應(yīng)用減毒沙門(mén)菌載體遞呈多糖抗原的研究進(jìn)展

卞曉萍，劉 青，孔慶科

(西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶北碚400715)

近年來(lái)，應(yīng)用減毒沙門(mén)菌載體遞呈異源抗原開(kāi)發(fā)口服活疫苗受到廣泛的重視。沙門(mén)菌作為活的疫苗載體，其優(yōu)點(diǎn)有：(1)沙門(mén)菌疫苗通過(guò)常規(guī)的細(xì)菌培養(yǎng)方法即可大量獲得，而且可以通過(guò)食物或飲水口服給藥，是大規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)接種疫苗的經(jīng)濟(jì)、方便選擇；(2)經(jīng)口服接種的減毒沙門(mén)菌能夠通過(guò)粘膜途徑感染宿主，誘發(fā)特異性粘膜、體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答[1]；(3)沙門(mén)菌可以在活細(xì)胞中生物合成多糖，并且這些多糖可以連接至類(lèi)脂A (Lipid A)的核心寡糖部分，從而誘導(dǎo)針對(duì)異源多糖抗原的系統(tǒng)性免疫應(yīng)答[2-3]。此外，使用延遲減毒系統(tǒng)能夠兼顧減毒沙門(mén)菌疫苗的安全性和有效性。該系統(tǒng)的主要原理是，用可調(diào)控啟動(dòng)子(如阿拉伯糖調(diào)控子)將某些基因的啟動(dòng)子替換，在體外誘導(dǎo)條件下該基因可以正常表達(dá)，沙門(mén)菌可以如野生菌一樣感染宿主，而一旦沙門(mén)菌到達(dá)缺乏誘導(dǎo)條件的體內(nèi)環(huán)境，該基因不再表達(dá)，從而引起細(xì)菌毒力弱化[4]。外膜多糖是存在于大多數(shù)致病菌的一種毒力因子，經(jīng)修飾后可以被用來(lái)預(yù)防相關(guān)致病菌引發(fā)的疾病。因此，使用減毒沙門(mén)菌載體開(kāi)發(fā)多糖疫苗也是相關(guān)研究的熱點(diǎn)之一。本文將對(duì)減毒沙門(mén)菌載體遞呈異源多糖的研究進(jìn)展及其潛在的免疫機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 荷載多糖的減毒沙門(mén)菌誘發(fā)免疫的機(jī)制

經(jīng)消化道感染宿主后，在腸道具有侵襲力的減毒沙門(mén)菌可以通過(guò)以M 細(xì)胞為代表的上皮細(xì)胞途徑侵入皮下組織，然后被位于小腸上皮下穹窿區(qū)的抗原遞呈細(xì)胞(Antigen presenting cell，APC)捕獲，進(jìn)而誘發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答[5]。而缺乏侵襲力的減毒沙門(mén)菌則需要依靠吞噬細(xì)胞的吞噬作用才能被運(yùn)送到血液中，繼而到達(dá)肝臟和脾臟并誘發(fā)相應(yīng)的免疫應(yīng)答[6]。

細(xì)菌的外膜多糖是非T 細(xì)胞依賴(lài)性抗原(TI 抗原)。雖然多糖抗原能在體內(nèi)誘導(dǎo)特異性IgM 應(yīng)答，但不能誘導(dǎo)大量IgM 轉(zhuǎn)換為IgG，也不能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答增強(qiáng)(即記憶免疫后的二次抗體應(yīng)答)和持續(xù)的T 細(xì)胞記憶。多糖抗原也不能與MHC-II 類(lèi)分子結(jié)合，所以無(wú)法被遞呈給T 輔助細(xì)胞(Th 細(xì)胞)，繼而導(dǎo)致生發(fā)中心反應(yīng)、B 細(xì)胞受體的相關(guān)同種型轉(zhuǎn)換及親合力成熟和記憶B 細(xì)胞的產(chǎn)生等免疫應(yīng)答過(guò)程也無(wú)法發(fā)生。為了解決TI 多糖抗原無(wú)法誘導(dǎo)有效免疫應(yīng)答的問(wèn)題，F(xiàn)ikri 等將B 組鏈球菌III 型的莢膜多糖與蛋白載體(卵清蛋白，破傷風(fēng)毒素或卵清蛋白肽)共價(jià)結(jié)合，發(fā)現(xiàn)多糖能夠被APC 捕獲并與MHC-II 類(lèi)分子結(jié)合，然后激活Th 細(xì)胞，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為T(mén) 細(xì)胞依賴(lài)性抗原(TD抗原)[7]。在多糖-蛋白載體共價(jià)結(jié)合的情況下，多糖抗原誘導(dǎo)特異性IgM 轉(zhuǎn)換為IgG，記憶B 細(xì)胞發(fā)育和高效記憶T 細(xì)胞產(chǎn)生，從而誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生多糖抗原特異性、適應(yīng)性免疫應(yīng)答反應(yīng)。

