重組優(yōu)勢T、B細胞表位的豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的原核表達及免疫原性研究

聶愷陽，吳云燕，易 琳，吳祖雄，陳金頂，趙明秋

(華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣東廣州510642)

豬圓環(huán)病毒 2 型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是一種共價閉合、單股環(huán)狀DNA 病毒，是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要致病原[1]。PCV2 主要侵害豬的免疫系統(tǒng)，造成嚴重的免疫抑制并伴有淋巴組織和淋巴器官中淋巴細胞減少[2]，導致機體的先天免疫系統(tǒng)防御功能受到抑制，進而容易引發(fā)其它病原微生物的侵襲，嚴重危害豬群健康[3]。

PCV2 有兩個主要的開放閱讀框(ORF1 和ORF2)，其中ORF2 編碼的Cap 蛋白是PCV2 主要的結構蛋白和功能蛋白[4-5]。目前，國內(nèi)外PCV2 商品化疫苗多為全病毒滅活疫苗，雖然能夠明顯降低豬群的死亡率，但PCV2 引起的主要是體液免疫應答，滅活疫苗卻難以引發(fā)機體有效的體液免疫應答[6]?？乖砦皇钦T導機體產(chǎn)生特異性免疫應答的基本單位[7]，因此本研究結合已報道的PCV2 抗原表位，篩選得到 Cap 蛋白中 4 個優(yōu)勢 B 細胞抗原表位：aa61～aa85、aa113～aa131、aa169～aa180 和 aa192～aa202區(qū)段以及Rep 蛋白中的2 個優(yōu)勢T 細胞抗原表位：aa81～aa100 和 aa201～aa220 區(qū)段[8-13]。分別構建 3種優(yōu)勢表位基因和截短的Cap 基因串聯(lián)的重組原核表達載體，經(jīng)誘導表達后研究優(yōu)勢T、B 細胞表位串聯(lián)PCV2 Cap 基因原核表達質(zhì)粒的體外表達情況以及對Cap 蛋白免疫原性的影響，以期為PCV2 新型疫苗的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料PCV2 全病毒滅活疫苗(LG 株)購自哈爾濱維科生物技術開發(fā)有限公司；PCV2 ELISA 抗體檢測試劑盒購自武漢科前生物股份有限公司；PCV2 陽性血清由廣東農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所惠贈；質(zhì)粒提取試劑盒購自OMEGA 有限公司；蛋白濃度測定試劑盒(Pierce BCA Protein Assay Kit)購自賽默飛有限公司；T4 DNA Ligase 連接酶、限制性內(nèi)切酶BamH I、Hind Ⅲ、Xhol I、DNA Marker、IPTG、Amp+均購自寶生物工程(大連)有限公司；HRP 標記羊抗豬IgG (IgG-HRP)購自廣州威佳公司；4 周齡～6 周齡BALB/c 雌性小鼠購自廣州南方醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.2 引物設計與合成依據(jù)GenBank 中PCV2 LG株的全基因序列(HM038034.1)，應用Primer Premier 5.0 軟件設計用于擴增去除核定位信號(NLS)的Cap基因的引物(表1)，并分別在上下游引物插入HindⅢ和XhoⅠ酶切位點(下劃線處)。

根據(jù)已報道的PCV2 Cap 和Rep 蛋白的抗原表位[8-13]，本實驗室將已篩選得到的4 個Cap 蛋白中優(yōu)勢B 細胞抗原表位和2 個Rep 蛋白中優(yōu)勢T 細胞表位(表2)通過DNAStar 軟件分析確定優(yōu)勢T、B 細胞抗原表位之間的串聯(lián)順序。將獲得的3 段串聯(lián)表位基因序列分別記為rB (4 個B 細胞表位串聯(lián))、rT (2個 T 細胞表位串聯(lián))和 rT-B (4 個 B 細胞與 2 個 T 細胞表位串聯(lián))，并由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。本研究利用Primer Premier 5.0 軟件設計3 段表位基因的特異性引物，并分別在上下游引物插入BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位點(下劃線處)(表1)。

表1 特異性引物Table 1 The sequences of specific primers

1.3 病毒基因組提取及目的基因的克隆按照DNA 提取試劑盒操作說明提取PCV2 滅活疫苗LG株DNA 作為模板，以Cap P1/P2 為引物，PCR 擴增Cap 基因，采用Omega 公司的膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行純化，將Cap 基因和原核表達載體pET-32a 雙酶切后連接、轉(zhuǎn)化，挑取疑似陽性單菌落進行雙酶切及測序鑒定。鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pET-Cap。

