鹽酸氯吡格雷中基因毒性雜質檢測方法學研究

王敏

天津紅日藥業(yè)股份有限公司 天津 301700

1 儀器與試藥

1.1 儀器

安捷倫1200高效液相色譜儀，VWD檢測器。

1.2 試藥

對甲苯磺酸甲酯對照品，純度98%；對甲苯磺酸乙酯對照品，純度98%。上述對照品均為SIGMA-ALDRICH。色譜甲醇、色譜乙腈均為Fisher公司，試驗用水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為ACE 3C18柱（150×4.0mm，3μm）；流動相以0.02mol/L磷酸氫二鉀（磷酸調節(jié)PH至6.5）-乙腈=7:3為流動相A，乙腈：甲醇=2:1為流動相B，梯度洗脫（0～42min，100%A；42～45min，A100% → 29%；45～55min，29%A；55～75min，100%A）流速1.0ml/min；檢測波長225nm；柱溫30 ℃；進樣量100μl?？瞻兹軇?0%乙腈溶液。

2.2 溶液的制備

對照溶液的制備：精密稱取對甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯適量，用50%乙腈溶解并制成每ml含對甲苯磺酸甲酯、對甲苯磺酸乙酯各0.06μg的溶液。供試品溶液的制備：精密稱取樣品適量，用50%乙腈溶解并制成每ml含鹽酸氯吡格雷30mg的溶液。

2.3 檢測靈敏度

檢測限：精密稱取對甲苯磺酸甲酯、對甲苯磺酸乙酯各60mg同置100ml量瓶中，用50%乙腈溶解并定容至刻度；再精密移取0.1ml置100ml量瓶中，用50%乙腈定容至刻度，作為儲備液。取儲備液42μl置5ml量瓶中，用50%乙腈定容至刻度，作為對甲苯磺酸甲酯的檢測限溶液；取儲備液83μl置5ml量瓶中，用50%乙腈定容至刻度，作為對甲苯磺酸乙酯的檢測限溶液。分別精密量取上述檢測限溶液各100μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，色譜圖主峰峰高約為基線噪音的3倍。

結果表明，當供試品濃度為30mg/ml時（折算成進樣量為3mg），是對甲苯磺酸甲酯最低檢測濃度的約600萬倍，是對甲苯磺酸乙酯最低檢測濃度的約280萬倍，因此供試品中大于0.0002‰的雜質可被有效檢出，完全可以滿足檢測靈敏度的要求[1]。

定量限：取檢測限項下儲備液167μl置5ml量瓶中，用50%乙腈定容至刻度，作為對甲苯磺酸甲酯的定量限溶液；取檢測限項下儲備液250μl置5ml量瓶中，用50%乙腈定容至刻度，作為對甲苯磺酸乙酯的定量限溶液。

分別精密量取上述定量限溶液各100μl注入液相色譜儀，色譜圖主峰峰高約為基線噪音的10倍，對甲苯磺酸甲酯定量限為2.0ng，相當于樣品量0.0007‰；對甲苯磺酸乙酯定量限為3.2ng，相當于樣品量0.001‰。

精密量取上述定量限溶液各100μl，連續(xù)6次進樣，作為定量限精密度溶液，記錄色譜圖，考察連續(xù)進樣各次的樣品峰面積，計算RSD。結果顯示連續(xù)6針對甲苯磺酸甲酯峰面積RSD為5.2%，對甲苯磺酸乙酯峰面積RSD為3.5%，定量限精密度良好。

2.4 線性

精密稱取對甲苯磺酸甲酯、對甲苯磺酸乙酯各60m g同置100ml量瓶中，用50%乙腈溶解并定容至刻度；再精密移取0.1ml置100ml量瓶中，用50%乙腈定容至刻度，作為儲備液。取儲備液 250μl、335μl、400μl、500μl、600μl、750μl、1ml分 別 置 5ml量瓶中，用50%乙腈定容至刻度，制成一系列的線性溶液。取上述溶液各100μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標進行線性回歸，求出線性方程和相關系數(shù)。實驗結果表明：對甲苯磺酸甲酯濃度在0.03μg/ml～0.12μg/ml之間，線性方程y=337.8x+1.1484，R2=0.9994，峰面積與濃度呈良好線性關系。對甲苯磺酸乙酯濃度在0.03μg/ml～0.13μg/ml之間，線性方程y=346.75x-1.1931，R2=0.9994，峰面積與濃度呈良好線性關系。

