矮膜苞芹藥材鑒定及含量測定研究

胡江蘭 王素芳 朱金芳 帕爾哈提·多力坤 羅蒙

摘要：目的? 建立矮膜苞芹藥材的鑒定及含量測定方法，為塔什庫爾干矮膜苞芹藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立與資源開發(fā)利用提供依據(jù)。方法? 對10批矮膜苞芹的藥材性狀、顯微特征進(jìn)行觀察描述;參照2015年版《中華人民共和國藥典》方法對矮膜苞芹的水分、灰分、浸出物、揮發(fā)油進(jìn)行測定;以木犀草素為對照品，建立矮膜苞芹的薄層鑒別方法及反相高效液相色譜含量測定方法。結(jié)果? 對矮膜苞芹的藥材性狀和顯微特征進(jìn)行了描述;薄層色譜斑點(diǎn)清晰、無拖尾，特征性強(qiáng);檢查項(xiàng)中初步擬定水分不得過8%，總灰分不得過15%，酸不溶性灰分不得過4%，水溶性浸出物不得少于24%，醇溶性浸出物不得少于13%，揮發(fā)油不得少于1.5%;建立了矮膜苞芹中木犀草素的含量測定方法，并根據(jù)測定結(jié)果暫定本品含木犀草素不得少于0.3 mg/g。結(jié)論? 本研究建立的方法操作簡便，準(zhǔn)確性、重復(fù)性好，穩(wěn)定可靠，可用于控制矮膜苞芹藥材的質(zhì)量。

關(guān)鍵詞：矮膜苞芹;鑒定;木犀草素;含量測定

中圖分類號：R284.1??? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2019）10-0066-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.10.015????? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract： Objective To establish the identification and content determination method for Hymenoleana nana medicinal herbs; To provide a scientific basis for the establishment of quality standards and resource development and utilization of the medicinal herbs in Tashkurgan. Methods The medicinal properties and microscopic characteristics of 10 batches of Hymenoleana nana were observed and described. The water， ash， leachate and volatile oil of Hymenoleana nana were determined according to Pharmacopoeia of China， 2015 edition. The TLC method and RP-HPLC of Hymenoleana nana were established with luteolin as reference substance. Results The medicinal properties and microscopic characteristics of Hymenoleana nana were described. The TLC were clear and without tailing， and the characteristics were strong. The limit for moisture， total ash and acid-insoluble ash was no more than 8%， 15%， 4%， water-soluble leaching materials， soluble extract， and volatile oil was no less than 24%， 13%， and 1.5%， respectively. The determination method of the content of luteolin in the Hymenoleana nana was established， and the results of the determination were tentatively determined that the product contains luteolin no less than 0.3 mg/g. Conclusion The established method is simple， accurate， reproducible， stable and reliable， which can be used to control the quality of Hymenoleana nana.

Keywords： Hymenoleana nana; identification; luteolin; content determination

矮膜苞芹Hymenoleana nana Rupr.俗名庫魯木提，為傘形科棱子芹屬高山膜苞芹亞屬多年生草本植物，主產(chǎn)于新疆塔什庫爾干。目前國內(nèi)對矮膜苞芹研究較少且大多為藥理研究，如降血壓[1]、降血糖[2]等。有文獻(xiàn)報(bào)道采用HPLC對矮膜苞芹中木犀草素和柚皮苷含量進(jìn)行測定[3]，《新疆植物志》僅有對其原植物性狀的描述[4]，未見關(guān)于其質(zhì)量控制方面的研究。本研究對塔什庫爾干10批矮膜苞芹的藥材性狀、顯微特征進(jìn)行描述，增加檢查項(xiàng)試驗(yàn)和薄層鑒別項(xiàng)，建立反相高效液相色譜（RP-HPLC）測定木犀草素含量方法，以期為矮膜苞芹藥材質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1? 儀器與試藥

LC-20A高效液相色譜儀（含DAD二極管陣列檢測器，日本島津公司），AL 104型精密電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司），TG16-W微量高速離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司），HH-S型電熱恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠），MOOTIC BA400型生物顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）。

矮膜苞芹，采自新疆塔什庫爾干，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院盛萍教授鑒定為傘形科植物矮膜苞芹Hymenoleana nana Rupr.的干燥全草，10批藥材（S1～S10）采集日期依次為2015-09-22、2016-07-30、2017-03-25、2017-06-22、2017-11-10、2018-03-12、2018-04-05、2018-05-12、2018-08-09、2018-08-24。木犀草素對照品（上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，批號130610，純度≥98%）、甲醇、磷酸為色譜純，羧甲基纖維素鈉、硅膠G254、三氯化鋁等均為分析純，水為純凈水。