表2 表位肽序列與位置Table 2 The sequence and position of epitope peptides

1.4 重組質(zhì)粒 pET-rB-Cap、 pET-rT-Cap 和pET-rT-B-Cap 的構建與鑒定以本實驗室已合成的3 段表位基因rB、rT 和rT-B 為模板，分別以rB-P1/P2、rT-P1/P2、rT-B-P1/P2 為引物，PCR 擴增具有本實驗需要的酶切位點的rB、rT 和rT-B 基因，純化PCR 產(chǎn)物，將純化的3 段表位基因和重組質(zhì)粒pET-Cap 雙酶切后連接、轉(zhuǎn)化，挑取疑似陽性單菌落雙酶切及測序鑒定。鑒定正確的重組質(zhì)粒分別命名為 pET-rB-Cap、pET-rT-Cap 和 pET-rT-B-Cap。

1.5 rB-Cap、rT-Cap 和 rT-B-Cap 蛋白的誘導表達及檢測分別將重組表達質(zhì)粒pET-rB-Cap、pET-rT-Cap 和 pET-rT-B-Cap 轉(zhuǎn)化入 BL21(DE3)感受態(tài)細胞，于37 ℃培養(yǎng)至OD600nm為0.4～1.0 時 IPTG誘導，12 000 r/min 離心1 min 收集菌體，以未誘導重組菌和誘導的pET-32a(+)空載體菌作為對照，進行SDS-PAGE 以確定目的蛋白的IPTG 最佳誘導濃度和誘導時間。對誘導表達的各重組蛋白以PCV2陽性血清(1∶100)為一抗，羊抗豬 HRP-IgG (1∶5 000)為二抗，western blot 檢測目的蛋白的免疫原性。

1.6 rB-Cap、rT-Cap 和 rT-B-Cap 蛋白內(nèi)毒素去除及透析復性根據(jù)蛋白初步純化的方法[14]進行蛋白內(nèi)毒素去除及透析復性。BCA 法測定復性后重組蛋白濃度，然后采用上述SDS-PAGE 和western blot 條件檢測內(nèi)毒素去除及復性對目的蛋白的影響。

1.7 小鼠免疫及免疫原性的檢測將70 只4 周齡～6 周齡 SPF 級BALB/c 雌鼠隨機分為 7 組(PBS組、PCV2 全病毒滅活疫苗組、rCap 組、rB-Cap 組、rT-Cap 組、rT-B-Cap 組和 rB-Cap+rT-Cap+rT-B-Cap 3種抗原等量混合組)進行免疫原性檢測。免疫時間間隔為2 周，共免疫3 次，一免使用弗氏完全佐劑對抗原進行乳化，二免和三免使用弗氏不完全佐劑對抗原進行乳化。rCap 組、rB-Cap 組、rT-Cap 組、rT-B-Cap 組和 rB-Cap+rT-Cap+rT-B-Cap 組均分別經(jīng)皮下接種100 μg/ 只相應重組蛋白；PBS 組和PCV2全病毒滅活疫苗組分別經(jīng)皮下接種，200 μL/只。首免后7 d、21 d、35 d，每組各取3 只小鼠眼眶采血，分離血清，利用PCV2 ELISA 抗體檢測試劑盒檢測小鼠血清特異性抗體。

2 結 果

2.1 PC V2 Cap 基因的克隆及重組表達質(zhì)粒pET-Cap 的鑒定提取PCV2 滅活疫苗LG 株病毒DNA，采用表1 中的特異引物Cap P1/P2，PCR 擴增截短的Cap 基因，結果顯示，擴增的目的片段大小約600 bp，與截短的Cap 基因片段大小相符(圖略)，然后將該基因克隆至pET-32a 構建重組質(zhì)粒pET-Cap。經(jīng)雙酶切鑒定結果顯示，在約600 bp 處有一特異條帶，與截短Cap 基因大小相符(圖1)。表明重組表達質(zhì)粒pET-Cap 構建正確。

圖1 pET-Cap 的雙酶切鑒定Fig.1 Digestion analysis of pET-Cap recombinant

2.2 pET-rB-Cap、 pET-rT-Cap 和 pET-rT-BCap 重組表達質(zhì)粒的構建及鑒定PCR 擴增3 段表位基因，構建 3 種重組表達質(zhì)粒 pET-rB-Cap、pET-rT-Cap 和 pET-rT-B-Cap，經(jīng) PCR 鑒定結果顯示，獲得大小分別約220 bp、150 bp 和370 bp 的條帶(圖2)。測序結果顯示，各重組表達質(zhì)粒目的片段與PCV2 LG 株對應的表位基因一致，表明3 種串聯(lián)重組表達質(zhì)粒構建正確。

