探索miRNA-155對(duì)急性髓系白血病患者預(yù)后影響及可能機(jī)制

沈 瑞，李杰平，展會(huì)恩，彭劍嬌，徐宏向，曾惠奇

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)是成人最常見的急性白血病。近年來，盡管靶向治療及干細(xì)胞移植等治療手段極大改善了患者的預(yù)后，但是還有近一半的患者不能獲得長期生存，其相關(guān)機(jī)制及治療靶點(diǎn)仍有待進(jìn)一步探索[1]。miRNA-155是一種功能廣泛的小核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)，可參與機(jī)體的免疫應(yīng)答、炎性反應(yīng)、細(xì)胞分化等生物過程，并與肝癌、乳腺癌、淋巴癌等多種癌癥的發(fā)生與進(jìn)展密切相關(guān)[2]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，miRNA-155在AML中亦呈高表達(dá)狀態(tài)[3]，但既往研究多著重于比較外周血中miRNA-155表達(dá)水平高低與臨床指標(biāo)的相關(guān)性，欠缺長期隨訪數(shù)據(jù)，潛在機(jī)制也尚未完全闡明。本研究擬借助公開的臨床數(shù)據(jù)庫—癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas, TCGA)和生物信息學(xué)手段分析miRNA-155表達(dá)水平對(duì)患者生存率的影響，以及miRNA-155調(diào)控AML的潛在分子機(jī)制，為AML的預(yù)防及治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 從包含TCGA數(shù)據(jù)網(wǎng)站(http://www.linkedomics.org)下載AML數(shù)據(jù)集TCGA_LAMLmiRNASeq、TCGA_LAMLRNAseq和TCGA_LAML Clinical，篩選出同時(shí)包含miRNA-155表達(dá)水平測定和完整臨床數(shù)據(jù)的病例共162例，按照miRNA-155表達(dá)水平由高到低排序，將排在前50%的81例設(shè)為高表達(dá)組，剩余81例設(shè)為低表達(dá)組，應(yīng)用GraphPad Prism軟件繪制兩組患者生存曲線。

1.2 方法 利用Omisc軟件，將上述患者的各RNA表達(dá)水平逐一與miRNA-155表達(dá)水平進(jìn)行Pearson相關(guān)性檢測，根據(jù)相關(guān)系數(shù)分別選取與miRNA-155正相關(guān)和負(fù)相關(guān)的前50個(gè)基因。將篩選出的100個(gè)相關(guān)基因?qū)隨tring在線數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org/)，進(jìn)行生物學(xué)注釋和分類，即完成基因本體(gene ontology, GO)富集分析(分為生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能三個(gè)類型板塊)和京都基因與基因組百科全書(the Kyoto encyclopedia of genes and genomes pathway, KEGG)通路富集分析，同時(shí)獲得相關(guān)基因所編碼的蛋白質(zhì)之間的相互作用，從而找出處于網(wǎng)絡(luò)核心的關(guān)鍵蛋白。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，生存時(shí)間的比較使用Gehan-Breslow-Wilcoxon分析，相關(guān)基因篩選采用Pearson相關(guān)性分析。P<0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組年齡、性別及種族比較 高表達(dá)組與低表達(dá)組在年齡[(53.99±17.25)歲vs(53.73±15.25)歲]、性別構(gòu)成(男性∶女性=42∶39vs37∶44)與種族構(gòu)成(白人∶黑人∶亞裔=41∶15∶25vs44∶11∶26)方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 miRNA-155表達(dá)水平差異對(duì)生存時(shí)間的影響 miRNA-155低表達(dá)組患者的中位生存時(shí)間長于miRNA-155高表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.045，圖1)。

圖1 miRNA-155對(duì)兩組急性髓系白血病患者生存率比較

2.3 miRNA-155相關(guān)基因篩選結(jié)果 在檢測的19，448個(gè)基因中，有2347個(gè)基因與miRNA-155存在相關(guān)性(P<0.05)。其中21號(hào)染色體開放閱讀框71(chromosome 21 open reading frame 71, C21orf71)和芳基烴受體核轉(zhuǎn)位樣蛋白2(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like protein 2, ARNTL2)與miRNA-155表達(dá)水平的正相關(guān)系數(shù)最高(分別是r=0.634，P<0.05和r=0.526，P<0.05，圖2A、B)；溶質(zhì)載體家族13成員5(solute carrier family 13 member 5, SLC13A5)和Ski樣蛋白(ski-like protein, SKIL)與miRNA-155表達(dá)水平的負(fù)相關(guān)系數(shù)最高(分別是r=-0.50，P<0.05和r=-0.48，P<0.05，圖2C、D)。

2.4 GO富集分析和KEGG通路富集分析 結(jié)果可見主要涉及的生物學(xué)過程包括DNA復(fù)制啟動(dòng)、DNA鏈延伸與DNA雙鏈展開，主要涉及的分子功能為解旋酶活性、作用于DNA的催化活性和DNA復(fù)制起始的結(jié)合，主要涉及的細(xì)胞組分為微染色體維持復(fù)合體、三級(jí)顆粒和富含纖維蛋白-1的顆粒膜，主要涉及的信號(hào)通路為DNA復(fù)制、細(xì)胞周期調(diào)控和基礎(chǔ)切除修復(fù)，見表1。

圖2 與miRNA-155相關(guān)基因的表達(dá)水平

A、B. 和miRNA-155正相關(guān)且相關(guān)系數(shù)最高的2個(gè)基因；C、D. 和miRNA-155負(fù)相關(guān)且相關(guān)系數(shù)最高的2個(gè)基因