2? 方法與結(jié)果

2.1? 藥材性狀

多年生草本植物，干燥全草長5～30 cm，主根較明顯，粗壯，質(zhì)堅(jiān)硬，不易折斷，圓柱形，直徑0.3～1 cm，表面附有鱗片，棕褐色或灰棕色，底部有細(xì)橫皺紋，基部有褐色或灰褐色殘存的葉鞘。莖彎曲不分枝，圓柱形，長0.8～10 cm，直徑0.1～0.5 cm，有條棱，帶紫紅色，質(zhì)脆，中空，易折斷。葉片輪廓卵狀長橢圓形，黃綠色至紅棕色，皺縮卷曲，質(zhì)脆易脫落。頂生復(fù)傘形花序腋生，直徑3～5 cm。花果期8個(gè)月，果圓形或橢圓形，有明顯隆起的縱棱，果梗長0.2～0.8 cm。氣微香，味微苦。見圖1。

2.2? 顯微鑒別

藥材粉末為灰棕色或灰綠色。導(dǎo)管多為螺紋導(dǎo)管，少見網(wǎng)紋導(dǎo)管和孔紋導(dǎo)管，直徑5～17.5 μm。淀粉粒單?；驈?fù)粒，直徑2～3 μm。木栓細(xì)胞較常見，多散在。草酸鈣方晶或簇晶存在薄壁細(xì)胞中。偶見氣孔，非腺毛單細(xì)胞長2～12.5 μm，腺毛長23～30 μm。花粉粒淡黃色，圓球形。見圖2。

2.3? 薄層色譜鑒別

分別精密稱取10批矮膜苞芹藥材粉末（過60目篩）1.0 g，置于25 mL錐形瓶中，加入甲醇10 mL，稱定質(zhì)量，于70 ℃加熱回流1 h，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，趁熱過濾，即為供試品溶液;另取2.5 mg木犀草素，加甲醇定容至10 mL，即得對照品溶液。按照2015年版《中華人民共和國藥典》（四部）通則0502薄層色譜法試驗(yàn)，精密吸取3 μL對照品溶液和5 μL供試品溶液，分別點(diǎn)于105 ℃活化后的同一以0.5% 羧甲基纖維素鈉為黏合劑硅膠G254薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸（18∶2∶1）為展開劑，預(yù)飽和20 min，展開后取出，晾干，噴以5%三氯化鋁乙醇溶液，于105 ℃加熱5 min，置紫外燈下365 nm處檢視。結(jié)果供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，均出現(xiàn)清晰的黃色熒光斑點(diǎn)。

2.4? 檢查項(xiàng)

按照2015年版《中華人民共和國藥典》（四部）通則0832水分測定第四法（甲苯法）進(jìn)行水分測定，結(jié)果10批藥材樣品中水分為6.81%～7.30%，平均值為6.81%。初步擬定矮膜苞芹藥材水分不得過8%。

按照2015年版《中華人民共和國藥典》（四部）通則2201浸出物測定法，水不溶性浸出物采用熱浸法測定，醇不溶性浸出物以70%乙醇為溶劑測定。結(jié)果10批藥材中水溶性浸出物為24.10%～30.05%，平均值為28.04%;醇溶性浸出物為12.30%～17.46%，平均值為15.40%。初步擬定矮膜苞芹藥材水溶性浸出物不得少于24%，醇溶性浸出物不得少于13%。

參照2015年版《中華人民共和國藥典》（四部）通則2302灰分測定法進(jìn)行灰分測定。結(jié)果10批藥材樣品總灰分為11.99%～14.47%，平均值為13.01%;酸不溶性灰分為2.93%～3.70%，平均值為3.27%。初步擬定矮膜苞芹藥材總灰分不得過15%，酸不溶性灰分不得過4%。

參照2015年版《中華人民共和國藥典》（四部）通則2204揮發(fā)油測定法進(jìn)行揮發(fā)油測定，結(jié)果10批藥材樣品揮發(fā)油為1.5%～2.09%，平均值為1.80%。初步擬定矮膜苞芹藥材揮發(fā)油不得少于1.5%。

10批矮膜苞芹水分、灰分、浸出物、揮發(fā)油測定結(jié)果見表1。

2.5? 木犀草素含量測定

2.5.1? 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：甲醇-0.2%磷酸水溶液（75∶25）;檢測波長：350 nm;流速：0.6 mL/min;柱溫：30 ℃;進(jìn)樣量：20 μL。

