新RGD嵌合體肽對(duì)黑色素瘤細(xì)胞B16增殖及其黑色素合成的影響

姜 軒，付 超，趙瑞利，金天明，馬吉飛，孫英峰，于曉雪，張 欣，劉夢(mèng)月，潘晨浩

(天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津300384)

抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，其中兩棲動(dòng)物皮膚抗菌肽大多都是陽(yáng)離子的堿性多肽，可與酸性的生物膜層狀排列的脂類雙分子層相結(jié)合[1]。近年來(lái)AMPs 的抗細(xì)菌、真菌、病毒和腫瘤的作用逐步被發(fā)掘，而RGD 肽是一種以精氨酸- 甘氨酸- 天冬氨酸為結(jié)構(gòu)的短肽，基質(zhì)蛋白R(shí)GD 三肽序列能與整合素αvβ3特異性結(jié)合，是整合素αvβ3 與其對(duì)應(yīng)配體蛋白相互識(shí)別的作用位點(diǎn)[2-3]，RGD 在細(xì)胞的黏附、增殖、分化、轉(zhuǎn)移凋亡等過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用，并參與腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。因此，在腫瘤藥物的新型藥物研發(fā)過(guò)程中整合素受體成為重要的靶點(diǎn)[4]。

黑色素瘤是一種常見(jiàn)的皮膚惡性腫瘤，是目前首位致死性皮膚腫瘤，且其惡性程度高，轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)[5]。有研究證實(shí)，惡性黑色素瘤患者預(yù)后主要取決于是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[6]，黑色素瘤細(xì)胞的分裂速度與腫瘤侵襲和遷移密切相關(guān)[7-8]。有研究表明合成黑色素是黑色素瘤細(xì)胞增殖過(guò)程中的重要過(guò)程，該過(guò)程主要受酪氨酸酶(TYR)調(diào)控[9]，TYR 是黑色素合成的關(guān)鍵限度酶，受小眼相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MITF)的調(diào)節(jié)，MITF 是黑色素細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子，可以直接激活TYR 啟動(dòng)子，促進(jìn)黑色素的生成[10-11]。已有研究結(jié)果表明新牛蛙抗腫瘤肽Temporin-La(T-La)在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖有抑制作用[12]，本實(shí)驗(yàn)以從牛蛙皮膚cDNA 文庫(kù)中篩選的T-La 抗腫瘤肽為基序，通過(guò)生物信息學(xué)設(shè)計(jì)合成新型抗腫瘤肽T-La(S)與 T-La(FS)，并將其與 RGD 肽偶聯(lián)成RGD-T-La(S)和 RGD-T-La(FS)，以小鼠黑色素瘤B16 細(xì)胞為對(duì)象，研究新合成的新牛蛙抗腫瘤RGD嵌合體肽抑制B16 細(xì)胞黑色素生成的機(jī)制，旨在為研究 RGD 嵌合體肽RGD-T-La(S)和 RGD- T-La(FS)靶向抗腫瘤的作用機(jī)制以及為臨床相關(guān)抗腫瘤藥物的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料小鼠黑色素瘤B16 細(xì)胞由天津農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；抗腫瘤肽由浙江昂拓萊司生物技術(shù)有限公司合成(表1)；CCK8 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RPMI1640 細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)HyClone 公司；TRIton X-100 購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；左旋多巴L-DOPA 購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司；812 包埋劑購(gòu)自SPI 公司；Cell Meter Fluorimetric Live cell cycle Assay Kit 購(gòu)自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；RNA 提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；UltraSYBR Mixture 購(gòu)自康為世紀(jì)科技有限公司；TYR 及MITF 基因擴(kuò)增引物由金唯智科技有限公司合成。

1.2 各抗菌肽對(duì)B16 細(xì)胞增殖抑制率的檢測(cè)于96 孔板中常規(guī)培養(yǎng)小鼠黑色素瘤B16 細(xì)胞[13]，每孔100 μL，并于37 ℃ 5 % CO2過(guò)夜培養(yǎng)，分別加入表1 中的4 種多肽使其終濃度分別為 200 μg/mL、100 μg/mL、 50 μg/mL、 20 μg/mL、 10 μg/mL、5 μg/mL，每組設(shè)4 個(gè)重復(fù)。同時(shí)設(shè)未經(jīng)任何處理的B16 細(xì)胞為對(duì)照，后面試驗(yàn)均如此。分別繼續(xù)培養(yǎng) 12 h、24 h 時(shí)加入 10 μL/ 孔 CCK8，37 ℃孵育40 min，分別在OD490nm和OD630nm處讀取每孔的吸光度值并記錄結(jié)果，分析4 種肽對(duì)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞抑制作用。

