H5和H7亞型高致病性禽流感病毒新型凍干微芯片雙重?zé)晒舛縍T-PCR方法的建立和初步應(yīng)用

高曉藝，韓 燾，王乃迪，王傳彬，楊 林，王新杰，高姍姍，孫曉明，胡祥鈺，石玉祥，劉玉良*

(1.中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京102618；2.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北邯鄲056021；3.北京億森寶生物科技有限公司，北京100025)

高致病性禽流感(Highly pathogenic avian influenza，HPAI)是由部分H5 或H7 亞型禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)引起多種禽類急性感染和死亡的一種烈性傳染病，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為法定報(bào)告動(dòng)物疫病，在我國被列為一類動(dòng)物疫病。在國務(wù)院發(fā)布的《國家中長期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃(2012～2020年)》 中，將其列為優(yōu)先防治和重點(diǎn)防范的5 種一類動(dòng)物疫病之一。AIV 基因組為分節(jié)段單股負(fù)鏈 RNA，目前已發(fā)現(xiàn)其有 16 種 H 亞型(H1～H16)和 9 種 N 亞型(N1～N9)[1]，研究發(fā)現(xiàn)，HPAIV 包含H5 和H7 兩種亞型，對禽類具有高致病力，可引起禽流感的暴發(fā)和流行[2-3]。在我國，H5N1 亞型禽流感于1996年在廣東首次報(bào)道后，每年均引發(fā)數(shù)起疫情[4]。該亞型病毒于1997年在中國香港首次直接感染人并發(fā)生致人死亡事件，之后一直備受廣泛關(guān)注[5]。流行病學(xué)監(jiān)測結(jié)果表明，近年來以H5N6 亞型HPAIV 為主的2.3.4.4 分支病毒在我國為優(yōu)勢流行株，分離率高，造成多起疫情，危害十分嚴(yán)重[6]。而且，測序結(jié)果分析表明，該亞型病毒已發(fā)生變異，導(dǎo)致目前所用的H5 (Re-8)+H7(Re-1)二價(jià)疫苗不能提供充分保護(hù)(未發(fā)表數(shù)據(jù))。2013年，我國首次報(bào)道H7N9 亞型AIV 致人死亡事件，引發(fā)高度關(guān)注[7]。截止目前，高致病性H7N9亞型AIV 已在我國不同類型和不同規(guī)模的養(yǎng)禽場中造成14 起疫情，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重[8-9]。

本實(shí)驗(yàn)室前期監(jiān)測結(jié)果顯示，H7N9 AIV 部分毒株的HA 裂解位點(diǎn)與以往毒株相比，插入了多個(gè)堿性氨基酸(如PEVPKRKRTAR/GL)，表明該病毒已突變?yōu)镠PAIV (數(shù)據(jù)未發(fā)表)，另外，國家禽流感參考實(shí)驗(yàn)室和其它多家單位也已監(jiān)測和分離到多株H5和H7 亞型HPAIV 毒株。精準(zhǔn)快速的檢測和鑒別診斷是有效防控動(dòng)物疫病的前提和基礎(chǔ)。目前，對于H5 和H7 亞型AIV 檢測，利用SPF 雞胚分離和增殖病毒的方法存在耗時(shí)長、生物安全風(fēng)險(xiǎn)大、SPF 雞胚來源受限等缺點(diǎn)；而ELISA 方法特異性和靈敏度較低，容易出現(xiàn)假陰性；普通RT-PCR 方法是AIV檢測的重要手段[10]，但是，該方法存在操作繁瑣、檢測時(shí)間長且易污染等弊端。目前，市場上缺乏對以上兩種亞型HPAIV 毒株鑒別檢測的成熟技術(shù)。鑒于此，本研究通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了快速、精準(zhǔn)、靈敏度高、便攜、可用于基層現(xiàn)場檢測，并且可有效鑒別檢測H5 和H7 兩種亞型HPAIV 的新型凍干微芯片“雙重”熒光定量RT-PCR 檢測方法。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料H5N1 亞型HPAIV、H5N1 亞型LPAIV、H7N9 亞型HPAIV、H7N9 亞型低致病性禽流感病毒(LPAIV)、H9N2 亞型AIV、H6N1 亞型AIV、H1N1 甲型流感病毒、H3N2 亞型AIV，雞傳染性貧血病毒(Chicken infectious anemia virus，CIAV)、禽傳染性喉氣管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus，ILTV)、雞滑液囊支原體(Mycoplasma synoviae，MS)、雞毒支原體(Mycoplasma galliscepticum，MG)、禽腺病毒(Avian adenovirus，AAV)、沙門氏菌(Salmonella)，均由中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室保存，其中H5N1 和H7N9 亞型HPAIV均已滅活；新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)、禽傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)、傳染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)、禽腦脊髓炎病毒(Avian encephalomyelitis virus，AEV)均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。Dream-TaqTMHot Start DNA Polymerase、Maxima H Minus Reverse Transcriptase 購自 Thermo Scientific 公司；海藻糖購自北京百奧萊博科技有限公司；RNA 提取試劑盒和AriaYSB 微芯片、總DNA 提取試劑盒均購自北京億森寶生物科技有限公司。30 份組織、血清和咽肛拭子臨床樣品分別采自湖北省(樣品編號A1～C1)、重慶市(樣品編號C2-C11)和湖南省(樣品編號C12-C21)3 個(gè)養(yǎng)雞場。8 份AIV 陽性樣品由本實(shí)驗(yàn)室鑒定保存。