多糖- 蛋白載體進(jìn)入體內(nèi)后，能夠被APC (如巨噬細(xì)胞、B 細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等)捕獲，然后與APC 的受體結(jié)合并交聯(lián)，進(jìn)而通過(guò)胞吞作用(外源抗原遞呈途徑)被內(nèi)化到核內(nèi)體中。在溶酶體中，某些氧化劑如活性氧(Reactive oxygen species，ROS)可以將多糖解聚為更小的碳水化合物(寡糖)，而蛋白質(zhì)部分被酸性蛋白酶加工成短肽類(lèi)。從而產(chǎn)生短肽、寡糖以及寡糖- 短肽復(fù)合物等。隨后，寡糖- 短肽復(fù)合物的短肽部分被遞呈至細(xì)胞表面并與MHC-II類(lèi)分子結(jié)合，MHC-II 類(lèi)分子將更親水的寡糖遞呈至CD4+T 細(xì)胞的 αβ 受體(T cellαβ receptor，TCRαβ)，TCRαβ 可以識(shí)別寡糖以及寡糖- 短肽復(fù)合物中的糖鏈。從抗原結(jié)合到APC 受體直至其被呈遞給T 細(xì)胞，整個(gè)過(guò)程約需要30 min～60 min[8]。寡糖與MHC-II 類(lèi)分子結(jié)合可以活化T 細(xì)胞，并誘發(fā)T 細(xì)胞產(chǎn)生白介素-4 (IL-4)和 IL-2 等細(xì)胞因子。在這些細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下B 細(xì)胞開(kāi)始在生發(fā)中心反應(yīng)、誘導(dǎo)免疫球蛋白的同種型轉(zhuǎn)換、體細(xì)胞高度突變以及記憶B 細(xì)胞的生成等。最終，機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)寡糖的特異性IgG抗體(圖1)。因此，通過(guò)多糖與蛋白載體的共價(jià)結(jié)合，可以將多糖抗原轉(zhuǎn)化為T(mén)D抗原。

圖1 多糖- 蛋白載體激活T 細(xì)胞的機(jī)制[7]

2 減毒沙門(mén)菌遞呈異源多糖抗原的應(yīng)用

2.1 減毒沙門(mén)菌載體的開(kāi)發(fā)減毒沙門(mén)菌因其特殊的優(yōu)勢(shì)被廣泛用于細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)以及腫瘤等方面的研究。與應(yīng)用減毒沙門(mén)菌載體遞呈蛋白抗原一樣，用于遞呈異源多糖的沙門(mén)菌也必須經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)亩玖θ趸?。早期通過(guò)化學(xué)物質(zhì)誘變和紫外線照射的方法使沙門(mén)菌減毒，但這兩種方法存在很大的盲目性，可能存在未知的突變和回復(fù)突變，從而造成弱毒株的不穩(wěn)定。如在20 世紀(jì)60年代初，房曉文等通過(guò)化學(xué)誘變的方法選育出預(yù)防仔豬副傷寒的減毒沙門(mén)菌疫苗，命名為C500[9]。該疫苗使用以來(lái)，我國(guó)的仔豬副傷寒得到了有效的控制，但同時(shí)該弱毒株的副作用較大，部分豬在接種后出現(xiàn)發(fā)抖，高燒甚至死亡。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，目前大多數(shù)都采用基因工程的方法在沙門(mén)菌染色體中隨機(jī)插入一個(gè)轉(zhuǎn)座子或刪除某些基因，以改變其編碼的毒力因子或編碼關(guān)鍵代謝途徑的酶基因序列，以及控制菌株在體內(nèi)生存的調(diào)節(jié)基因，使毒力基因突變，從而使其減毒，但不改變其免疫原性[10]。沙門(mén)菌的基因缺失途徑可以分為營(yíng)養(yǎng)缺失途徑和代謝缺失途徑。如芳香族氨基酸合成相關(guān)的aroA、嘌呤合成相關(guān)的pur、全局調(diào)控基因phoP/Q和cAMP 利用相關(guān)的crp/cya等。但是，在開(kāi)發(fā)減毒沙門(mén)菌載體的同時(shí)，還應(yīng)考慮到對(duì)沙門(mén)菌的毒力弱化要適度，既要保證安全性，又要避免過(guò)度減毒而影響其侵入機(jī)體、定植免疫器官和誘導(dǎo)有效免疫反應(yīng)的能力。