表1 抗腫瘤肽序列Table 1 Antitumor peptide sequences

1.3 乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)定同1.2 培養(yǎng)小鼠黑色素瘤B16 細(xì)胞后分別加入4 種多肽使其終濃度分別為 100 μg/mL 、50 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL，每組設(shè)3 個(gè)重復(fù)。分別繼續(xù)培養(yǎng)12 h 后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，采用LDH 測(cè)定試劑盒測(cè)定各組樣品中LDH 含量，測(cè)定OD450nm值。按照公式：培養(yǎng)液中 LDH 活性(U/L)=(測(cè)定 OD450nm值 - 對(duì)照 OD450nm值)/(標(biāo)準(zhǔn) OD4450nm值 - 空白 OD450nm值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(0.2 μmol/mL)×1 000 計(jì)算試驗(yàn)結(jié)果。

1.4 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察同1.2 培養(yǎng)B16 細(xì)胞后分別加入 4 種多肽使其終濃度分別為 10 μg/mL、50 μg/mL，棄培養(yǎng)液于戊二醛溶液中固定，磷酸緩沖液(PB)漂洗4 次。鋨酸室溫固定2 h，PB 漂洗3次。依次入梯度乙醇- 丙酮脫水后包埋。超薄切片機(jī)切片。鈾鉛雙染色，室溫干燥過(guò)夜后利用透射電鏡觀察小鼠黑色素瘤B16 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，比較分析4 種肽對(duì)其超微結(jié)構(gòu)的影響。

1.5 不同細(xì)胞周期細(xì)胞含量的檢測(cè)取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B16 細(xì)胞至12 孔板中，過(guò)夜培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組加不同濃度的(10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL)4 種多肽處理細(xì)胞，對(duì)照組不加多肽，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后用含0.25 % EDTA 的胰蛋白酶消化細(xì)胞，采用PBS 洗滌，收集 1×106個(gè)細(xì)胞制成 500 μL 單細(xì)胞懸液，按照細(xì)胞周期試劑盒說(shuō)明書，加入2.5 μL 200×Nuclear Green LCS1，置于 37 ℃ 5%CO2孵育 30 min，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光吸收量，用Modfit 軟件分析細(xì)胞周期各時(shí)期細(xì)胞比例，測(cè)定4 種多肽對(duì)B16細(xì)胞周期的影響。

1.6 黑色素含量測(cè)定取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B16細(xì)胞于6 孔板中，置37 ℃、5 % CO2中培養(yǎng)24 h 后PBS 洗滌一次換液，分別加入不同濃度(終濃度為5 μg/mL、 10 μg/mL、 20 μg/mL、 50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL)的 4 種多肽，并設(shè)立對(duì)照組。繼續(xù)作用24 h 后收獲細(xì)胞，消化細(xì)胞后將細(xì)胞懸浮離心，PBS 洗滌兩次，加入1 mol/L 的NaOH，置于80 ℃水浴30 min 至細(xì)胞團(tuán)塊完全溶解，再加入超純水將NaOH 終濃度稀釋至0.2 mol/L?；靹蚝笕「鹘M溶液至96 孔板中，每孔100 μL，每組設(shè)立8個(gè)重孔，利用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔OD490nm值。黑色素含量(%)=(OD490nm實(shí)驗(yàn)組 /OD490nm對(duì)照組)×100 %，分析比較4 種肽對(duì)B16 細(xì)胞黑色素的影響。

1.7 TYR 活性的測(cè)定按照1.6 方法培養(yǎng)多肽作用的B16 細(xì)胞，多肽作用24 h 后每孔加入1 % Triton X-100 溶液100 μL，手動(dòng)平穩(wěn)震蕩5 min，移至-20 ℃凍存1 h，室溫融化使細(xì)胞裂解，37 ℃預(yù)溫后每孔加入0.1 %左旋多巴溶液100 μL，37 ℃孵育 2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定 OD490nm值。TYR 活性激活率(%)=(OD490nm實(shí)驗(yàn)組/OD490nm對(duì)照組)×100 %，分析比較4種肽對(duì)小鼠黑色素瘤B16 細(xì)胞TYR 活性激活率的影響。

