MGMT基因甲基化狀態(tài)在結(jié)直腸鋸齒狀病變中的表達(dá)及意義

許春偉+王魯平++++葛暢

[摘要] 目的 觀察鋸齒狀病變組織中MGMT基因甲基化狀態(tài)和MGMT蛋白表達(dá)，探討臨床病理意義和在癌變通路中的作用，同時(shí)探討MGMT基因在不同年齡層段甲基化狀況。 方法 應(yīng)用Taqman探針qPCR（MethyLight）方法檢測(cè)北京軍區(qū)總醫(yī)院2007～2013年的225例鋸齒狀病變[包括96例增生性息肉（HP）、61例廣基（無(wú)蒂）鋸齒狀腺瘤/息肉（SSA/P）和68例傳統(tǒng)型鋸齒狀腺瘤（TSA）]、54例管狀腺瘤（TA）、69例結(jié)直腸癌（CRC）和42例正常結(jié)直腸黏膜組織中MGMT基因CpG島甲基化狀態(tài)，并通過(guò)測(cè)序法驗(yàn)證擴(kuò)增的目的片段甲基化狀態(tài)，同時(shí)應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)其中116例鋸齒狀病變（包括52例HP、41例SSA/P、23例TSA）、20例TA、24例CRC和24例正常結(jié)直腸黏膜組織中MGMT蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果 MGMT基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)和MGMT蛋白異常陽(yáng)性程度在鋸齒狀病變和對(duì)照組中差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），且兩者之間呈負(fù)相關(guān)；MGMT基因啟動(dòng)子甲基化頻率在不同年齡層段相關(guān)性比較中兩者呈正相關(guān)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 組織中MGMT基因甲基化可能誘導(dǎo)其蛋白表達(dá)下調(diào)的主要原因，在結(jié)直腸“增生性息肉-鋸齒狀腺瘤-癌”的鋸齒狀癌變通路中起重要作用。

[關(guān)鍵詞] DNA甲基化；MGMT基因；qPCR；DNA探針；鋸齒狀病變

[中圖分類(lèi)號(hào)] R735.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2014）01（b）-0011-06

Expression and significance of MGMT gene methylation status in colorectal serrated lesions

XU Chunwei WANG Luping▲ GE Chang

Department of Pathology， the Military General Hospital of Beijing PLA， Beijing 100700， China

[Abstract] Objective To discuss patients with serrated lesions tissues MGMT gene methylation status and MGMT protein expression and cancer pathways and the role and clinical significance of MGMT gene in different age paragraph methylation level. Methods From 2007 to 2013 in the Military General Hospital of Beijing PLA， 225 cases of serrated lesions [96 cases of hyperplastic polyp （HP）， 61 cases of sessile serrated adenoma/polyp （SSA/P） and 68 cases of traditional serrated adenoma （TSA）]， 54 cases of tubular adenoma （TA）， 69 cases of colorectal cancer （CRC） and 42 cases of normal colorectal mucosa tissues were selected； MGMT gene methylation status of CpG island was detected by qPCR applications Taqman probe （MethyLight） methods， methylation state of amplification target fragment was verified by by sequencing method， at the same time， MGMT protein expression in 116 cases of serrated lesions （including 52 cases of HP， 41 cases of SSA/P， 23 cases of TSA）， 20 cases of TA， 24 cases of CRC， 24 cases of normal colorectal mucosa tissue was detected by immunohistochemical method. Results The differences of MGMT gene promoter methylation state and degree of abnormal MGMT protein positive degree in the serrated lesions and the control group were statistically significant （P < 0.05）， the negative correlation was found； the positive correlation was found between frequency of MGMT gene promoter methylation and different age paragraph， but the difference was not statistically significant （P > 0.05）. Conclusion Organization MGMT gene methylation may induce the protein expression in the main reason for the downgrade， it plays an important role in serrated canceration pathway of hyperplastic polyps-serrated adenoma-carcinoma.