2.3 rB-Cap、rT-Cap 和 rT-B-Cap 重組蛋白的鑒定經(jīng)優(yōu)化實驗，結果顯示rB-Cap 蛋白在IPTG 終濃度為3.0 mmol/L、誘導時間6 h 時表達量最高，rT-Cap 蛋白在IPTG 終濃度為2.5 mmol/L、誘導時間6 h 時表達量最高，rT-B-Cap 蛋白在IPTG 終濃度為2.5 mmol/L、誘導時間5 h 時表達量最高(圖3)。3 種重組菌經(jīng)IPTG 誘導表達，SDS-PAGE 電泳鑒定表達產(chǎn)物。結果顯示：rB-Cap、rT-Cap 和rT-B-Cap重組蛋白在49 ku、46 ku、54 ku 出現(xiàn)目的條帶，與各目的蛋白大小一致。Western blot 鑒定結果顯示，3 種重組蛋白分別在49 ku、46 ku 和54 ku 處出現(xiàn)特異條帶，空載體對照無特異性反應(圖4)，表明表達的目的蛋白具有良好的反應原性。

圖2 pET-rB-Cap、pET-rT-Cap 和 pET-rT-B-Cap 的 PCR 鑒定Fig.2 Identification of pET-rB-Cap, pET-rT-Cap and pET-rT-B-Cap recombinant plasmids by PCR

圖3 rB-Cap、rT-Cap 和rT-B-Cap 蛋白表達的SDS-PAGE 檢測Fig.3 Expression of rB-Cap, rT-Cap and rT-B-Cap recombinant proteins by SDS-PAGE

圖4 rB-Cap、rT-Cap 和 rT-B-Cap 反應原性的 western blot 檢測Fig.4 Reactionogenicity analysis of rB-Cap, rT-Cap and rT-B-Cap recombinant proteins by western blot

2.4 內(nèi)毒素的去除及復性對rB-Cap、rT-Cap 和rT-B-Cap 蛋白的影響分別以去除內(nèi)毒素和透析復性后的 rB-Cap、rT-Cap 和 rT-B-Cap 為樣品進行SDS-PAGE 電泳檢測，結果顯示，去除內(nèi)毒素和透析復性處理后的rB-Cap、rT-Cap 和rT-B-Cap 蛋白與未處理的灰度值相近(圖5)。表明內(nèi)毒素去除和透析復性處理過程對蛋白表達量影響較弱。Western blot檢測結果顯示，內(nèi)毒素去除和透析復性處理后的rB-Cap、rT-Cap 和 rT-B-Cap 蛋白在 49 ku、46 ku 和54 ku 出現(xiàn)特異性條帶，與各目的蛋白大小一致(圖6)。BCA 法測定透析復性后rB-Cap、rT-Cap、rT-BCap 及rCap 蛋白的濃度，結果顯示，其濃度分別為1 852 μg/mL、1 946 μg/mL、1 857 μg/mL 和 1 664 μg/mL。以上結果表明，內(nèi)毒素去除和透析復性后的重組蛋白rB-Cap、rT-Cap 和rT-B-Cap 仍然具有較好的反應原性。

圖5 rB-Cap、rT-Cap 和 rT-B-Cap 復性的 SDS-PAGE 電泳檢測Fig.5 Detection of rB-Cap, rT-Cap and rT-B-Cap recombinant proteins treated with endotoxin removal and dialysis by SDS-PAGE

圖6 rB-Cap、rT-Cap 和rT-B-Cap 復性蛋白反應原性的western blot 檢測Fig.6 Reactionogenicity analysis of the treated rB-Cap, rT-Cap and rT-B-Cap recombinant proteins by western blot

2.5 小鼠免疫后血清抗體檢測采用ELISA 試劑盒檢測免疫后鼠血清中PCV2 Cap 抗體水平，結果顯示，在整個免疫周期中，各免疫組小鼠的血清抗體水平均顯著高于PBS 組(p＜0.01)。初次免疫后，除 rB-Cap 組外，rT-Cap 組、rT-B-Cap 組和 3 種抗原等量混合組血清中抗體水平均顯著高于疫苗組和rCap 組(p＜0.01)，其中 rT-B-Cap 組抗體水平最高。第2 次免疫后，血清中特異性抗體水平結果顯示，與疫苗組相比，rB-Cap 組、rT-Cap 組、rT-B-Cap 組和3 種抗原等量混合組血清中抗體水平顯著提高(p＜0.01)；與 rCap 組相比，rB-Cap 組和 rT-B-Cap 組小鼠血清中的抗體水平顯著提高(p＜0.01)(圖7)，rT-Cap 組和3 種抗原等量混合組小鼠血清中的抗體水平顯著降低(p＜0.01)。第3 次免疫后，小鼠血清中特異性抗體水平結果顯示，rB-Cap 組、rT-Cap組、rT-B-Cap 組和3 種抗原等量混合組血清中抗體水平均顯著高于全病毒滅活疫苗組和rCap 組(p＜0.01)(圖 7)。以上結果表明，PCV2 Cap 蛋白串聯(lián)T、B 優(yōu)勢抗原表位時免疫原性顯著提高。