1.8 TYR 和MITF 基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B16 細(xì)胞至6 孔板中，過(guò)夜培養(yǎng)后分別加入不同濃度(20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL)的 4 種多肽處理細(xì)胞，對(duì)照組不加多肽，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后收集細(xì)胞，采用RNA 提取試劑盒提取樣品總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，分別以各組cDNA為模板，利用表2 中引物，按照SYBR Green 熒光定量PCR 試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)并分析4 種肽對(duì)TYR及MITF 基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。

表2 目的基因擴(kuò)增的引物Table 2 Target gene primers

1.9 數(shù)據(jù)處理試驗(yàn)結(jié)果采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS Statistics 17 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，p＜0.05 為兩組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)細(xì)胞增殖抑制的檢測(cè)結(jié)果利用CCK8 法測(cè)定不同濃度的RGD- 嵌合體肽對(duì)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，在分別加入4 種多肽12 h、24 h 后，B16 細(xì)胞增殖均受到明顯抑制，并且呈現(xiàn)時(shí)間濃度依賴性(表3)。RGD-T-La (FS)作用24 h 后對(duì)B16 細(xì)胞抑制率達(dá)到84 %，顯著高于T-La (FS)組 (p＜0.05)，一 定 程 度 上 RGD-T-La (S)、RGD-T-La (FS)組抑制B16 細(xì)胞增殖程度高于T-La(FS)、T-La (FS)組。表明4 種多肽均能抑制B16 細(xì)胞增殖，且RGD-T-La (FS)的抑制作用較強(qiáng)。

表3 多肽對(duì)B16 細(xì)胞增殖的抑制率12 h、24 h(n=4，)Table 3 Inhibition rate of B16 cell treat with peptide 12 h,24 h (n=4,)

表3 多肽對(duì)B16 細(xì)胞增殖的抑制率12 h、24 h(n=4，)Table 3 Inhibition rate of B16 cell treat with peptide 12 h,24 h (n=4,)

注：A 和a 表示在同一列數(shù)據(jù)中后跟相同字母的平均值沒(méi)有顯著差異(p＞0.01)、(p＞0.05)。Note: A and a mean in the same column followed by the same letters do not differ significant (p＞0.01), (p＞0.05).

Concentration(μg/mL)12 h 對(duì)照組(Control)5 10 20 50 100 200 24 h 對(duì)照組(Control)5 10 20 50 100 200 Peptide T-La S 1.06±0.04Aab 1.15±0.06Aa 1.11±0.07Aab 1.01±0.01Ab 0.84±0.05Bc 0.39±0.05Cd 0.14±0.01De 1.07±0.07Aa 0.99±0.02Bb 0.94±0.03bc 0.87±0.02cd 0.79±0.06Dd 0.34±0.02Ee 0.15±0.01Ff T-La FS 1.02±0.04Aa 0.94±0.02ABa 0.95±0.03ABa 0.83±0.06Bb 0.43±0.03Cc 0.17±0.03Dd 0.14±0.01Dd 1.08±0.05Aa 0.97±0.09ABb 0.96±0.05ABb 0.84±0.05Bc 0.42±0.12Cd 0.19±0.19De 0.19±0.17De RGD-T-La S 1.16±0.04ABab 1.14±0.06Aa 1.09±0.04ABa 1.03±0.11ABab 0.89±0.14Bb 0.46±0.08Cc 0.18±0.01Dd 1.06±0.03Aa 1.07±0.06Aa 0.98±0.10Aab 0.96±0.03Ab 0.74±0.01Bc 0.31±0.07Cd 0.13±0.02De RGD-T-La FS 1.19±0.04Aa 1.01±0.06ABb 0.99±0.09ABb 0.87±0.04BCc 0.80±0.07Cc 0.48±0.07Dd 0.21±0.08Ee 1.08±0.05Aa 0.98±0.03Aa 0.96±0.06Aa 0.76±0.04Bb 0.54±0.07Cc 0.31±0.03Dd 0.16±0.01Ee