[Key words] DNA methylation； MGMT gene； qPCR； DNA probe； Serrated lesions

鋸齒狀病變是一組具有鋸齒狀（波浪狀或星狀）結(jié)構(gòu)的異質(zhì)性上皮病變，包括增生性息肉（hyperplastic polyp，HP）、廣基（無(wú)蒂）鋸齒狀腺瘤/息肉（sessile serrated adenoma/polyp，SSA/P）、傳統(tǒng)型鋸齒狀腺瘤（traditional serrated adenoma，TSA）。新近統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）中60%的來(lái)自普通腺瘤，35%來(lái)自“增生性息肉-鋸齒狀腺瘤-癌”這條鋸齒狀通路[1]，特別是鋸齒狀病變的CpG島甲基化表型（CpG island methylator phenotyp，CIMP）。鋸齒狀通路涉及一系列異常的表觀遺傳學(xué)修飾[2]。這些異常修飾中以DNA甲基化最常見(jiàn)。DNA異常甲基化分為A型和C型，前者與年齡因素有關(guān)，年齡越大，甲基化頻率越高，后者與腫瘤相關(guān)，通過(guò)引起相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)或沉默，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3]。

MGMT為DNA損傷修復(fù)基因，定位于人類(lèi)染色體10q26，全長(zhǎng)170 kb，由5個(gè)外顯子，4個(gè)內(nèi)含子組成。啟動(dòng)子富含GC堿基，順式作用元件有CpG島中的6個(gè)Spl位點(diǎn)、2個(gè)糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件（GRE），AP-I元件等。cDNA長(zhǎng)約769 bp，編碼207個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。MGMT序列具有相對(duì)穩(wěn)定性，從結(jié)腸桿菌到哺乳動(dòng)物均含有結(jié)構(gòu)一致的“-異亮氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-組氨酸-精氨酸-纈氨酸-”（IPCHRV）活性基序列，活性位點(diǎn)在145位半胱氨酸殘基上[4]。本研究通過(guò)MethyLight方法，一方面分析鋸齒狀病變中MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)和免疫組化中MGMT蛋白的表達(dá)情況，在基因?qū)用婧偷鞍讓用鎸?duì)MGMT進(jìn)行初步探究，另一方面分析鋸齒狀病變中MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)和年齡相關(guān)因素情況，在甲基化和年齡上對(duì)MGMT進(jìn)行初步探究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本 收集北京軍區(qū)總醫(yī)院2007～2013年病理診斷為各類(lèi)結(jié)直腸息肉和腺瘤切片4810例，從中篩選出腺體具有鋸齒狀特征的息肉及腺瘤，進(jìn)行組織學(xué)診斷及分類(lèi)。由3名病理醫(yī)師按WHO（2010）消化系統(tǒng)腫瘤分類(lèi)及文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)[5-9]4～5輪回顧性閱片。從中篩選出225例鋸齒狀病變（96例HP、61例SSA/P和68例TSA）作為實(shí)驗(yàn)組，并以54例管狀腺瘤（tubular adenoma，TA）、42例正常結(jié)直腸黏膜組織和69例CRC作為對(duì)照。

1.1.2 主要試劑和儀器 DNA提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司，甲基化修飾試劑盒為美國(guó)ZYMO公司產(chǎn)品，核酸蛋白質(zhì)濃度測(cè)量?jī)xB-500購(gòu)自上海創(chuàng)萌生物科技有限公司，甲基化陽(yáng)性/陰性對(duì)照為美國(guó)ZYMO公司產(chǎn)品，qPCR反應(yīng)試劑ROX購(gòu)自TaKaRa公司，Mix購(gòu)自上海輝睿生物科技有限公司，MGMT抗體購(gòu)自中杉金橋公司（1∶500稀釋?zhuān)?，?nèi)參基因β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）引物和探針參照文獻(xiàn)[10]設(shè)計(jì)，甲基化引物和探針由上海輝睿生物科技有限公司合成。Mx3000P定量PCR擴(kuò)增儀為美國(guó)Stratagene公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1 甲基化引物和探針設(shè)計(jì) MGMT基因序列參照GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov），GenBank Accession：NC_000010。甲基化引物和探針由Beacon Designer7.9軟件設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)：引物擴(kuò)增片段大小在80～150 bp范圍，引物長(zhǎng)度17～25 bp，GC含量在40%～70%，兩條引物的Tm值盡量接近。避免引物內(nèi)部或之間形成3 bp以上的互補(bǔ)序列。探針長(zhǎng)度20～30 bp，探針的Tm值比引物高5～10℃，探針內(nèi)標(biāo)或探針與引物之間避免形成3 bp以上的互補(bǔ)序列，對(duì)其進(jìn)行BLAST檢查，引物和探針?lè)弦螅⒂缮虾］x睿生物科技有限公司合成。見(jiàn)表1。

