低氧運(yùn)動(dòng)與DNA甲基化的研究進(jìn)展

孟昶 朱磊 田雪文 王清路

摘 要：DNA甲基化調(diào)控基因的表達(dá)，在肥胖和2型糖尿病等代謝類(lèi)疾病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。針對(duì) DNA 甲基化檢測(cè)研究方法包括全基因組亞硫酸鹽測(cè)序（BS-seq）、甲基化 DNA 免疫共沉淀測(cè)序（Me DIP-seq）和亞硫酸氫鹽測(cè)序（RRBS）。研究表明低氧與EPAS1甲基化呈負(fù)相關(guān)，與LINE-1甲基化呈正相關(guān)，低氧運(yùn)動(dòng)可以使CpG和DMR甲基化顯著。綜述DNA甲基化分子機(jī)制及相關(guān)技術(shù)，探討低氧運(yùn)動(dòng)與DNA甲基化的分子機(jī)制及生理學(xué)意義，展望低氧運(yùn)動(dòng)與DNA甲基化的研究前景，為防治代謝類(lèi)疾病提供更多依據(jù)。

關(guān)鍵詞：低氧運(yùn)動(dòng);DNA甲基化;亞硫酸氫鹽測(cè)序

中圖分類(lèi)號(hào)：G804.7? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? 文章編號(hào)：1009-9840（2019）05-0066-04

Abstract：DNA methylation is one of the well-known epigenetic markers that regulate gene expression and play an important role in the pathogenesis of metabolic diseases such as obesity and type 2 diabetes. Methods for DNA methylation detection include genome-wide sulfite sequencing （BS-seq）， methylated DNA immunoprecipitation sequencing （Me DIP-seq）， and bisulfite sequencing （RRBS）. Studies have shown that hypoxia is negatively correlated with EPAS1 methylation and positively correlated with LINE-1 methylation. In this paper， we review the molecular mechanism and physiological significance of hypoxia and DNA methylation by reviewing the molecular mechanisms and related technologies of DNA methylation， and prospectively study the hypoxia movement and DNA methylation research， and provide more for the prevention and treatment of metabolic diseases.

Key words：hypoxic exercise;DNA methylation;RRBS

隨著社會(huì)的進(jìn)步，人民生活水平的提高，生活習(xí)慣和生活環(huán)境發(fā)生了翻天覆地的變化，伴隨而來(lái)的是肥胖、三高癥以及2型糖尿病等代謝類(lèi)疾病發(fā)病率不斷提高，并且患病人群具有年輕化趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人類(lèi)的健康。表觀遺傳學(xué)被認(rèn)為是基因表達(dá)的可遺傳變化，而不是由于DNA序列的任何改變[1]。表觀遺傳學(xué)的重要性在于對(duì)一些現(xiàn)象提供了部分的解釋?zhuān)@些現(xiàn)象單靠經(jīng)典遺傳學(xué)是無(wú)法解釋的，因此它已引起越來(lái)越多的關(guān)注[2]。DNA甲基化是最著名的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記之一，在基因表達(dá)修飾中起到不可忽視的作用。以往研究證實(shí)了低氧條件下對(duì)EPAS1甲基化呈負(fù)相關(guān)，與LINE-1甲基化呈正相關(guān)，而現(xiàn)階段初步研究發(fā)現(xiàn)，低氧運(yùn)動(dòng)與常氧運(yùn)動(dòng)相比甲基化升高或降低大于25%的單個(gè)CpG甲基化位點(diǎn)共計(jì)675 個(gè)，所有 CpG 平均甲基化，這很可能是調(diào)控肥胖等代謝性疾病的一種重要干預(yù)手段[3-4]。本文通過(guò)綜述DNA甲基化分子機(jī)制及相關(guān)技術(shù)，探討低氧運(yùn)動(dòng)與DNA甲基化的分子機(jī)制及生理學(xué)意義，展望研究前景，為運(yùn)動(dòng)有益于健康提供更多重要依據(jù)。