2.2 對(duì)細(xì)胞LDH 含量影響的檢測(cè)結(jié)果采用微量酶標(biāo)法測(cè)定不同濃度的多肽對(duì)B16 細(xì)胞中LDH 含量的影響。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，T-La(S)與RGD-T-La(S)的 LDH 含量均顯著升高(p＜0.05)，在多肽含量為 100 μg/mL 時(shí)LDH 含量分別達(dá)到283.1 U/L、340.9 U/L，在多肽濃度 5 μg/mL、10 μg/mL 時(shí)LDH 含量RGD-T-La(S)處理組顯著高于T-La(S)。與對(duì)照組相比，T-La(FS)與RGD-T-La(FS)處理的B16細(xì)胞的LDH 含量均顯著升高(p＜0.05)，在多肽含量為100 μg/mL 時(shí) B16 細(xì)胞 LDH 含量達(dá)到最高，分別為329.8 U/L、225.8 U/L (圖1)。表明4 種多肽均能使B16 細(xì)胞中LDH 含量顯著升高，RGD-T-La(S)處理的 B16 細(xì)胞中LDH 含量高于其它多肽處理組，LDH 含量升高與線粒體活躍有關(guān)。

圖1 不同濃度的多肽對(duì)B16 細(xì)胞中LDH 含量影響的檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Effect of different concentrations of peptides on LDH content in B16 cells

2.3 RGD 嵌合體肽作用B16 細(xì)胞后的電鏡觀察經(jīng)多肽作用B16 細(xì)胞24 h 后，透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，經(jīng)4 種多肽作用后的B16 細(xì)胞出現(xiàn)核質(zhì)淡染，呈現(xiàn)區(qū)域性密集的顆粒樣物質(zhì)，線粒體腫大。其中經(jīng)RGD-T-La (S)、RGD-T-La (FS)50 μg/mL 作用后的 B16 細(xì)胞出現(xiàn)自噬體和線粒體自噬的現(xiàn)象(圖2B、2E)，RGD-T-La(FS)50 μg/mL 作用后的B16 細(xì)胞在損傷的線粒體中出現(xiàn)若干游離的膜結(jié)構(gòu)，形成自噬小體，自噬小體結(jié)構(gòu)更典型(圖2D、2E)，細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯變化，細(xì)胞器排列紊亂且出現(xiàn)空泡化，出現(xiàn)次級(jí)溶酶體。表明，RGD 嵌合體肽可能通過(guò)作用于B16 細(xì)胞線粒體導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

2.4 對(duì)細(xì)胞周期影響的檢測(cè)結(jié)果通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定4 種多肽對(duì)B16 細(xì)胞周期的影響。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，4 種多肽均可引起B(yǎng)16 細(xì)胞G0/G1期阻滯。T-La(S)和 RGD-T-La(S)在 50 μg/mL 時(shí)作用B16 后，G0/G1 期細(xì)胞比例由(56.43±0.33)%分別增加到(68.66±0.38)%和(62.22±0.35)% (p＜0.05)。T-La(FS)和 RGD-T-La(FS)在 50 μg/mL 時(shí)作用 B16 后，G0/G1 期細(xì)胞比例由(56.43±0.33)%分別增加到(66.10±0.21)%和(41.83±0.22)% (p＜0.05)。其中 RGDT-La(FS)組還可引起B(yǎng)16 細(xì)胞S 期阻滯，在20 μg/mL作用于 B16 細(xì)胞后，S 期細(xì)胞比例達(dá)到(54.97±0.38)% (表4)。表明，4 種多肽可通過(guò)阻滯B16 細(xì)胞G0/G1 期導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，其中RGD 嵌合體肽可通過(guò)作用B16 細(xì)胞S 期導(dǎo)致其增殖受阻。

圖2 多肽體外殺傷B16 細(xì)胞的透射電鏡觀察結(jié)果Fig.2 Transmission electron microscopy observation of peptides killing of B16 cells in vitro

表4 不同濃度多肽對(duì)B16 細(xì)胞周期分布的影響(n=3，，%)Table 4 Effects of different concentrations of peptides on cell cycledistribution of B16 Cells (n=3,, %)

表4 不同濃度多肽對(duì)B16 細(xì)胞周期分布的影響(n=3，，%)Table 4 Effects of different concentrations of peptides on cell cycledistribution of B16 Cells (n=3,, %)

注：表中數(shù)據(jù)肩標(biāo)符號(hào)“*”表示差異顯著(p＜0.05)Note: The shoulder symbols of the data in the table "*" indicate significant differences.