首先，減毒沙門(mén)菌經(jīng)口服免疫到達(dá)腸道后，需承受胃酸以及其它宿主防衛(wèi)因子如膽堿，抗菌肽等的攻擊，這對(duì)減毒沙門(mén)菌在腸道中的定植至關(guān)重要。研究表明，每種微生物均含有不同的耐酸反應(yīng)(Acid tolerance response，ATR)系統(tǒng)，它能夠使細(xì)菌在宿主體內(nèi)耐受低酸環(huán)境，因此不同的微生物表現(xiàn)出不同程度的耐酸性。盡管沙門(mén)菌編碼ATR1、ATR3 (精氨酸脫羧酶系統(tǒng))、ATR4 (賴(lài)氨酸脫羧酶系統(tǒng))和ATR5 (鳥(niǎo)氨酸脫羧酶)系統(tǒng)，但它僅具有中等耐酸性，可能是由于缺乏耐低酸的ATR2(谷氨酸脫羧酶系統(tǒng))[11]。Kopecko 等為了提高傷寒沙門(mén)氏菌(SalmonellaTy21a，S.Ty21a)的耐酸性，在可調(diào)控的阿拉伯糖啟動(dòng)子誘導(dǎo)下將gad(谷氨酸依賴(lài)性耐酸基因)克隆到多拷貝質(zhì)粒(pGad)中。pGad 在pH2.5 的低酸環(huán)境下復(fù)制3 h 后，將 Ty21a 的耐酸性增加了5 個(gè)對(duì)數(shù)，此時(shí)細(xì)菌在阿拉伯糖存在的條件下正常生長(zhǎng)并且增強(qiáng)了耐酸性[12]。隨后，該研究者為了gad基因能夠100 %穩(wěn)定表達(dá)，將該基因插入S.Ty21a 染色體中，并去除抗生素抗性標(biāo)記。通過(guò)培養(yǎng)單核細(xì)胞/ 巨噬細(xì)胞，測(cè)定重組菌的生長(zhǎng)曲線和存活率，結(jié)果表明：Ty21a中Gad 蛋白的表達(dá)不會(huì)對(duì)該重組菌的減毒產(chǎn)生任何影響。Wu 等以Ty21a 為載體遞呈異源抗原開(kāi)發(fā)二聯(lián)苗，通過(guò)插入與異源抗原基因共表達(dá)的gad來(lái)構(gòu)建重組耐酸菌，從而增強(qiáng)重組菌在胃酸性環(huán)境中的生存能力。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，重組菌具有良好的耐酸性[13]。再者，減毒沙門(mén)菌還需通過(guò)定植在腸道細(xì)胞和其它細(xì)胞內(nèi)，然后與免疫細(xì)胞作用誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。Kong 等應(yīng)用阿拉伯糖調(diào)控的延遲減毒系統(tǒng)構(gòu)建了減毒沙門(mén)菌，使沙門(mén)菌在進(jìn)入體內(nèi)(無(wú)阿拉伯糖環(huán)境)的早期階段具有類(lèi)似野生型沙門(mén)菌定植的能力，而定植到宿主后致弱，然后重組菌在阿拉伯糖缺少的條件下會(huì)進(jìn)行程序式裂解，從而釋放外源多糖抗原誘導(dǎo)相應(yīng)的免疫應(yīng)答[14]。最后，利用基因重組技術(shù)，可以將沙門(mén)菌開(kāi)發(fā)為載體遞呈異源多糖抗原。那么重組減毒沙門(mén)菌怎樣才能誘發(fā)宿主產(chǎn)生針對(duì)異源多糖抗原的特異性免疫應(yīng)答，這對(duì)開(kāi)發(fā)多糖疫苗十分重要。目前，通用的方法是將整個(gè)多糖基因簇整合到沙門(mén)菌中。Han 等將禽致病性大腸桿菌(Avian pathogenicEscherichia coli，APEC)O1 和 O2 抗原的整個(gè)基因簇整合到減毒沙門(mén)菌中，并且經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重組菌能夠誘發(fā)針對(duì)異源多糖抗原的免疫反應(yīng)[2-3]。此外，由于沙門(mén)菌自身具有O- 抗原多糖，利用這一特性可以改造沙門(mén)菌自身的O- 抗原多糖合成基因，使其能夠表達(dá)異源多糖抗原。Li 等改造減毒傷寒沙門(mén)菌的O- 抗原多糖基因簇，使其表達(dá)腸炎沙門(mén)菌的O9 多糖抗原，結(jié)果發(fā)現(xiàn)減毒傷寒沙門(mén)菌能夠很好的表達(dá)異源多糖[15]。但這種方法要求異源多糖的結(jié)構(gòu)與載體自身的O- 抗原多糖結(jié)構(gòu)具有相似處，因而具有一定的局限性。