1 DNA甲基化

DNA甲基化是一種DNA化學(xué)修飾形式，是將甲基加入胞嘧啶或腺嘌呤的過(guò)程，還可以在不改變序列的情況下改變DNA分子活性。5-甲基胞嘧啶的甲基化在原核生物與真核生物中是廣泛存在的，它是一種非常重要的表觀遺傳修飾，可以調(diào)控基因的活性，影響基因組印跡、細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、染色質(zhì)重塑等一系列關(guān)鍵過(guò)程。通過(guò)基因組分析DNA甲基化對(duì)理解甲基化在正常生物學(xué)和代謝類(lèi)疾病中的影響至關(guān)重要。有研究表明，哺乳動(dòng)物基因組中有60%的CpG二核苷酸是甲基化的[5]。CpG二核苷酸通常存在于CpG中，通常是甲基化的基因啟動(dòng)子[6]。而近期在哺乳動(dòng)物基因組中發(fā)現(xiàn)5-羥甲基胞嘧啶、5-甲酰胞嘧啶、5-羧胞嘧啶等5-甲基胞嘧啶氧化衍生物，進(jìn)一步拓展了人們對(duì)甲基化調(diào)控的認(rèn)識(shí)[7]。

DNA甲基化是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶引發(fā)的。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶-1（DNMT1）優(yōu)先在半甲基化DNA位點(diǎn)進(jìn)行甲基化，并且在細(xì)胞復(fù)制過(guò)程中保持甲基化模式[8]。甲基轉(zhuǎn)移酶與DNA結(jié)合，從DNA螺旋中“翻轉(zhuǎn)”出胞嘧啶，并將來(lái)自S-腺苷甲硫氨酸的甲基連接到胞嘧啶的5'位置[9-10]。DNMT的N-末端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域包含蛋白質(zhì)與DNA相互作用，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用和核定位的基序。C末端區(qū)域含有限定酶活性位點(diǎn)的保守基序。DNMT3L的N-末端區(qū)域與DNMT3A和DNMT3B的N-末端區(qū)域具有相似性，但在其C-末端結(jié)構(gòu)域中缺乏催化活性位點(diǎn)[11]。DNA甲基化的特征是在胞嘧啶嘧啶環(huán)的C5位或腺嘌呤環(huán)的N6位上添加一個(gè)甲基。雖然DNA甲基化是在DNA的結(jié)構(gòu)被分解之前發(fā)現(xiàn)的，但對(duì)其在生物體中的多種功能的研究仍在繼續(xù)[12]。后者可以歸因于與DNA甲基化相關(guān)的過(guò)程的復(fù)雜性，以及DNA甲基化很難分析的事實(shí)[13]。一致地，DNA甲基化可以表示為表觀遺傳修飾，因?yàn)樗鼘⒉话贒NA序列本身中的相關(guān)信息傳遞給下一代。在人類(lèi)中，甲基化僅限于胞嘧啶殘基，主要存在于CpG中。這種二核苷酸在整個(gè)基因組中都沒(méi)有得到充分的表達(dá)，但是在0.33 kb的片段中，這種二核苷酸的表達(dá)率卻在增加，這就是所謂的CpG島[14]。約40%的人類(lèi)基因在啟動(dòng)子區(qū)中含有CpG島，其甲基化通常與沉默表達(dá)有關(guān)[15]。DNA甲基化是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）建立和維持的，DNMT3A和DNMT3B介導(dǎo)新的甲基化，DNMT1維持已建立的DNA甲基化。DNA甲基化在人類(lèi)中具有調(diào)控特定的基因[16]：1）特定基因的調(diào)控。2）基因組印記。3）X染色體失活。4）基因組防御。

2 DNA甲基化檢測(cè)技術(shù)

DNA甲基化檢測(cè)研究方法主要包括BS-seq、MeDIP-seq和RRBS三種技術(shù)，其中最經(jīng)濟(jì)有效的方法是RRBS技術(shù)。

2.1 BS-seq

BS-Seq是在單核苷酸分辨率下分析DNA胞嘧啶甲基化基因組的首選方法，被譽(yù)為是全基因組測(cè)序的“金標(biāo)準(zhǔn)”[17]。BS-Seq技術(shù)的基礎(chǔ)是亞硫酸氫鹽可將未甲基化的胞嘧啶脫胺成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶對(duì)治療具有耐藥性。通過(guò)對(duì)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的基因組DNA進(jìn)行深度測(cè)序，可以測(cè)量基因組中每個(gè)可映射胞嘧啶位置的甲基化水平[18]。BS-Seq是單核苷酸分辨率下甲基化狀態(tài)分析最有效的方法。由于Sanger測(cè)序和大多數(shù)第二代測(cè)序方法不能區(qū)分甲基化和非甲基化胞嘧啶，測(cè)序前需要亞硫酸氫鹽處理將非甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶。然而，像PacBio這樣的第三代測(cè)序能夠根據(jù)聚合酶遇到修飾堿基時(shí)的停頓時(shí)間來(lái)檢測(cè)DNA修飾，因此最終可能使BS-Seq方法過(guò)時(shí)[19]。