Group (μg/mL)Cell cycle distribution S Control T-La(S)10 T-La(S)20 T-La(S)50 RGD-T-La(S)10 RGD-T-La(S)20 RGD-T-La(S)50 T(FS)10 T(FS)20 T(FS)50 RGD-T(FS)10 RGD-T(FS)20 RGD-T(FS)50 G0/G1 56.43±0.33 46.58±0.16*74.82±0.17*68.66±0.38*26.98±0.25*29.16±0.20*62.22±0.35*41.6±0.29*64.82±0.17*66.10±0.21*52.43±0.26*35.82±0.27*41.83±0.22*G2/M 6.64±0.29 8.71±0.26*5.36±0.18*3.35±0.15*15.19±0.32*13.54±0.37*5.77±0.20*9.27±0.32*2.84±0.23*4.07±0.26*4.58±0.34*9.21±0.23*9.16±0.15*36.93±0.42 44.73±0.30*25.97±0.28*21.83±0.33*57.83±0.24*57.3±0.19*32.03±0.27*49.13±0.24*30.37±0.17*29.83±0.14*42.98±0.43*54.97±0.38*42.98±0.21*

2.5 對(duì)黑色素形成影響的檢測(cè)結(jié)果利用NaOH 裂解法測(cè)定4 種多肽對(duì)B16 細(xì)胞中黑色素含量的影響，結(jié)果顯示，加入多肽后細(xì)胞黑色素含量均顯著低于空白對(duì)照組(p＜0.05)，隨著多肽濃度的增加，黑色素含量下降，RGD-T-La(S)在 50 μg/mL、100 μg/mL作用時(shí)B16 細(xì)胞黑色素含量分別下降到70.4 %和66.3 %，RGD-T-La(FS)在 100 μg/mL 時(shí)黑色素含量下降到66.3 %，低于T-La(S)處理組的B16 細(xì)胞黑色素含量，T-La(S)處理的B16 細(xì)胞黑色素含量雖然也有下降，但其各濃度間差異不明顯(p＞0.05)(圖3)。表明RGD- 嵌合體肽對(duì)B16 細(xì)胞黑色素的合成有顯著的抑制作用。

圖3 多肽對(duì)B16 細(xì)胞黑色素合成的影響Fig.3 Effect of peptide on melanin synthesis in B16 cells

2.6 對(duì)TYR 活性影響的檢測(cè)結(jié)果通過(guò)L-Dopa 氧化法測(cè)定4 種多肽對(duì)B16 細(xì)胞TYR 活性的影響。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，不同濃度的多肽對(duì)B16 細(xì)胞中TYR 活性均具有顯著的抑制作用(p＜0.05)，其中 RGD-T-La(S)和 RGD-T-La(FS)在 10 μg/mL 作用于B16 細(xì)胞時(shí)TYR 下降趨勢(shì)明顯，在100 μg/mL 作用于B16 細(xì)胞時(shí)TYR 活性分別降到49.2%和55.9%，對(duì)TYR 活性的抑制率要高于T-La(S)與T-La(FS)(圖4)。表明RGD 嵌合體肽能夠降低B16 細(xì)胞的TYR活性。

圖4 多肽對(duì)B16 細(xì)胞TYR 活性的影響Fig.4 Effect of peptide on tyrosinase activity of B16 cells

2.7 對(duì)TYR 和MITF 基因轉(zhuǎn)錄水平影響的檢測(cè)結(jié)果通過(guò)熒光定量PCR(q-PCR)檢測(cè)多肽對(duì)黑色素合成關(guān)鍵因子TYR 和MITF 基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，RGD-T-La(S)處理的B16細(xì)胞在 100 μg/mL 時(shí) TYR 基因的 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平顯著降低(p＜0.05)，在 20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL 時(shí)MITF 基因的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平均顯著降低(p＜0.05)；50 μg/mL、100 μg/mL RGD-T-La(FS)處理的 B16 細(xì)胞的TYR 和MITF 基因轉(zhuǎn)錄水平均顯著降低(p＜0.05)(表5)。表明，RGD 嵌合體肽通過(guò)降低B16 細(xì)胞TYR 和MITF 基因轉(zhuǎn)錄水平控制黑色素含量生成。