2.2 減毒沙門(mén)菌載體遞呈的多糖減毒沙門(mén)菌載體的研究在國(guó)外很早就有報(bào)道，雖然近幾年國(guó)內(nèi)也有很多關(guān)于使用減毒沙門(mén)菌載體遞呈異源抗原的研究，但所遞呈的大部分都是蛋白類(lèi)等抗原，關(guān)于異源多糖抗原的遞呈鮮有報(bào)道。S.Ty21a 是國(guó)際上唯一許可的減毒沙門(mén)菌口服活疫苗，因其遺傳背景較清晰，所以較多使用S.Ty21a 作為載體遞呈多糖抗原。其次，減毒鼠傷寒沙門(mén)菌(Salmonella enterica serovar typhimurium，S.typhimurium)載體也有較多研究。而對(duì)其它減毒沙門(mén)菌如豬霍亂沙門(mén)菌(Salmonella enterica serovar Choleraesuis，S.Choleraesuis)遞呈異源多糖的報(bào)道幾乎沒(méi)有，除此之外減毒沙門(mén)菌所遞呈的多糖抗原大都為革蘭氏陰性菌的外膜多糖(表1)。

表1 減毒沙門(mén)氏菌載體遞呈的異源多糖

外膜多糖位于細(xì)菌的表面，它直接與宿主相互作用，這大大增加了致病菌逃避免疫系統(tǒng)細(xì)胞的吞噬作用以及促進(jìn)了致病菌的粘附等，因此多糖是一個(gè)重要的毒力因子。純化的多糖不能誘導(dǎo)良好的免疫反應(yīng)，但與蛋白載體共價(jià)結(jié)合后，可誘導(dǎo)較高的免疫反應(yīng)，因此多糖也是一種重要的免疫因子。目前，異源多糖抗原在減毒沙門(mén)菌中的表達(dá)主要有兩種方式。一種是將多糖基因簇整合到沙門(mén)菌的染色體中，另外一種是將編碼多糖基因簇的質(zhì)粒導(dǎo)入沙門(mén)菌中。由于沙門(mén)菌能夠生物合成多糖，因此這兩種方式均能夠使多糖與沙門(mén)菌的Lipid A 連接，進(jìn)而誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)異源多糖抗原的免疫應(yīng)答。Dharmasena 等一直研究S.Ty21a 作為多功能口服疫苗載體，并嘗試用它來(lái)遞呈多種異源多糖抗原[16]。起初，他們將S.Ty21a 分別導(dǎo)入編碼宋內(nèi)志賀氏菌(Shigellasonnei)和痢疾志賀氏菌(S.dysenteriae)脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)基因簇的質(zhì)粒，所得到的重組菌在非選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)＞50 代后，仍然能夠穩(wěn)定攜帶這些質(zhì)粒，但仍含有抗生素抗性標(biāo)記。但刪除抗生素抗性標(biāo)記后，發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒表達(dá)變得不穩(wěn)定。為此，研究者將編碼S.sonneiLPS 基因簇的約12 kb 區(qū)域插入到由于突變而無(wú)功能的S.Ty21a 基因組中，構(gòu)建了能夠表達(dá)同源和異源O- 抗原的重組菌，并且在刪除抗生素抗性標(biāo)記后顯示100 %的遺傳穩(wěn)定性。為了使減毒沙門(mén)菌載體誘發(fā)更廣泛的免疫交叉保護(hù)，Dharmasena 等將噬菌體SfII 攜帶的bgt-gtrII 基因克隆到質(zhì)粒的2a rfb 操縱子上游區(qū)，噬菌體SF6 攜帶的oac基因和噬菌體 SfX 攜帶的gtrX、gtrA和gtrB基因及其同源啟動(dòng)子串聯(lián)克隆到質(zhì)粒的2a rfb 操縱子上游區(qū)。通過(guò)上述方法得到的重組菌能夠同時(shí)表達(dá)弗氏志賀氏菌(Shigellaflexneri)2a 和3a O-抗原，并且能夠誘發(fā)有效的免疫應(yīng)答[18]。為了能夠穩(wěn)定表達(dá)外源多糖抗原，并誘發(fā)有效的免疫應(yīng)答。Han 等用新型酵母細(xì)菌穿梭載體pSS26 克隆 10.8 kb 的 APEC O1 和 O2 O- 抗原多糖基因簇，并將所得到的質(zhì)粒導(dǎo)入減毒鼠傷寒沙門(mén)菌載體中[2-3]。通過(guò)玻片凝集，銀染和蛋白印跡等試驗(yàn)證實(shí)O1 和O2 O-抗原多糖能夠在減毒鼠傷寒沙門(mén)菌中穩(wěn)定合成。其結(jié)果還顯示減毒沙門(mén)菌疫苗中產(chǎn)生的APEC O1 和O2 O- 抗原多糖能夠附著于減毒沙門(mén)菌的表面，并且異源多糖抗原的存在不影響減毒沙門(mén)菌表面脂多糖等其它佐劑的表達(dá)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，該重組菌能夠?yàn)榍蓊?lèi)提供針對(duì)APEC O1 O2 抗原攻擊的保護(hù)，并誘導(dǎo)針對(duì)異源多糖的高IgG 和IgA 免疫應(yīng)答。新型酵母細(xì)菌穿梭載體的應(yīng)用使異源多糖基因簇能夠成功連接到沙門(mén)菌的Lipid A 并暴露于沙門(mén)菌的表面，這使重組菌能夠誘發(fā)針對(duì)異源多糖的有效免疫應(yīng)答。