1.2.2 DNA提取 采用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit試劑盒提取組織DNA，將含有DNA組織的蠟塊連切5張10 μm的厚蠟?zāi)?，?yán)格按照試劑盒說(shuō)明步驟進(jìn)行操作。并測(cè)定其純度和濃度備用。

1.2.3 甲基化修飾 采用EZ DNA Methylation-GoldTM Kit（D5005）試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明步驟進(jìn)行操作。經(jīng)此步后，DNA序列中未甲基化的胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぃ║）。

1.2.4 MethyLight PCR反應(yīng)體系（20 μL）：2×Taq PCR Master Mix 10 μL；修飾后的DNA模板2 μL；上、下游引物各1 μL（10 pmol）；探針FAM 0.4 μL（10 pmol）；ROX 0.3 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，56℃ 45 s，72℃ 45 s，共50個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃冷卻5 min。每例標(biāo)本設(shè)兩個(gè)復(fù)孔，經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾的Human Methylated & Non-methylated DNA Set作為陽(yáng)性、陰性對(duì)照，水為空白對(duì)照。

1.2.5 測(cè)序法驗(yàn)證擴(kuò)增序列 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送北京金唯智生物科技有限公司測(cè)序，由于擴(kuò)增序列（94 bp）過(guò)小，連接到質(zhì)粒作為載體后，用通用引物的方法測(cè)序，結(jié)果如圖1所示，測(cè)序目的片段和Beacon Designer 7.9軟件設(shè)計(jì)序列吻合。

甲基化片段中CpG二核苷酸的胞嘧啶保持不變

圖1 MGMT基因擴(kuò)增片段部分測(cè)序圖

1.2.6 免疫組織化學(xué)染色 所有標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，60℃溫箱烘烤90 min。采用EnVision二步法，實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，高溫高壓抗原修復(fù)，DAB顯色，磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗為陰性對(duì)照，已知陽(yáng)性的結(jié)腸腺體組織為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.7 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) MethyLight結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)[11]：同時(shí)擴(kuò)增目的基因（MGMT）和內(nèi)參基因（β-actin），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到兩者的原始拷貝數(shù)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)甲基化指數(shù)（normalized index of methylation，NIM）其定義為：NIM=[（MGMT sample/MGMT positive）β-actin sample/β-actin positive）]×100，其中MGMT sample指樣本中甲基化MGMT基因的拷貝數(shù)，MGMT positive指陽(yáng)性對(duì)照中甲基化MGMT基因的拷貝數(shù)，β-actin sample和β-actin positve與上述相同。NIM≥4為甲基化，NIM<4為非甲基化。免疫組化判斷標(biāo)準(zhǔn)[12]：MGMT陽(yáng)性定位于細(xì)胞核；標(biāo)記指數(shù)計(jì)算方法：每張切片低倍鏡下選擇組織結(jié)構(gòu)良好、比較清晰的5個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞最為密集的區(qū)域，每個(gè)區(qū)域在高倍鏡下，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞指數(shù)（不包括間質(zhì)細(xì)胞和其他非腫瘤細(xì)胞），計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)平均值的百分率。標(biāo)記指數(shù)計(jì)分：Ⅰ級(jí)10%～25%為1分，Ⅱ級(jí)>25%～50%為2分，Ⅲ級(jí)>50%～75%為3分，Ⅳ級(jí)>75%～100%為4分。染色強(qiáng)度計(jì)分：Ⅰ級(jí)淡黃色為1分，Ⅱ級(jí)棕黃色為2分，Ⅲ級(jí)棕褐色為3分。每張切片兩種評(píng)分之乘積為該切片最后的表達(dá)強(qiáng)度：0分為（-），1～3分為（+），4～6分為（++），≥7分為（+++）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。甲基化結(jié)果運(yùn)用χ2及Fisher確切概率法，免疫組化結(jié)果使用多組有序秩和檢驗(yàn)，兩組間比較運(yùn)用Bonferroni檢驗(yàn)，甲基化和蛋白表達(dá)相關(guān)性及甲基化和年齡相關(guān)性運(yùn)用Pearson相關(guān)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料特征