表5 多肽對(duì)B16 細(xì)胞TYR、MITF mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的影響(n=3，X±S)Table 5 Effects of peptideon TYR and MITF mRNA expression in B16 cells (n=3, X±S)

3 討 論

刁昱文等人證實(shí)合體RGD-Las 可以靶向裸鼠人肝癌原位移植瘤。伊文斯藍(lán)顯色反應(yīng)結(jié)果顯示了嵌合體 RGD-Las 和腫瘤組織穿透能力強(qiáng)于Temporin-La[13]。目前RGD 肽即作為潛在的示蹤劑而成為研究的主要方向之一，特別是某些腫瘤細(xì)胞和腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)的整合素αvβ3 分子可與外源性含RGD 肽的分子發(fā)生特異性結(jié)合，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)并啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞的凋亡過(guò)程。

經(jīng)研究表明惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵之一是腫瘤細(xì)胞異常增殖及分化，細(xì)胞凋亡受阻，某些天然抗腫瘤藥物的機(jī)制在于通過(guò)抑制微管的解聚進(jìn)而抑制細(xì)胞的有絲分裂，阻滯細(xì)胞的G2/M 期，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[14]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用不同濃度的抗腫瘤肽對(duì)B16 細(xì)胞進(jìn)行研究，結(jié)果顯示4 種多肽對(duì)B16 細(xì)胞G0/G1、G2/M 期均有明顯阻滯作用，從而表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制細(xì)胞增殖的作用。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況，結(jié)果顯示，與T-La(S)、T-La(FS)相比，經(jīng) RGD-T-La(S)、RGD-T-La(FS)作用后的B16 細(xì)胞G0/G1 期的比例顯著增加，表明多肽及RGD 嵌合體肽可能通過(guò)改變細(xì)胞周期，使細(xì)胞阻滯在G1 期，阻滯其DNA 合成，從而抑制黑素瘤細(xì)胞增殖。

有研究發(fā)現(xiàn)TYR 在催化黑色素生成過(guò)程中主要參與兩個(gè)階段：一是催化L- 酪氨酸羥基化轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)- 多巴(羥苯丙氨酸)，多巴形成后又反過(guò)來(lái)催化酪氨酸和TYR 的反應(yīng)；二是氧化L- 多巴失去兩個(gè)氫原子形成多巴醌[15]。合成黑色素是黑色素瘤細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的重要特征，其合成過(guò)程主要由黑色素合成關(guān)鍵限速酶TYR 基因調(diào)控，其通過(guò)調(diào)節(jié)因子MITF上調(diào)TYR 基因的表達(dá)，從而促進(jìn)黑色素的生成[16]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，T-La(S)、T-La(FS)及其RGD嵌合體肽可能通過(guò)抑制MITF mRNA 轉(zhuǎn)錄水平而下調(diào)TYR mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平，從而抑制B16 細(xì)胞黑色素的生成。劉夢(mèng)月等人初步證明RGD 嵌合體肽具有靶向抗腫瘤作用，通過(guò)作用于細(xì)胞膜表面的靶點(diǎn)迅速作用于腫瘤細(xì)胞[17]。本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步證明RGD 嵌合體肽對(duì)誘導(dǎo)B16 細(xì)胞凋亡的影響，未偶聯(lián)RGD 的多肽雖然也具有抗腫瘤作用，卻與其作用機(jī)制有所區(qū)別。

通過(guò)透射電鏡觀察到多肽作用于B16 細(xì)胞后出現(xiàn)了線粒體腫大及自噬體，表明多肽及RGD 嵌合體肽可能通過(guò)激活與線粒體有關(guān)的活動(dòng)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，自噬體形成的過(guò)程中所涉及的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子通過(guò)調(diào)節(jié)自噬相關(guān)基因的活性和表達(dá)來(lái)調(diào)控自噬[18]。調(diào)節(jié)自噬的因子包括蛋白激酶(Tor、Erk1/2、G 蛋白等)[19]，自噬體的發(fā)生需要多信號(hào)的參與，依賴多種基因和蛋白的調(diào)控，自噬可能成為一種新的凋亡途徑，其更進(jìn)一步的抗腫瘤機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。本研究為RGD-嵌合體肽RGD-T-La(S)和RGD-T-La(FS)的靶向抗腫瘤的作用機(jī)制以及為臨床相關(guān)抗腫瘤藥物的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。