響

6 hpf開始用含不同質(zhì)量濃度的Militarine溶液孵育斑馬魚胚胎后，觀察了24～144 hpf期間5個(gè)時(shí)間點(diǎn)不同質(zhì)量濃度Militarine溶液組及空白對(duì)照組斑馬魚胚胎不同發(fā)育階段的形態(tài)變化。Militarine各組斑馬魚胚胎出現(xiàn)不同程度的畸形。同一時(shí)間點(diǎn)，劑量越大畸形情況越嚴(yán)重；同一濃度下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)畸形情況越嚴(yán)重?；沃饕憩F(xiàn)為心包囊水腫、尾部和脊柱彎曲、卵黃囊水腫及色素沉積、頭部和眼部發(fā)育不良。Militarine對(duì)斑馬魚胚胎72 hpf形態(tài)發(fā)育的影響見圖1。

圖1 Militarine對(duì)斑馬魚胚胎72 hpf形態(tài)發(fā)育的影響

2.2 對(duì)斑馬魚胚胎檢測(cè)指標(biāo)的影響

結(jié)果見表1。隨著溶液濃度的增加，斑馬魚胚胎的尾部自主抽動(dòng)次數(shù)越少，在Militarine質(zhì)量濃度為3.2 g/L組中，斑馬魚胚胎未出現(xiàn)尾部自主抽動(dòng)情況。隨著質(zhì)量濃度的增加，斑馬魚胚胎的心率變緩。

表1 Militarine對(duì)斑馬魚胚胎檢測(cè)指標(biāo)的影響（ ± s，n=6）

表1 Militarine對(duì)斑馬魚胚胎檢測(cè)指標(biāo)的影響（ ± s，n=6）

注：與空白對(duì)照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。表 2同。

質(zhì)量濃度（g/L）0（空白對(duì)照組）0.025 0.050 0.100 0.200 0.400 0.800 1.600 3.200 24 hpf尾部自主抽動(dòng)次數(shù)（次/分）14.67±1.21 14.00 ±0.89 13.17±1.17 12.33 ±0.82 11.00 ±1.41*9.50±0.55**9.17 ±1.17**5.67±1.03**0.00±0.00**48 hpf心率（次 /10 s）13.67±0.52 12.67 ±1.03 12.00±1.41 9.17 ±0.75**8.67 ±0.52**8.00±0.89**7.67 ±1.03**7.33±0.82**5.67±1.03**48 hpf 5.56±2.44 9.72 ±2.41 13.89±2.41*26.39±6.37**34.72 ±4.81**26.39±2.41**22.22±6.37**12.50±4.17 6.94±2.40孵化率（%）72 hpf 62.50±4.17 63.89 ±8.67 72.22±6.37*76.39 ±2.41**80.56 ±6.36**75.00±4.17*69.44 ±6.36 61.11±4.81 51.39±2.41*96 hpf 98.61±2.41 97.22 ±2.41 94.44±6.36 97.22±2.41 91.67 ±4.17 83.33±8.33**79.17±4.17**75.00±8.33**65.28±6.36**

2.3 對(duì)斑馬魚胚胎不同時(shí)間段死亡率和畸形率的影響結(jié)果見表2。

3 討論

斑馬魚早期胚胎透明，在顯微鏡下可清晰觀察整體動(dòng)物多個(gè)主要器官的發(fā)育情況［14］，具備整體評(píng)價(jià)藥效學(xué)及藥動(dòng)學(xué)、代謝活性等優(yōu)勢(shì)，斑馬魚生物模型便于檢測(cè)分析中藥毒性［15］。

本研究結(jié)果表明，在24 hpf前，Militarine溶液組胚胎發(fā)育在形態(tài)上與空白對(duì)照組比較無(wú)明顯差異，但隨著時(shí)間的推移，除質(zhì)量濃度為 0.025，0.050，0.100 g/L 外，其他質(zhì)量濃度組胚胎的尾部自主抽動(dòng)次數(shù)與空白對(duì)照組比較有明顯差異（P＜0.05）。自主抽動(dòng)是斑馬魚胚胎最初的運(yùn)動(dòng)特征，主要由脊柱運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元支配肌肉系統(tǒng)而發(fā)生［16］。隨著質(zhì)量濃度的增加，斑馬魚胚胎的尾部自主抽動(dòng)次數(shù)越少。在Militarine濃度3.2 g/L組中，斑馬魚胚胎未出現(xiàn)尾部自主抽動(dòng)情況，表明在24 hpf時(shí)Militarine對(duì)斑馬魚胚胎脊柱神經(jīng)系統(tǒng)或運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)造成了一定影響。