將編碼多糖基因簇的質(zhì)粒導(dǎo)入減毒沙門(mén)菌中會(huì)面臨質(zhì)?？赡軄G失的問(wèn)題，而應(yīng)用以營(yíng)養(yǎng)選擇標(biāo)志代替抗生素抗性標(biāo)志為主要特征的宿主- 載體平衡致死系統(tǒng)能夠使外源基因在宿主菌中穩(wěn)定表達(dá)。目前，應(yīng)用較多的是asd宿主- 載體平衡致死系統(tǒng)。該系統(tǒng)的原理是：asd基因負(fù)責(zé)編碼的天冬氨酸B- 半醛脫氫酶，是沙門(mén)菌的賴(lài)氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸、二氨基庚二酸(DAP)合成途徑中的一種關(guān)鍵酶，DAP 是構(gòu)成沙門(mén)菌細(xì)胞壁中肽聚糖的基本成分，是保持細(xì)胞完整性不可或缺的物質(zhì)。asd基因發(fā)生突變后，沙門(mén)菌由于不能合成DAP 而導(dǎo)致溶菌死亡[24]。當(dāng)導(dǎo)入帶有asd完整基因的互補(bǔ)質(zhì)粒后，質(zhì)粒與缺陷菌株能夠以遺傳互補(bǔ)的方式共同構(gòu)成宿主- 載體平衡致死系統(tǒng)，含有互補(bǔ)質(zhì)粒的缺陷菌可在體內(nèi)復(fù)制。此時(shí)，互補(bǔ)質(zhì)粒對(duì)其宿主菌的生長(zhǎng)成為必需，一旦質(zhì)粒丟失，沙門(mén)菌則由于不能合成必需物質(zhì)而死亡，因此凡是能在體內(nèi)生長(zhǎng)的缺陷菌株必定含有重組質(zhì)粒[25]。除此之外，編碼胸腺嘧啶核苷酸合成酶的thyA基因、編碼谷氨酰胺合成酶的glnA基因等平衡致死系統(tǒng)也有應(yīng)用，其原理與asd宿主載體平衡致死系統(tǒng)類(lèi)似[25]。