225例鋸齒狀病變中HP 96例、SSA/P 61例、TSA 68例，分別占鋸齒狀病變的42.67%、27.11%和30.22%，96例HP中，男63例，女33例，男性多見(jiàn)，年齡31～88歲，平均（56.052±12.448）歲；61例SSA/P中，男43例，女18例，男性多見(jiàn)，年齡23～84歲，平均（56.665±14.976）歲；68例TSA中，男46例，女22例，男性多見(jiàn)，年齡30～85歲，平均（59.470±12.506）歲。

2.2 MGMT基因標(biāo)準(zhǔn)曲線分析

將陽(yáng)性對(duì)照按10的倍數(shù)稀釋成1～1×10-6 7個(gè)濃度梯度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（其拷貝數(shù)為103～109/mL），各濃度梯度反應(yīng)均做復(fù)孔。MethyLight的線性范圍為104～108拷貝/mL，R2為0.942。

2.3 MGMT基因啟動(dòng)子CpG島甲基化狀態(tài)

MGMT基因啟動(dòng)子CpG島甲基化陽(yáng)性表達(dá)率在正常組、TA組、HP組、SSA/P組、TSA組和CRC組分別為0.00%（0/42）、46.30%（25/54）、26.04%（25/96）、60.66%（37/61）、76.47%（52/68）和68.12%（47/69），各組差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2 = 112.790，P = 0.000）。正常組與SSA/P、TSA、TA、CRC組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），HP組與SSA/P、TSA、CRC組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），其余各組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)表2、圖2（見(jiàn)封三）。

表2 MGMT基因CpG島甲基化陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)結(jié)果[n（%）]

注：與正常組比較，▲P < 0.05；與HP組比較，△P < 0.05；HP：增生性息肉；TA：管狀腺瘤；SSA/P：廣基（無(wú)蒂）鋸齒狀腺瘤/息肉；TSA：傳統(tǒng)型鋸齒狀腺瘤；CRC：結(jié)直腸癌

2.4 MGMT蛋白陽(yáng)性表達(dá)率

MGMT蛋白陽(yáng)性表達(dá)率在正常組、TA組、HP組、SSA/P組、TSA組和CRC組分別為100.00%（24/24）、80.00%（16/20）、98.08%（51/52）、78.05%（32/41）、69.57%（16/23）和70.83%（17/24），差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2 = 26.641，P = 0.000）。正常組與HP、SSA/P、TSA、TA、CRC組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），HP組與SSA/P組、TSA組、TA組和CRC組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），其余各組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)表3、圖3。

2.5 MGMT基因甲基化與MGMT蛋白相關(guān)性分析

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，TA、SSA/P、TSA、CRC三組中MGMT甲基化與MGMT蛋白表達(dá)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），且相關(guān)性為負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為r = -0.500、-0.361、-0.437、-0.412；HP中MGMT甲基化與MGMT蛋白表達(dá)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），但相關(guān)性為負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為r = -0.220。見(jiàn)表4。

2.6 MGMT基因甲基化與年齡相關(guān)性分析

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，TA、HP、SSA/P、TSA四組中MGMT基因甲基化與年齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。MGMT基因甲基化與年齡相關(guān)性為正相關(guān)，與TA、HP、SSA/P、TSA相關(guān)系數(shù)分別為0.042、0.009、0.087、0.138。見(jiàn)表5。