心臟是胚胎發(fā)育過程中最早發(fā)育并發(fā)揮功能的器官，心率是體現(xiàn)心臟功能的一個(gè)重要指標(biāo)，胚胎發(fā)育48 h后心率基本趨于穩(wěn)定［17-18］。故選擇在此時(shí)測(cè)定其心率。結(jié)果表明，Militarine能使斑馬魚胚胎的心率明顯降低，且質(zhì)量濃度越高，心率降低越明顯，說明高質(zhì)量濃度的Militarine溶液會(huì)對(duì)胚胎發(fā)育產(chǎn)生心臟毒性。

表2 Militarine對(duì)斑馬魚胚胎死亡率和畸形率的影響（ ± s，%，n=3）

表2 Militarine對(duì)斑馬魚胚胎死亡率和畸形率的影響（ ± s，%，n=3）

質(zhì)量濃度（g/L）0（空白對(duì)照組）0.025 0.050 0.100 0.200 0.400 0.800 1.600 3.200死亡率 畸形率72 hpf 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 5.56±2.40**9.72±2.41**23.64±4.81**37.50±4.17**63.89±4.81**73.61±8.76**96 hpf 0.00±0.00 0.00±0.00 8.33±4.17**13.89±2.41**25.00±4.17**38.89±4.81**59.72±2.41**83.22±7.22**100.00±0.00**144 hpf 0.00±0.00 0.00±0.00 11.11±2.41**16.67±4.17**30.56±2.41**65.28±4.81**98.61±2.41**100.00±0.00**100.00±0.00**72 hpf 0.00±0.00 6.94±2.40**13.89±2.41**26.42±4.84**48.61±2.41**59.72±6.37**100.00±0.00**100.00±0.00**100.00±0.00**96 hpf 0.00±0.00 34.72±2.41**50.00±4.17**63.89±6.36**77.78±2.41**81.94±6.36**100.00±0.00**100.00±0.00**100.00±0.00**144 hpf 0.00±0.00 52.78±6.37**75.00±4.17**88.89±2.41**100.00±0.00**100.00±0.00**100.00±0.00**100.00±0.00**100.00±0.00**

孵化率是斑馬魚胚胎毒性評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，48 hpf時(shí)，Militarine各質(zhì)量濃度組能促進(jìn)胚胎出膜；72 hpf時(shí)，0.050，0.100，0.200，0.400 g/L 質(zhì)量濃度能促進(jìn)斑馬魚胚胎出膜，3.2 g/L質(zhì)量濃度能抑制斑馬魚胚胎出膜；96 hpf時(shí)，0.400，0.800，1.600，3.200 g/L質(zhì)量濃度能抑制斑馬魚胚胎出膜。給藥后，斑馬魚胚胎中質(zhì)量濃度出膜較快可能是由于胚胎神經(jīng)受到藥物的影響，產(chǎn)生興奮行為，較空白對(duì)照組出膜快，而高質(zhì)量濃度由于濃度過高，神經(jīng)由興奮變?yōu)橐种疲蚨霈F(xiàn)出膜延遲或不出膜現(xiàn)象［19］。

結(jié)果表明，在同一時(shí)間點(diǎn)，隨著給藥質(zhì)量濃度的增加（除 0.025 g/L 和 0.05 g/L 在 72 hpf時(shí)未出現(xiàn)死亡），斑馬魚胚胎的死亡率和畸形率逐漸增加，與空白對(duì)照組比較有顯著差異（P＜0.01）；在同一質(zhì)量濃度，隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)（除0.025 g/L未出現(xiàn)死亡），斑馬魚胚胎的死亡率和畸形率逐漸增加，與空白對(duì)照組比較具有顯著差異（P＜0.01）。1.600 g/L，3.200 g/L 的斑馬魚胚胎在72 hpf出現(xiàn)心包水腫、色素沉積，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)和濃度的增大，胚胎死亡率和畸形率呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，表明死亡和畸形情況與給藥時(shí)間和給藥濃度均相關(guān)。

綜上所述，Militarine溶液的濃度對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的毒性存在量效關(guān)系，其作用時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)胚胎發(fā)育毒性也存在明顯的劑量效應(yīng)，高濃度（1.600 g/L和3.200 g/L）Militarine溶液對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育影響顯著，主要表現(xiàn)在使神經(jīng)、系統(tǒng)損害、心臟組織發(fā)育異常，生理上的運(yùn)動(dòng)功能喪失。雖然斑馬魚胚胎及幼魚對(duì)大多數(shù)藥物反應(yīng)與人類臨床反應(yīng)相似［20］，通過該試驗(yàn)?zāi)転橐院笈R床用藥提供初步的數(shù)據(jù)參考，后續(xù)研究中將會(huì)用不同種屬的動(dòng)物對(duì)Militarine的安全性進(jìn)行全面的系統(tǒng)研究。