1.2 引物、TaqMan-MGB 探針的設(shè)計(jì)根據(jù)已報(bào)道 的 H5 (MK046067.1)和 H7 亞 型 (MF455308.1)HPAIV HA 基因 ORF 序列及 HA 基因裂解位點(diǎn)序列，設(shè)計(jì)多對引物和探針。經(jīng)過反復(fù)比對篩選，確定一組最佳引物和一條TaqMan-MGB 探針(表1)。其中H5 亞型的探針報(bào)告基因?yàn)镕AM，H7 亞型的探針報(bào)告基因?yàn)镽OX。

表1 擴(kuò)增HA 基因所用引物和探針Table 1 Primers and probes used for amplification of HA gene

1.3 病毒基因組的提取利用總RNA 提取試劑盒提取病毒基因組RNA，病毒包括：H5N1 亞型HPAIV、H5N1 亞 型 LPAIV、H7N9 亞 型 HPAIV、H7N9 亞 型 LPAIV、H9N2 亞型 AIV、H6N1 亞 型AIV、H1N1 甲型流感病毒、H3N2 亞型AIV、NDV、IBV、IBDV、AEV。利用總DNA 提取試劑盒提取病原基因組DNA，病原包括： CIAV、ILTV、MS、MG、AAV、Salmonella。將提取的核酸置于冰上立即用于熒光RT-PCR 擴(kuò)增，或暫放于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 凍干微芯片反應(yīng)體系的優(yōu)化采用方陣法對反應(yīng)體系的引物和探針濃度(0.1 μmol/L、0.2 μmol/L、0.3 μmol/L、0.4 μmol/L、0.5 μmol/L)、Mg2+濃度(1 mmol/L、2 mmol/L、3 mmol/L、4 mmol/L)、反轉(zhuǎn)錄酶及HotStartTaqDNA 聚合酶終濃度(0.3 U/μL、0.5 U/μL、1 U/μL、2 U/μL)等進(jìn)行了優(yōu)化。擴(kuò)增反應(yīng)體系和程序優(yōu)化如下：反轉(zhuǎn)錄溫度設(shè)為50 ℃，時(shí)間分別為5 min、10 min、20 min、30 min；預(yù)變性設(shè)為95 ℃，時(shí)間分別為1 min、3 min、5 min 及10 min；循環(huán)次數(shù)分別為35 個(gè)循環(huán)、40 個(gè)循環(huán)、45個(gè)循環(huán)。預(yù)變性溫度為95 ℃，時(shí)間分別為3 s、5 s、10 s、15 s，隨后設(shè)置退火及延伸溫度為55 ℃和60 ℃，時(shí)間分別為15 s、30 s、45 s、60 s，在此步驟收集熒光信號。利用上述不同參數(shù)，對凍干微芯片體系進(jìn)行優(yōu)化。凍干微芯片上樣孔為30 個(gè)，將所有反應(yīng)試劑充分混勻后以1.2 μL/ 孔加入微芯片孔。根據(jù)樣品量情況，在配制反應(yīng)液時(shí)需多配制2～3 個(gè)樣品的反應(yīng)液母液，以保證反應(yīng)液足夠。將加有有RT-PCR 反應(yīng)試劑的微芯片先置于-80 ℃冷凍1 h，然后凍干：先將隔板溫度下降至-55 ℃，預(yù)凍1 h；然后設(shè)備開啟抽真空，保持冷凍干燥1 h；解析干燥階段，將隔板溫度升至-25 ℃保持1 h；然后將隔板溫度升至37 ℃并保持2 h；最后將隔板降至25 ℃并保持1 h。