2.5 系統(tǒng)適用性/重復性

精密稱取對甲苯磺酸甲酯、對甲苯磺酸乙酯各60m g同置100ml量瓶中，用50%乙腈溶解并定容至刻度；再精密移取0.1ml置100ml量瓶中，用50%乙腈定容至刻度，再取1ml置10ml量瓶中，用50%乙腈定容至刻度，制成系統(tǒng)適用性溶液。取上述溶液100μl連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，考察連續(xù)進樣各次的樣品峰面積，計算RSD。

實驗結果：系統(tǒng)適用性溶液連續(xù)6次進樣結果表明對甲苯磺酸甲酯6針峰面積RSD為2.1%、對甲苯磺酸乙酯6針峰面積RSD為2.3%，說明該方法系統(tǒng)適用性良好，且方法的重復性良好。

2.6 回收率

取鹽酸氯吡格雷及對甲苯磺酸甲酯、對甲苯磺酸乙酯對照品，均按限度濃度的80%、100%和120%進行加樣回收率試驗，每個濃度配制3份樣品。實驗結果表明：對甲苯磺酸甲酯的加樣回收率在84～96%之間，平均回收率為 90.5%，RSD=3.7%，對甲苯磺酸乙酯的加樣回收率在96～113%之間，平均回收率為104.7%，RSD=5.8%，回收率較好。

2.7 耐用性

分別考察了不同柱溫、不同檢測波長、不同流速、不同流動相PH對檢測結果的影響，結果如下：

正常條件：采用C18柱（150×4.0mm），以0.02mol/L磷酸氫二鉀（磷酸調節(jié)PH至6.5）-乙腈=7:3為流動相A，乙腈：甲醇=2:1為流動相B，檢測波長為225nm，柱溫30℃，流速1.0ml/min，進樣量100μl，采用梯度洗脫?？瞻兹軇?0%乙腈溶液。對照溶液的制備：精密稱取對甲苯磺酸甲酯、對甲苯磺酸乙酯適量，用50%乙腈溶解并制成每ml含對甲苯磺酸甲酯、對甲苯磺酸乙酯各0.06μg的溶液。供試品溶液的制備：精密稱取樣品適量，用50%乙腈溶解并制成每ml含鹽酸氯吡格雷30mg的溶液[2]。

不同檢測波長：將檢測波長變更為220nm和230nm，其余色譜條件同正常條件進行檢測。實驗結果表明檢測波長改變后，檢測結果無明顯變化，方法耐用性良好。

不同柱溫：將柱溫變更為25℃和35℃，其余色譜條件同正常條件進行檢測。實驗結果表明柱溫改變后，對甲苯磺酸甲酯及對甲苯磺酸乙酯的出峰時間有所變化，但對檢測結果無明顯影響，方法耐用性較好。

不同流速：將流速變更為0.9ml/min和1.1ml/min，其余色譜條件同正常條件進行檢測。實驗結果表明流速改變后，對甲苯磺酸甲酯及對甲苯磺酸乙酯的出峰時間有所變化，但對檢測結果無明顯影響，方法耐用性較好[3]。

不同流動相PH值：將流動相A的0.02mol/L磷酸氫二鉀分別用磷酸調節(jié)PH至6.4和6.6在與乙腈按7:3混合，其余色譜條件同正常條件進行檢測。實驗結果表明流動相PH改變后，對甲苯磺酸甲酯及對甲苯磺酸乙酯的出峰時間有所變化，但對檢測結果無明顯影響，方法耐用性較好。

3 結語

基因毒性物質是指能直接或間接損害DNA，導致基因突變或癌癥的物質。基因毒性物質對DNA的損害作用包括染色體斷裂、DNA重組、DNA復制過程中共價鍵結合或插入，也包括通過激活細胞產(chǎn)生基因毒性物質而產(chǎn)生的突變。近年來有關藥物中的基因毒性雜質的控制得到來自于藥物監(jiān)管部門與藥物研發(fā)機構的高度重視，基于風險管理的階段化TTC控制策略，使得基因毒性雜質的控制更趨科學合理。TTC概念的應用允許在無任何體內數(shù)據(jù)時，在足夠的安全性基礎上建立雜質控制限度。TTC概念的應用有利于患者、企業(yè)和監(jiān)管機構，使他們避免做不必要的毒理研究和安全性評估。歐洲藥典委員會認為一個產(chǎn)品在接受市場監(jiān)管的時候，應該對可能存在的基因毒性雜質進行評估，這是建立一個新產(chǎn)品各論的基本要求。磺酸酯作為一類較為常見的基因毒性雜質，可以通過對關鍵工藝參數(shù)的優(yōu)化與設計進行有效控制，符合當下“質量源于設計”的理念，即良好的工藝設計往往能促進高質量藥物的生產(chǎn)，并在充分保障藥物安全性的基礎上盡可能減少企業(yè)的研發(fā)投入及相應的政府監(jiān)管成本。