2.2 MeDIP-seq

MeDIP-seq技術(shù)由Weber于2005年首次提出[20]，這是基于抗體富集原理進(jìn)行的全基因組的甲基化檢測(cè)技術(shù)，該方法是將甲基化 DNA 免疫沉淀和高通量 DNA 測(cè)序技術(shù)相結(jié)合，即采用甲基化 DNA 免疫共沉淀技術(shù)，利用5′-甲基胞嘧啶抗體特異性富集基因組上已被甲基化的 DNA 片段，然后采用高通量測(cè)序，獲得基因組DNA甲基化發(fā)生區(qū)域及甲基化水平等[21]。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于精確度較高，覆蓋范圍廣，不需要較多的測(cè)序通量，并且成本較低，但只能確定一段DNA 區(qū)域的甲基化程度[22]。

2.3 RRBS

亞硫酸氫鹽處理DNA可使未甲基化的胞嘧啶脫氨成尿嘧啶，不受甲基化胞嘧啶的影響[23]，從而提供了一種甲基依賴的DNA突變，這種技術(shù)被稱(chēng)為亞硫酸氫鹽測(cè)序（RRBS）[24]。RRBS方法是在Rudolf Jaenisch的實(shí)驗(yàn)室中開(kāi)發(fā)的，由于其成本效益和基因組中CpG位點(diǎn)的相對(duì)高覆蓋率而變得流行[25]。該方法特別適用于細(xì)胞數(shù)量有限的樣品，如生殖細(xì)胞或卵母細(xì)胞。RRBS方法基于用MspI（5個(gè)CCGG識(shí)別位點(diǎn)）進(jìn)行DNA消化，然后進(jìn)行末端修復(fù)，接頭連接，DNA亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化和文庫(kù)擴(kuò)增。該方法提供了位于兩個(gè)MspI位點(diǎn)之間的DNA片段的信息，其距離350 bp，可以代表人類(lèi)基因組中大約82%的CpG島和大約70%的啟動(dòng)子。近年來(lái)，以12個(gè)細(xì)胞和單個(gè)細(xì)胞為起始材料，優(yōu)化了DNA甲基化組譜的還原表征RRBS方法，以研究胚胎發(fā)育過(guò)程中的甲基化組景觀[26]。然而，為了從DC或SC樣品中制備足夠數(shù)量的下一代測(cè)序文庫(kù)，進(jìn)行了過(guò)量的PCR擴(kuò)增（>40個(gè)循環(huán)），這可能導(dǎo)致大量的數(shù)據(jù)重復(fù)。由于RRBS的測(cè)序庫(kù)是基于酶消化的，酶消化可以從同一位置染色體的多個(gè)拷貝中產(chǎn)生相同的序列，因此沒(méi)有任何可用的策略可以區(qū)分這些序列是來(lái)自相同片段的不同拷貝還是來(lái)自PCR的重復(fù)誘導(dǎo)[27-28]。

3 低氧運(yùn)動(dòng)對(duì)DNA甲基化的影響

人類(lèi)已適應(yīng)高海拔生活的三個(gè)主要地理區(qū)域包括青藏高原、埃塞俄比亞高原和安第斯高原[29]。來(lái)自這些區(qū)域中的每個(gè)區(qū)域的人群對(duì)于低海拔人群和彼此相對(duì)地表現(xiàn)出獨(dú)特的循環(huán)、呼吸和血液適應(yīng)性。這些適應(yīng)性包括動(dòng)脈血氧飽和度、血紅蛋白濃度、靜息通氣和低氧通氣反應(yīng)等差異[30]。然而，單靠遺傳學(xué)并不能完全解釋所觀察到的低氧環(huán)境適應(yīng)性變異程度。在高海拔地區(qū)的生長(zhǎng)發(fā)育也被證明有助于高海拔地區(qū)的適應(yīng)性特征。