2.5.2? 對照品溶液制備

精密稱取木犀草素對照品適量，加甲醇溶液制成濃度為13.32 μg/mL的對照品溶液。

2.5.3? 供試品溶液制備

精密稱取矮膜苞芹粉末1.0 g，加入20 mL甲醇，稱定質(zhì)量，于70 ℃加熱回流2 h，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.5.4? 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取上述對照品溶液、供試品溶液適量，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，色譜圖見圖3。結(jié)果樣品中木犀草素與其他組分能夠基線分離，分離度>2，理論塔板數(shù)>3000。

2.5.5? 線性關(guān)系考察

精密量取“2.5.2”項(xiàng)下對照品溶液，用甲醇分別配制成濃度為0.33、0.66、2.21、4.41、5.73、8.20 μg/mL的系列濃度，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以對照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=12 056X-71 489（r=0.999 9）。結(jié)果表明，木犀草素在6.6～164 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.6? 精密度試驗(yàn)

取對照品溶液（5.73 μg/mL）適量，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果木犀草素峰面積RSD=0.25%，表明儀器精密度良好。

2.5.7? 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.5.3”項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫放置0、1、2、4、6、8、12、24 h，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果木犀草素含量RSD=0.19 %，表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5.8? 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批矮膜苞芹藥材粉末6份，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果木犀草素的含量RSD=1.95%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5.9? 加樣回收率試驗(yàn)

取木犀草素含量為1.52 mg/g的矮膜苞芹藥材樣品9份，每份約0.5 g，置錐形瓶中，分別加入高、中、低濃度的對照品溶液，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果平均加樣回收率為99.10%，RSD=1.81%，表明回收率良好，準(zhǔn)確度高，見表2。

2.5.10? 樣品含量測定

取10批藥材樣品粉末，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，平行測定3次，記錄峰面積并計(jì)算木犀草素含量。結(jié)果10批矮膜苞芹中木犀草素含量分別為1.51、1.50、1.52、0.34、1.18、1.55、0.76、0.78、1.87、1.58 mg/g，表明木犀草素含量差異較大?？紤]藥材采收時(shí)間不同、生長年限不同，參考10批藥材木犀草素含量測定結(jié)果，暫擬定矮膜苞芹藥材中木犀草素的含量不少于0.3 mg/g。

3? 討論

本研究參考棱子芹屬植物鑒別方法對矮膜苞芹進(jìn)行鑒別。性狀鑒別項(xiàng)下，基部殘存的葉鞘、頂生復(fù)傘形花序腋生，以及果圓形或橢圓形，有明顯隆起的縱棱，可作為鑒別依據(jù)。顯微鑒別項(xiàng)下，螺紋導(dǎo)管及草酸鈣方晶多而明顯，可作為鑒別依據(jù)。

在薄層定性研究中，曾以聚酰胺薄膜和薄層板在多個(gè)展開劑下展開進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)在薄層色譜中展開得到的木犀草素斑點(diǎn)清晰、單一，且無拖尾。以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸（8∶5∶0.5）、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（4∶3∶2）、甲苯-乙酸乙酯-甲醇（5∶2∶2）及三氯甲烷-甲醇-甲酸（18∶2∶1）為展開劑，最后選擇三氯甲烷-甲醇-甲酸（18∶2∶1）為展開劑，所得薄層斑點(diǎn)清晰，Rf值介于0.2～0.5，且無拖尾現(xiàn)象。

參考已報(bào)道的木犀草素含量測定方法[5-8]，本試驗(yàn)考察了甲醇-0.2%磷酸水溶液（75∶25）、乙腈-0.4%磷酸（24∶76）和甲醇-0.2%乙酸水溶液梯度洗脫3種流動相，檢測波長分別為254 nm和350 nm，流速分別為0.6、0.8、1.0 mL/min，經(jīng)多次篩選，優(yōu)化矮膜苞芹中木犀草素含量測定的色譜條件為：流動相為甲醇-0.2%磷酸（75∶25），流速0.6 mL/min，檢測波長350 nm，出峰時(shí)間快，峰形對稱，分離度>2。本方法簡便，穩(wěn)定性、重復(fù)性好，為塔什庫爾干矮膜苞芹質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供了一定的依據(jù)。本研究不同批次藥材中檢測出的木犀草素含量差異較大，可能與采收時(shí)間、采收方式、貯存時(shí)間等有關(guān)。

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（收稿日期：2018-01-10）

（修回日期：2018-01-31;編輯：陳靜）