表1 完成基因本體富集分析和KEGG通路富集分析

2.5 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) 相關(guān)基因編碼蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)見圖3，其中微小染色體維持蛋白(microchromosome maintenance proteins，MCM)基因家族是處于網(wǎng)絡(luò)核心的蛋白。

3 討 論

AML是血液系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，近年來隨著靶向治療新藥的應(yīng)用及干細(xì)胞移植的開展，極大改善了患者的預(yù)后，但治療復(fù)發(fā)性和難治性病例時(shí)，仍然缺少有效方法，大多數(shù)患者最終死于耐藥和復(fù)發(fā)[4]。miRNA是一類內(nèi)源性非編碼RNA，成熟miRNA可與靶mRNA的3′U TR或5′U TR互補(bǔ)結(jié)合，并導(dǎo)致mRNA降解或抑制mRNA翻譯，從而抑制基因表達(dá)[5]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA的失調(diào)對(duì)腫瘤的形成和進(jìn)展起著重要作用。其中miRNA-155在多種腫瘤的形成中扮演重要角色，例如在乳腺癌中，其過表達(dá)可使端粒重復(fù)序列結(jié)合蛋白1的表達(dá)受到抑制，導(dǎo)致端粒損傷，并影響細(xì)胞分裂[6]；在甲狀腺乳頭狀瘤中，其可通過激活Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤生長[7]。亦有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，miRNA-155與AML患者預(yù)后不良有關(guān)[8]，但缺少長期隨訪數(shù)據(jù)，且相關(guān)機(jī)制仍未完全闡明，miRNA-155能否作為一種提示AML遠(yuǎn)期預(yù)后的生物標(biāo)志物仍有待于進(jìn)一步探討。

圖3 相關(guān)基因編碼蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

TCGA數(shù)據(jù)庫是美國國家癌癥研究所和國家人類基因組研究所在2005年發(fā)起的一個(gè)項(xiàng)目，在過去的十余年里，TCGA收錄了加拿大和美國地區(qū)11 000多例腫瘤組織以及相匹配的正常組織，和約2.5 PB的高通量基因組測序結(jié)果，TCGA創(chuàng)建的基因組數(shù)據(jù)分析流程，可有效收集、選擇和分析組織基因組改變，并結(jié)合收錄患者的診斷和治療信息，為改進(jìn)癌癥預(yù)防、早期檢測和治療提供了強(qiáng)大的研究基礎(chǔ)[9]。本研究通過對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫中162例AML患者的隨訪數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，miRNA-155過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致遠(yuǎn)期生存率降低，但具體機(jī)制尚不明確。為此本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫中的基因檢測結(jié)果，篩選出與miRNA-155表達(dá)密切相關(guān)的基因，并進(jìn)行富集分析，以求挖掘出潛在機(jī)制。結(jié)果可見，C21orf71、ARNTL2、SLC13A5和SKIL與miRNA-155表達(dá)水平的相關(guān)性最為明顯。其中C21orf71位于21號(hào)染色體，戴海萍[10]的研究發(fā)現(xiàn)，在AML患者中可存在11、21號(hào)染色體發(fā)生相互易位，這可導(dǎo)致其與伙伴基因一起轉(zhuǎn)錄新的融合蛋白，干擾造血細(xì)胞調(diào)控，促使AML病情的進(jìn)展[11]。ARNTL2又名周期樣因子，在細(xì)胞的晝夜節(jié)律調(diào)解中發(fā)揮重要作用，晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)失常，可導(dǎo)致心血管疾病，癌癥，代謝綜合征和衰老等一系列疾病的發(fā)生[12]。SLC13A5是高親和力的鈉/檸檬酸協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，介導(dǎo)檸檬酸鹽進(jìn)入細(xì)胞，可以促進(jìn)循環(huán)檸檬酸鹽的利用，以產(chǎn)生能量和合成脂肪酸及膽固醇[13]。SKIL在響應(yīng)細(xì)胞外信號(hào)的細(xì)胞分裂或分化中具有調(diào)節(jié)作用，有研究表明SKIL基因突變可引起胰腺腫瘤的形成[14]。這也提示miRNA-155可能通過上述靶基因在AML的進(jìn)展中發(fā)揮作用。

GO富集分析結(jié)果與KEGG通路富集分析顯示，miRNA-155的相關(guān)靶基因所編碼的蛋白的功能多集中在細(xì)胞周期與DNA復(fù)制的全過程。蛋白網(wǎng)絡(luò)分析可見，MCM蛋白家族處于網(wǎng)絡(luò)的核心。MCM又稱為DNA復(fù)制許可因子，MCM蛋白的早期分級(jí)可產(chǎn)生多種多聚體復(fù)合物，其具有不同的生物學(xué)意義，例如MCM467復(fù)合物顯示具有體外解旋酶活性，其被MCM2亞基抑制。 MCM2-7六聚體在DNA復(fù)制起始和延伸中是必不可少的[15]。這也與miRNA-155靶基因的富集分析結(jié)果一致。

綜上所述，本研究基于miRNA-155從數(shù)據(jù)庫挖掘AML的潛在作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn) miRNA-155過表達(dá)與AML患者遠(yuǎn)期生存率降低有關(guān)，可能與其通過相關(guān)靶基因調(diào)節(jié)DNA的復(fù)制有關(guān)，這為 miRNA-155的臨床價(jià)值提供了生物信息學(xué)證據(jù)支持。