3 問(wèn)題與展望

多糖疫苗在20 世紀(jì)80年代末首次用于人體免疫。b型流感嗜血桿菌(Hib)一直是引起細(xì)菌性腦膜炎的主要原因，但多糖疫苗上市后病原體引起的腦膜炎發(fā)病率降低95 %。這一巨大成功為進(jìn)一步研究多糖疫苗打開(kāi)了大門(mén)。2005年以后，我國(guó)至少有4 個(gè)以上廠家制造的Hib 結(jié)合疫苗先后注冊(cè)上市。但是，國(guó)產(chǎn)的Hib 結(jié)合疫苗普遍采用溴化氫活化莢膜多糖或其衍生物與蛋白共價(jià)結(jié)合來(lái)制備疫苗，結(jié)合方法過(guò)于單一、制造成本高且有著顯著的局限性(如免疫原性較差、不能提供群體免疫力等)[26]。而用減毒沙門(mén)菌載體遞呈異源多糖抗原構(gòu)建多糖疫苗，其載體本身具有免疫佐劑作用。例如，LPS 的刺激可以增強(qiáng)樹(shù)突狀細(xì)胞捕獲和加工MHC-Ⅰ類(lèi)抗原的能力，有利于將重組沙門(mén)氏菌的抗原遞呈給特異性的B、T 細(xì)胞[5]。而且，定植的減毒沙門(mén)菌可以持續(xù)地表達(dá)外源多糖抗原、刺激宿主，不需要反復(fù)免疫。此外，沙門(mén)氏菌是胞內(nèi)侵襲菌，能夠激活相應(yīng)的細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞(CTL)，經(jīng)純化并共價(jià)結(jié)合的蛋白-多糖則沒(méi)有此作用。

在過(guò)去的十幾年里，對(duì)減毒沙門(mén)菌載體的研究向前跨越了一大步。已經(jīng)有不少實(shí)驗(yàn)證實(shí)了減毒沙門(mén)菌載體遞呈異源多糖的潛力，但其真正用于臨床還需解決幾個(gè)問(wèn)題。減毒沙門(mén)菌載體的安全性是首先需要考慮的。如果未經(jīng)充分減毒，經(jīng)口服途徑給藥的沙門(mén)菌可能在宿主體內(nèi)大量增植并造成嚴(yán)重的毒副作用。針對(duì)這種情況，可以考慮應(yīng)用可調(diào)控的延遲減毒系統(tǒng)，該系統(tǒng)的應(yīng)用使沙門(mén)菌充分減毒的同時(shí)又能保持其良好的侵襲力與定植[27]。總之，在對(duì)沙門(mén)菌減毒的同時(shí)，既要保證其安全性，又要保證其良好的免疫原性。其次，如其它載體一樣，減毒沙門(mén)菌用于遞呈異源多糖也需要考慮遞呈效率。酵母細(xì)菌穿梭載體可以用于克隆表達(dá)多糖基因簇，該方法的主要原理在于利用酵母能在體內(nèi)組裝同源片段(酵母具有復(fù)制子ARS4 和CEN5以及原核復(fù)制子pSC101)，然后形成大質(zhì)粒的特性(該質(zhì)粒具有TRP、Spec、asd 的篩選標(biāo)記，可以實(shí)現(xiàn)在酵母和原核宿主中的篩選，可以同時(shí)容納多個(gè)DNA 片段用于克隆長(zhǎng)片段DNA 或基因簇的克隆和穩(wěn)定表達(dá))，再結(jié)合沙門(mén)菌的低拷貝質(zhì)粒能容納大片段的特性及專(zhuān)門(mén)用于疫苗遞送的質(zhì)粒載體即平衡致死系統(tǒng)組合而成的這一種方法。此外，載體與多糖之間的相互作用仍需進(jìn)一步研究，這對(duì)應(yīng)用減毒沙門(mén)菌載體開(kāi)發(fā)多糖疫苗成功應(yīng)用到臨床至關(guān)重要。例如，沙門(mén)菌自身的O- 抗原多糖對(duì)異源多糖的表達(dá)是否有影響、減毒沙門(mén)菌載體遞呈異源多糖對(duì)其糖鏈的修飾有何影響以及多糖與lipidA 連接后誘發(fā)機(jī)體免疫的機(jī)制都尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)室正著力于優(yōu)化重組減毒沙門(mén)菌載體，并嘗試以沙門(mén)菌為載體來(lái)遞呈不同的多糖抗原，以開(kāi)發(fā)安全有效的、可用于遞呈異源多糖的沙門(mén)菌疫苗。

雖然以減毒沙門(mén)菌為載體開(kāi)發(fā)多糖多價(jià)疫苗還未達(dá)到預(yù)期的成果，但應(yīng)用沙門(mén)菌開(kāi)發(fā)多糖多價(jià)疫苗有著諸多的優(yōu)點(diǎn)和潛力，仍值得繼續(xù)研究。相信隨著相關(guān)研究的進(jìn)一步深入以及現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，當(dāng)前遇到的問(wèn)題將來(lái)都可以得到解決。