1.5 凍干微芯片特異性試驗(yàn)利用優(yōu)化后的凍干微芯片雙重?zé)晒釸T-PCR 反應(yīng)條件和程序檢測H5 和H7 亞型 HPAIV、H5 和 H7 亞型LPAIV，利用相同反應(yīng)條件同時(shí)檢測H9N2 AIV、H6N1 AIV、H1N1甲型流感病毒、H3N2 AIV、NDV、IBV、IBDV、AEV、CIAV、ILTV、MS、MG、AAV 和沙門氏菌。以無核酸酶滅菌雙蒸水作為陰性對照。每個(gè)循環(huán)延伸結(jié)束時(shí)，采集熒光信號，分析本研究所建立的方法的特異性。

1.6 凍干微芯片敏感性試驗(yàn)將1×107TCID50/mL的 H5 和 H7 亞型HPAIV 10 倍倍比稀釋后，取 1×100TCID50/mL～1×106TCID50/mL 共 7 個(gè)不同濃度分別提取基因組RNA 作為模板，以無核酸酶滅菌雙蒸水作為陰性對照，采用建立的凍干微芯片雙重?zé)晒舛縍T-PCR 方法檢測。同時(shí)，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室摸索建立的條件，用同樣稀釋的相同模板進(jìn)行常規(guī)熒光定量RT-PCR 擴(kuò)增(表2)，以確定和比較兩種檢測方法的敏感性。

常規(guī)熒光定量RT-PCR 反應(yīng)：50 ℃30 min，95 ℃5 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 45 s，40 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光信號采集和檢測。

1.7 重復(fù)性試驗(yàn)利用本研究所建立的方法初步組裝成試劑盒，選用同一批次的8 個(gè)檢測試劑盒對8份AIV 陽性樣品常規(guī)處理后進(jìn)行檢測，評價(jià)其批內(nèi)重復(fù)性；選用3 個(gè)不同批次的試劑盒對同樣8 份陽性樣品進(jìn)行檢測，評價(jià)其批間重復(fù)性。樣本標(biāo)準(zhǔn)差代表所采用的樣本X1、X2...Xn 的均值；變異系數(shù)CV=(標(biāo)準(zhǔn)差SD/平均值)×100 %。

表2 常規(guī)熒光定量RT-PCR 反應(yīng)體系配制表Table 2 Preparation of conventional real-time RT-PCR reaction system

1.8 臨床樣品的檢測將采自湖北省(樣品編號A1～C1)、重慶市(樣品編號C2-C11)和湖南省(樣品編號C12-C21)3 個(gè)養(yǎng)雞場共30 份組織、血清和咽肛拭子臨床樣品經(jīng)常規(guī)處理后利用上述1.3 中核酸提取方法提取總RNA 為模板，利用本研究所建立的凍干微芯片雙重?zé)晒釸T-PCR 方法對提取的總RNA 進(jìn)行擴(kuò)增檢測和比較分析。同時(shí)，利用本實(shí)驗(yàn)室建立的常規(guī)熒光定量RT-PCR 方法對HA 基因進(jìn)行擴(kuò)增鑒定和測序驗(yàn)證。樣品信息見表5。

2 結(jié) 果

2.1 檢測體系優(yōu)化結(jié)果通過比較，確定本研究凍干微芯片檢測方法的最佳反應(yīng)條件如表3 所示。

反應(yīng)最佳條件為：50 ℃ 10 min；95 ℃ 1 min；95 ℃ 5 s，60 ℃15 s，40 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)延伸結(jié)束時(shí)，采集熒光信號和檢測。

2.2 特異性檢測結(jié)果利用本實(shí)驗(yàn)建立的方法檢測H5 和H7 亞型HPAI HA 基因，同時(shí)應(yīng)用該方法檢測其它禽病病原。結(jié)果顯示，僅在H5 亞型HPAIV及H7 亞型HPAIV 出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線峰，Ct 值分別為18.86 和25.96，而其它亞型AIV 和禽病病原，以及陰性對照均未有擴(kuò)增曲線出現(xiàn)(圖1)。表明該方法具有較強(qiáng)的特異性。

2.3 敏感性檢測結(jié)果將H5 亞型HPAIV 10 倍倍比稀釋后，利用本研究建立的方法進(jìn)行敏感性檢測，結(jié)果顯示，該方法檢測下限為病毒濃度為1×101TCID50/mL，Ct 值為 32.79 (圖2A)；而常規(guī)熒光定量 RT-PCR 檢測的最低病毒濃度為 1 ×102TCID50/mL，Ct 值為30.97 (圖2B)。表明凍干微芯片雙重?zé)晒舛縍T-PCR 方法敏感性比常規(guī)熒光定量RT-PCR 約高10 倍。H7 亞型HPAIV 敏感性結(jié)果同H5 亞型(圖略)。