3 討論

CRC是最常見(jiàn)的惡性消化道腫瘤之一，全球CRC每年新發(fā)病例數(shù)達(dá)123萬(wàn)，死亡約為發(fā)病率的1/2。近年研究表明，CRC發(fā)病率目前仍呈持續(xù)增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，其原因之一就是對(duì)結(jié)直腸鋸齒狀病變認(rèn)識(shí)不足[2，13]。2010年WHO消化系統(tǒng)腫瘤病理學(xué)和遺傳學(xué)分類(lèi)中對(duì)鋸齒狀病變的分類(lèi)比以往更為詳細(xì)[9]，HP在鋸齒狀病變中最常見(jiàn)，占所有病變的75%以上，根據(jù)組織學(xué)上的微小差別分為微泡性增生性息肉（microvesicular hyperplastic polyp，MVHP）、富于杯狀細(xì)胞的增生性息肉（goblet-cell rich hyperplastic polyp，GCHP）、寡黏液型增生性息肉（mucin-poor type，MPHP）[14]。SSA/P占鋸齒狀病變的15%～25%，根據(jù)細(xì)胞異型性分為伴/不伴有細(xì)胞異性增生型[14-16]。TSA不常見(jiàn)占鋸齒狀病變的1%左右，特征為具有整體復(fù)雜結(jié)構(gòu)域纖維狀生長(zhǎng)方式，常顯示細(xì)胞異型特點(diǎn)，與TA及伴細(xì)胞異型的SSA不同[14，17]。TSA一般與高M(jìn)SI癌無(wú)關(guān)，可能與低MSI有關(guān)[6]。近年來(lái)從分子遺傳學(xué)角度對(duì)鋸齒狀病變進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸鋸齒狀病變通路是一個(gè)多因素、多階段、多基因連續(xù)累積發(fā)生的過(guò)程，在此演變過(guò)程中有眾多CRC相關(guān)基因參與。鋸齒狀通路分為：①無(wú)蒂（廣基）鋸齒通路：以SSA/P和MVHP為代表，癌變機(jī)制為BRAF突變，引起錯(cuò)配修復(fù)基因h-MLH-1甲基化和高水平CpG島甲基化現(xiàn)象，導(dǎo)致腺體不同程度異型性增生直至癌變。②傳統(tǒng)鋸齒狀通路：包括TSA和GCHP，癌變機(jī)制為K-RAS基因突變，引起DNA修復(fù)基因MGMT甲基化和低高水平CpG島甲基化現(xiàn)象等。MGMT基因甲基化后，引起一些基因沉默，導(dǎo)致腺體異型性增加，進(jìn)一步發(fā)展為癌。鋸齒狀通路中有眾多異?；蚣谆?，若能深入研究并加以利用，不僅可以用于CRC的早期診斷、高危人群的監(jiān)測(cè)、癌變風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等，還可為CRC靶向治療藥物提供理論依據(jù)支持[1，18]。