表觀遺傳調(diào)控與遺傳過(guò)程密切相關(guān)，使生物體為其生存的外部環(huán)境做好準(zhǔn)備，并有助于提供一種潛在的機(jī)制，使其能夠適應(yīng)不斷變化的環(huán)境條件[31-32]。DNA甲基化是理解最透徹、研究最廣泛的表觀遺傳修飾。這種修飾最常見(jiàn)的發(fā)生在胞嘧啶之后是鳥(niǎo)嘌呤，其排列方式稱(chēng)為胞嘧啶-磷酸鹽-鳥(niǎo)嘌呤（GpG）位點(diǎn)[33]。DNA甲基化是DNMT進(jìn)行的，它選擇性靶向特定的DNA序列，要么從頭開(kāi)始，要么維持甲基化[34-36]。內(nèi)皮PAS結(jié)構(gòu)域蛋白1（EPAS1）是一種缺氧激活基因，它在低氧條件下表達(dá)較高[37]，它的甲基化水平以前已經(jīng)被證明與結(jié)直腸癌有關(guān)，隨著甲基化的增加，EPAS1蛋白的表達(dá)降低?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)使得EPAS1成為研究高海拔適應(yīng)性表觀遺傳學(xué)的一個(gè)自然的先天候選。Ainash等人[17]分析了秘魯海拔4388米和海拔0米的572名克丘亞人的EPAS1啟動(dòng)子區(qū)和LINE-1重復(fù)元件的DNA甲基化。在高海拔地區(qū)招募的參與者EPAS1 DNA甲基化水平較低，而LINE-1甲基化水平較高。出生的海拔與較高的1系甲基化有關(guān)，而與EPAS1甲基化無(wú)關(guān)。生活在高海拔地區(qū)的年數(shù)與EPAS1甲基化呈負(fù)相關(guān)，與LINE-1甲基化呈正相關(guān)。發(fā)現(xiàn)了4個(gè)單碳代謝SNP（MTHFD1 rs2236225， TYMS rs502396， FOLH1 rs202676， GLDC rs10975681），它們累積解釋了平均LINE-1甲基化變異的11.29%。并確定了1號(hào)線甲基化和全基因組SNP主成分之間的關(guān)聯(lián)，當(dāng)前和終身暴露于高海拔缺氧環(huán)境中都會(huì)對(duì)EPAS1和LINE-1甲基化產(chǎn)生影響，這表明表觀遺傳修飾可能在高海拔適應(yīng)性中發(fā)揮作用。而田雪文博士詮釋了低氧運(yùn)動(dòng)與DNA甲基化之間的聯(lián)系，通過(guò)低氧運(yùn)動(dòng)和常氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練肥胖大鼠，從表觀遺傳學(xué)的角度，分析比較常氧運(yùn)動(dòng)肥胖大鼠和低氧運(yùn)動(dòng)肥胖大鼠Wnt/β-catenin信號(hào)通路 DNA甲基化的差異顯著基因。初步證實(shí)了低氧運(yùn)動(dòng)肥胖大鼠減脂和Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的關(guān)系。比較分析了常氧運(yùn)動(dòng)肥胖大鼠和低氧運(yùn)動(dòng)肥胖大鼠全基因組 DNA的CpG島發(fā)生甲基化的基因，具有213 個(gè) DMR 差異區(qū)域以及 675 個(gè)發(fā)生甲基化具有顯著差異性的基因。但是，目前低氧運(yùn)動(dòng)與DNA甲基化的研究還處于起步階段，其分子機(jī)制還不明確，還需進(jìn)一步研究。

4 小結(jié)

DNA甲基化是著名的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記之一，調(diào)控基因的表達(dá)，在肥胖和2型糖尿病等代謝類(lèi)疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。DNA 甲基化檢測(cè)研究方法主要包括BS-seq、MeDIP-seq和RRBS技術(shù)，其中最經(jīng)濟(jì)有效的方法是RRBS技術(shù)。目前初步證實(shí)低氧運(yùn)動(dòng)可以使CpG和DMR甲基化顯著，但是低氧運(yùn)動(dòng)與DNA甲基化的研究還處于起步階段，還需要進(jìn)一步研究探討其分子機(jī)制。深入研究低氧運(yùn)動(dòng)與 DNA 甲基化的關(guān)系，為防治代謝類(lèi)疾病提供更多依據(jù)。

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