通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖分析結(jié)果顯示，凍干微芯片雙重?zé)晒舛縍T-PCR 擴(kuò)增效率為107.00 % (A)，而常規(guī)熒光定量RT-PCR 擴(kuò)增效率為89.96 % (B)，表明本研究所建立的方法的擴(kuò)增效率比常規(guī)熒光定量RT-PCR 高。兩種方法所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線公式及相關(guān)系數(shù)均較接近，兩種方法的相關(guān)系數(shù)均為0.997 (圖3)。H7 亞型 HPAIV 結(jié)果相似(圖略)。

表3 凍干微芯片雙重?zé)晒舛縍T-PCR 反應(yīng)體系Table 3 The lyophilized microchip duplex real-time RT-PCR reaction system

2.4 重復(fù)性檢測結(jié)果利用所建立的方法進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性檢測，結(jié)果顯示，批內(nèi)(0.42%～0.92%)及批間(0.08 %～1.45 %)變異系數(shù)均＜2 % (表 4)，表明該試劑盒具有較好的重復(fù)性。

2.5 臨床樣品檢測結(jié)果利用所建立的凍干微芯片雙重?zé)晒釸T-PCR 方法，對采集的經(jīng)常規(guī)方法處理后的30 份臨床樣品提取基因組進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示有15 份樣品為H5 和H7 亞型HPAIV，15 份樣品為陰性。樣品信息和檢測結(jié)果分別見表5 和圖4。所有30 份樣品均用普通RT-PCR 擴(kuò)增HA 基因ORF，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物電泳和純化后，測序驗(yàn)證(結(jié)果略)。結(jié)果顯示，凍干微芯片雙重?zé)晒釸T-PCR 方法檢測結(jié)果與普通RT-PCR 檢測結(jié)果以及測序結(jié)果完全一致。表明本研究建立的凍干微芯片雙重?zé)晒釸T-PCR 方法可用于H5 和H7 亞型HPAIV 臨床鑒別檢測。

圖1 H5 和H7 亞型HPAIV 特異性檢測結(jié)果Fig.1 Specificity of H5 and H7 HPAIV detection

圖2 凍干微芯片熒光RT-PCR(A)和常規(guī)熒光定量RT-PCR (B)敏感性檢測結(jié)果Fig.2 Sensitivity test of the lyophilized microchip duplex real-time RT-PCR (A)and conventional real-time RT-PCR (B)

圖3 兩種方法檢測H5 亞型HPAIV 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of H5 HPAIV detection by lyophilized microchip duplex real-time RT-PCR and conventional real-time RT-PCR

表4 批內(nèi)和批間重復(fù)性檢測結(jié)果Table 4 Results of repeatability test

3 討 論

目前，熒光定量RT-PCR 方法在H5 和H7 亞型AIV 檢測中得到廣泛應(yīng)用，但所報(bào)道的常規(guī)熒光定量RT-PCR 方法一般只檢測H5 或H7 亞型，不能同時(shí)檢測兩種亞型。另外，所用試劑需在冷凍或低溫條件下保存運(yùn)輸，所用儀器設(shè)備體積大，沉重不便攜帶，價(jià)格昂貴，這些缺點(diǎn)均限制了該方法的現(xiàn)場檢測和應(yīng)用?；谝陨犀F(xiàn)實(shí)情況，本研究設(shè)計(jì)合成了 H5 和 H7 亞型 HPAIV 特異性引物和TaqMan-MGB 探針，首先建立雙重?zé)晒舛縍T-PCR 方法，并采用本實(shí)驗(yàn)室已建立成熟的凍干技術(shù)，將PCR 反應(yīng)試劑凍干在微芯片上，最終首次摸索建立了凍干微芯片雙重?zé)晒舛縍T-PCR 檢測方法。該方法可同時(shí)檢測H5 和H7 兩種亞型HPAIV，為“雙重”熒光定量RT-PCR 檢測方法。