圖7 免疫小鼠血清中PCV2 Cap 蛋白抗體檢測結果Fig.7 Detection of antibodies against PCV2 Cap protein in serum of immunized mice

3 討 論

目前，PCV2 商品化疫苗主要通過體液免疫提供保護效力，但是關于疫苗細胞免疫方面的作用尚不清楚。由于PCV2 不宜大規(guī)模培養(yǎng)純化，加之病毒具有較強的抵抗力等因素，限制了傳統(tǒng)滅活疫苗和弱毒疫苗的發(fā)展。亞單位疫苗具有簡便、安全、價廉及高產(chǎn)等優(yōu)勢，在疾病的預防與控制中將發(fā)揮越來越重要的作用[15]。

目前，關于PCV2 亞單位疫苗的相關研究主要集中在rCap 亞單位疫苗和多表位疫苗兩種類型。劉丹等分別制備PCV2-rRep、-rRep' 和-rCap 亞單位疫苗，研究表明PCV2-rRep 和-rRep' 蛋白亞單位疫苗免疫鼠血清無中和病毒能力，僅PCV2-Cap 蛋白亞單位疫苗具有良好的免疫保護力[16]。研究還發(fā)現(xiàn)，PCV2 Cap 蛋白可以通過與宿主細胞受體結合引發(fā)針對PCV2 的抗體以及淋巴細胞的增殖反應[17]。T、B細胞表位能夠與T 細胞抗原受體TCR 或B 細胞抗原受體BCR 特異性結合引發(fā)機體的免疫反應，從而形成對病原微生物的免疫能力[18]。近年來，PCV2 Cap 和Rep 蛋白中的線性和構象表位均被報道過[14]。Lekcharoensuk 等研究顯示PCV2 抗原表位主要位于Cap 蛋白第 aa47～aa63、aa165～aa200 及 C 端最后 4個氨基酸[19]；此外，Shang 等發(fā)現(xiàn)了位于Cap 蛋白的 其 它 4 個 線 性 表 位 ： aa156 ～aa162、 aa175 ～aa192、aa195～aa202 和 aa231～aa233[20]。與此同時，研究人員發(fā)現(xiàn)PCV2 Rep 蛋白中T 淋巴細胞表位(aa81～aa100 和aa201～aa220)能夠引起機體的細胞免疫，進而發(fā)揮免疫保護作用[21]。蔣偉等將PCV2 ORF2 中4 段表位基因和 ORF3 中 1 段表位基因串聯(lián)，表達目的蛋白，結果表明多表位蛋白具有很好的反應原性[22]。因此，本研究通過選取PCV2 Cap蛋白中4 個B 細胞抗原表位(aa61～aa85、aa113～aa131、aa169～aa180、aa192～aa202)和 Rep 蛋白中2 個 T 細胞抗原表位(aa81～aa100、aa201～aa220)，人工合成3 段表位基因(rB、rT 和rT-B)，構建了能夠同時表達多表位和Cap 蛋白的串聯(lián)重組載體(pET-rB-Cap、pET-rT-Cap 和 pET-rT-B-Cap)以表達 3種融合蛋白。

研究發(fā)現(xiàn)，PCV2 能夠感染小鼠并在鼠體內(nèi)復制[23]，且PCV2 疫苗免疫測試結果顯示，疫苗對豬和小鼠提供同樣的保護效力[24]。本實驗小鼠抗體檢測結果顯示，第3 次免疫后，rB-Cap 組、rT-Cap 組和rT-B-Cap 組小鼠的抗體水平均顯著高于全病毒滅活疫苗組和 rCap 組(p＜0.01)，且rT-B-Cap 組小鼠抗體水平最高。這一結果說明T、B 細胞表位同時串聯(lián)能顯著提高Cap 蛋白的免疫原性。這可能與T、B 細胞表位與保護性抗原Cap 基因融合具有協(xié)同作用[25]，能更好的激發(fā)靶動物的細胞免疫和體液免疫反應并增強了機體的MHC 分子對PCV2 的識別與結合有關[26]，從而使T、B 表位串聯(lián)保護性抗原的疫苗具有更高的免疫原性。

綜上所述，本研究利用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達了rB-Cap、rT-Cap 和 rT-B-Cap，結果表明rT-B-Cap蛋白具有更好的免疫原性，為PCV2 亞單位疫苗的研究與推廣提供了新的方向和參考依據(jù)。