在本實(shí)驗(yàn)基因?qū)用嫜芯恐邪l(fā)現(xiàn)正常黏膜組織、TA、HP、SSA/P和TSA中均有MGMT基因啟動(dòng)子CpG島甲基化，實(shí)驗(yàn)組鋸齒狀病變HP、SSA/P和TSA甲基化率為26.04%（25/96）、60.66%（37/61）和76.47%（52/68），對(duì)照組正常黏膜組織、TA和CRC的甲基化率為0.00%（0/42）、46.30%（25/54）和68.12%（47/69）。Dhir等[18]在18例TA中檢測(cè)到甲基化率為47.1%，29例不伴異型性的SSA/P中檢測(cè)到甲基化率為29.63%，19例伴有異型性的SSA/P中檢測(cè)到甲基化率為52.63%，在9例HP中檢測(cè)到甲基化率為14.29%，本研究中對(duì)照組的TA和實(shí)驗(yàn)組的SSA/P的甲基化率與以上研究結(jié)果基本符合，但實(shí)驗(yàn)組HP的甲基化率明顯高于Dhir等[18]研究，這可能與樣本量、樣本來(lái)源、引物在CpG島的位置不同等因素引起系統(tǒng)誤差有關(guān)。本研究對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組組間比較過(guò)程中，對(duì)照組正常黏膜組織與實(shí)驗(yàn)組SSA/P（P = 0.000）和TSA（P = 0.000）有顯著性差異，與實(shí)驗(yàn)組HP（P = 0.230）差異性不顯著；對(duì)照組CRC與實(shí)驗(yàn)組HP（P = 0.000），與實(shí)驗(yàn)組SSA/P（P = 0.375）和TSA（P = 0.275）差異性不顯著；對(duì)照組TA與實(shí)驗(yàn)組HP（P = 0.012）和TSA（P = 0.001）有顯著性差異，與實(shí)驗(yàn)組SSA/P（P = 0.123）差異性不顯著；實(shí)驗(yàn)組組組間比較過(guò)程中，HP和SSA/P（P = 0.000），HP和TSA（P = 0.000）組間有顯著性差異， SSA/P和TSA（P = 0.053）組間差異性不顯著。在本實(shí)驗(yàn)蛋白層面運(yùn)用免疫組化方法研究中發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組HP、SSA/P和TSA蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為98.08%（51/52）、78.05%（32/41）和69.57%（16/23），對(duì)照組正常黏膜組織、TA和CRC中蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為100%（24/24）、80.00%（16/20）和70.83%（17/24）。與Sawyer等[19]對(duì)39例SA運(yùn)用免疫組化方法發(fā)現(xiàn)MGMT陽(yáng)性表達(dá)率為18%（7/39）相比，在本實(shí)驗(yàn)中，SSA/P蛋白陽(yáng)性表達(dá)率[78.05%（32/41）]和TSA蛋白陽(yáng)性表達(dá)率[69.57%（16/23）]明顯高于Sawyer等[9]研究，具體原因可能與甲基化引物設(shè)計(jì)、樣本來(lái)源、樣本量大小等因素有關(guān)。本研究對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組組間比較過(guò)程中，對(duì)照組正常黏膜組織與實(shí)驗(yàn)組HP（P = 0.001）、SSA/P（P = 0.000）和TSA（P = 0.000）有顯著性差異；對(duì)照組CRC與實(shí)驗(yàn)組HP（P = 0.001）有顯著性差異，但SSA/P（P = 0.515）和TSA（P = 1.000）差異性不顯著；對(duì)照組TA與實(shí)驗(yàn)組HP（P = 0.029）有顯著性差異，但與實(shí)驗(yàn)組SSA/P（P = 1.000）和TSA（P = 0.434）差異性均不顯著；實(shí)驗(yàn)組與實(shí)驗(yàn)組組間比較過(guò)程中，HP和TSA（P = 0.001），HP和SSA/P（P = 0.006）中組間有顯著性差異，但在SSA/P和TSA（P = 0.452）中組間差異性均不顯著。在本實(shí)驗(yàn)MGMT基因甲基化與蛋白表達(dá)相關(guān)性研究中，發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)組HP、SSA/P和TSA中分別呈弱相關(guān)（P = 0.117，r = -0.220）、弱相關(guān)（P = 0.020，r = -0.361）及中等程度相關(guān)（P = 0.037，r = -0.437），對(duì)照組正常黏膜組織、TA和CRC中，正常黏膜組織運(yùn)用Pearson法無(wú)法計(jì)算相關(guān)性，TA中呈中等程度相關(guān)（P = 0.025，r = -0.500），CRC中呈中等程度相關(guān)（P = 0.046，r = -0.412）。通過(guò)數(shù)據(jù)可以看出，在實(shí)驗(yàn)組中HP、SSA/P和TSA基因甲基化和蛋白表達(dá)有顯著性差異，相關(guān)性分別為弱相關(guān)、弱相關(guān)和中等程度相關(guān)；在對(duì)照組中TA和CRC基因甲基化和蛋白表達(dá)有顯著性差異，相關(guān)性都為中等程度相關(guān)。通過(guò)基因?qū)用婧偷鞍讓用婕皟烧呦嚓P(guān)性的探究，推測(cè)在鋸齒狀病變通路中MGMT基因啟動(dòng)子甲基化有誘導(dǎo)MGMT蛋白表達(dá)下調(diào)，在鋸齒狀通路的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。在年齡相關(guān)性甲基化研究方面，在基因目的序列（-107～-200）這部分的位點(diǎn)上實(shí)驗(yàn)組HP（P = 0.931，r = 0.009）、SSA/P（P = 0.763，r = 0.042）和TSA（P = 0.263，r = 0.138）及對(duì)照組TA（P = 0.763，r = 0.042）中差異性均不顯著（P > 0.05），且相關(guān)性為弱正相關(guān)。

綜上所述，MGMT基因啟動(dòng)子CpG島甲基化可能導(dǎo)致MGMT蛋白表達(dá)下調(diào)，與鋸齒狀病變的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在無(wú)蒂（廣基）鋸齒通路和傳統(tǒng)鋸齒狀通路中起重要推動(dòng)作用，是CRC發(fā)生重要的分子事件。

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（收稿日期：2013-11-14 本文編輯：李繼翔）

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（收稿日期：2013-11-14 本文編輯：李繼翔）