表5 臨床樣品信息和檢測結(jié)果Table 5 Clinical samples and result of testing

圖4 臨床樣品檢測擴(kuò)增峰圖Fig.4 Results of clinical sample detection

應(yīng)用本研究所建立的方法，對HPAIV、LPAVI、NDV、IBV、IBDV 等15 種常見禽病病毒以及MS、MG、沙門氏菌等病原體進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，所建立的方法可特異性檢測出H5 或H7 亞型禽流感病毒，可見特異性擴(kuò)增曲線峰，而對其它所有病原體檢測結(jié)果均為陰性，無任何特異擴(kuò)增曲線峰。因此，該方法具有較強(qiáng)的特異性。王振全等建立了可同時(shí)檢測H5 亞型HPAIV、狂犬病病毒、豬鏈球菌2 型等6 種病原的雜交基因芯片檢測方法，檢測的靈敏度在 1.38×10-5pg/μL～151 pg/μL 之間，略高于常規(guī)熒光定量RT-PCR 方法[11]。本研究建立的方法最低可檢測到1×101TCID50/mL 的AIV，比常規(guī)熒光定量RT-PCR 檢測方法高約10 倍，因此本研究建立的方法與已報(bào)道的基因芯片檢測方法在敏感性上類似或略高，完全達(dá)到常規(guī)檢測的要求。推測本研究方法因擴(kuò)增反應(yīng)體積非常小(＜2 μL)，而且 PCR 反應(yīng)室的芯片為特制材料，不同于普通塑料，反應(yīng)時(shí)升降溫迅速，溫控好，芯片內(nèi)溫度均勻，因此，在反應(yīng)中酶的活性能更充分地發(fā)揮，最終使得反應(yīng)體系的擴(kuò)增效率和敏感性更高，反應(yīng)過程也更穩(wěn)定。此外，本研究選取8 份陽性樣本，利用同一批次和不同批次的試劑盒，對陽性樣本進(jìn)行檢測，分析檢測結(jié)果，評價(jià)其批內(nèi)和批間重復(fù)性檢測情況。結(jié)果顯示，批內(nèi)和批間重復(fù)性檢測的變異系數(shù)均＜2 %，表明該方法的重復(fù)性好。最后，本研究對30 份臨床樣品進(jìn)行了檢測，結(jié)果與普通RT-PCR 和測序結(jié)果完全一致，證實(shí)該方法可在基層用于臨床樣品現(xiàn)場檢測。因此，該檢測方法克服了傳統(tǒng)檢測方法的缺點(diǎn)，具有單管封閉操作防污染、自動(dòng)化程度高、特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、耗時(shí)少、可實(shí)時(shí)監(jiān)控等優(yōu)點(diǎn)。

核酸分析是微芯片在熱循環(huán)期間同時(shí)讀取在每個(gè)反應(yīng)器上由PCR 產(chǎn)物產(chǎn)生的熒光信號，本研究采用的微芯片技術(shù)不同于目前常用的塑料PCR 管作為載體盛載PCR 反應(yīng)體系，而是采用金屬載體微芯片，反應(yīng)體系及樣本直接加到金屬載體上進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增。金屬載體熱傳導(dǎo)效率和升降溫速率快，可大幅度縮短反應(yīng)時(shí)間，而且，一次反應(yīng)可同時(shí)檢測30 個(gè)樣品。本研究結(jié)果顯示，所建立的檢測方法運(yùn)行時(shí)間不到40 min，而常規(guī)熒光定量RT-PCR 反應(yīng)時(shí)間一般約為120 min，因此，該方法大大縮短了反應(yīng)時(shí)間，將運(yùn)行時(shí)間縮短約2/3；另外，該檢測方法所需的反應(yīng)體系最少僅為1.2 μL，只需微量試劑和病毒核酸即可檢測，而常規(guī)熒光定量RT-PCR 反應(yīng)體系一般為20 μL 左右，因此，與常規(guī)熒光定量RT-PCR 相比，反應(yīng)體系縮小了近20倍；所需的擴(kuò)增反應(yīng)試劑因已凍干，無需冰凍，可方便地進(jìn)行常溫保存和運(yùn)輸至基層應(yīng)用，解決了常規(guī)方法中試劑需低溫保存運(yùn)輸以及試劑反復(fù)凍融可能會影響檢測結(jié)果的問題，因此，該方法非常適用于基層養(yǎng)殖場現(xiàn)場檢測。另外，該方法可同時(shí)檢測H5 和H7 亞型AIV，大大減少了成本和人力。所配套的熒光RT-PCR 循環(huán)儀體積小、重量輕，僅約2.5 kg，便于隨身攜帶進(jìn)行現(xiàn)場檢測。

綜上所述，本研究通過設(shè)計(jì)和優(yōu)化特異性引物和探針，巧妙地將雙重?zé)晒釸T-PCR 技術(shù)、凍干技術(shù)以及微芯片技術(shù)相結(jié)合，最終建立了可有效鑒別檢測H5 亞型和H7 亞型HPAIV 的新型檢測方法。應(yīng)用該技術(shù)對臨床采集的樣品進(jìn)行檢測后證實(shí)，該方法敏感、特異、簡便、快速，具有廣闊的市場開發(fā)和應(yīng)用前景。