兔心肺轉流模型中乙醛脫氫酶2活化的心肌保護研究

鄒麗華，劉晉萍，張 浩，童媛媛，唐 躍

1 材料與方法

1.1 實驗耗材及試劑 膜式氧合器（Terumo baby Fx05，日本 Terumo 公司），雙頭滾壓泵（德國 St?ckert公司），氣管導管（美國Covidien公司），HTK液（批號：1208621，德國kohler化學制藥公司），20 G中心靜脈導管（中國深圳益必達公司）。Alda-1（25 mg，美國Sigma公司），為ALDH2特異性激動劑，經心肌灌注旁路給藥，劑量為 8 mg／kg［4］。

1.2 實驗動物及分組 新西蘭白兔15～20周齡，體重2～3.5 kg，經動物倫理委員會批準（2013-4-150-GZR），由阜外醫(yī)院動物實驗中心提供。21只新西蘭白兔隨機分CPB不停跳組（C組，n＝7）、停跳組（CA 組，n＝7）、Alda-1組（CAA 組，n＝7）。 另21只新西蘭白兔作為供血兔，用作CPB管路預充，盡管新西蘭兔存在血型，但抗原性較弱，因此同一品種的兔血不會發(fā)生溶血反應［5］。所有動物術前禁食6 h，禁飲 2 h。

1.3 建立新西蘭兔CPB模型 新西蘭兔入室稱重，耳緣靜脈置管開放靜脈通路，2.5%戊巴比妥鈉3～4 ml進行麻醉誘導后，經口氣管插管（3.5#）行機械通氣，設定氧濃度35%，通氣量1 L／min，潮氣量約 35～40 ml、呼吸頻率 30～35 次／min、吸呼比1∶1.5。切開右腹股溝，右股動脈22 G套管針穿刺置管持續(xù)監(jiān)測動脈血壓，監(jiān)測心電圖（electrocardiography，ECG）、心率。16 G套管針置入右腋動脈，用于CPB動脈灌注。中心靜脈導管（20 G）置入左腋動脈，尖端位于主動脈根部作為停搏液灌注管路。正中開胸暴露右心房，切開右心房，插入帶側孔的靜脈插管（16 Fr）作為靜脈引流，調整靜脈插管位置，確保引流通暢后7-0尼龍線固定。若操作中發(fā)現(xiàn)實驗兔存在左腋動脈解剖變異或置管失敗導致出血，則立即止血后正中開胸，經主動脈根部置入22 G套管針并荷包縫合。

CPB管路預充液由50 ml新西蘭白兔新鮮全血、5 ml復方電解質注射液（勃脈力）、10 ml琥珀酰明膠、5 ml碳酸氫鈉注射液組成，實驗兔全身肝素化（400 IU／kg）且ACT＞480 s后開始CPB，維持流量100～ 120 ml／（kg·min），PaO2100 ～ 300 mm Hg，PaCO235～45 mm Hg。C組行常規(guī)CPB且心臟不停跳，CA組及CAA組進行CPB及心臟停跳處理，即肛溫降至30℃后阻斷升主動脈，灌注4℃ HTK液，劑量為 40 ml／kg，灌注起始壓力控制在 80～100 mm Hg，灌注維持壓力為40～60 mm Hg，灌注時間4～5 min，吸走右心房HTK液避免回收至儲血室引起血液稀釋，心臟停跳后表面覆蓋冰屑。CPB期間肛溫維持在28℃左右，緩慢復溫至30℃后開放主動脈，阻斷時間為120 min。開放主動脈后行全流量輔助循環(huán)，時間約60 min，復溫至直腸溫36℃以上調整CPB流量，生命體征平穩(wěn)后停機，實驗觀察至心臟恢復灌注120 min（CPB實驗流程見圖1）。

圖1 兔CPB實驗流程示意圖

1.4 監(jiān)測指標及取材 在CPB開始前（T1）、阻斷前（T2）、阻斷 120 min（T3）、開放后 5 min（T4）、停機后（T5）五個時點采集股動脈全血3 ml行血氣分析及心肌型肌酸激酶同功酶（MB isoenzyme of creatine kinase，CKMB）檢測。血樣在4℃下4000 rpm離心15 min，取上清液于-20℃冰箱保存。經心尖置入左心室測壓管，連接生理多導儀（RM-6000型）監(jiān)測心功能，記錄三組動物實驗終點時左室壓力形成最大速率（+dP／dtmax）、最小速率（-dP／dtmin）、左室收縮末壓（left ventricular end systolic pressure，LVESP）、左室舒張末壓（left ventricular end diastolic pressure，LVEDP）。

實驗兔在測定心功能后，取左心室心肌組織于-80℃冰箱保存。采用比色法檢測ALDH2活性［2］，采用免疫印跡法（Western blot）檢測心肌組織4-HNE、MDA的表達，采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測ALDH2、氧化型與還原型谷胱甘肽（GSH／GSSG）、蛋白羰基（protein carbonyl，PC）、血清 CKMB 含量。

1.5 統(tǒng)計方法 計量資料以均數(shù)±標準差表示，計數(shù)資料以例數(shù)（百分比）表示。單因素方差分析用于三組間比較，兩兩比較采用LSD法。血清CKMB采用紅細胞比容進行校正，采用重復測量ANOVA進行分析。數(shù)據采用SPSS 21.0進行統(tǒng)計分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 一般資料 所有實驗兔均完成CPB模型建立，三組間實驗兔的年齡、體重、CPB時間不存在統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；CA組和CAA組間降溫時間、復溫時間、最低肛溫、開放后室顫發(fā)生率無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。 見表 1。

表1 實驗動物的基礎資料（n＝7）

2.2 ALDH2含量及活性 ALDH2含量 C組為（45.93±2.86） μg／ml，CA 組為（44.89±5.38）μg／ml，CAA 組為（43.54±6.50）μg／ml，三組間比較無統(tǒng)計學差異（F＝0.379，P＝0.690）。 ALDH2 活性 C組為（2.85±0.33）U／mg，三組間比較存在統(tǒng)計學差異（F＝16.706，P＜0.001），CA 組較 C 組明顯減低（P＜0.001），CAA 組較 CA 組明顯增加（P＜0.001）。見圖2。

消防用水儲存于生產新水水池內，同時采取保證消防水不做他用的措施。廠區(qū)內大多為丁、戊類單層廠房，根據規(guī)范要求設置室內外消火栓給水系統(tǒng)，水池出水可滿足消防供水壓力。從消防水池設消防給水管網至廠區(qū)。

圖2 心肌ALDH2活性

2.3 醛類及心肌氧化應激指標 CA組較C組心肌4-HNE及MDA含量明顯增加（P＜0.001）。Alda-1的應用使心肌醛類明顯下降，CAA組與CA組相比存在統(tǒng)計學差異（P＜0.005），表明心肌 ALDH2活化加強4-HNE、MDA的清除（圖3A-B）。

氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）為谷胱甘肽（glutathione，GSH）氧化反應生成產物，GSH／GSSG可反映心肌氧化應激水平。GSH／GSSG CA組較C組明顯減少（P＝0.007）表明心肌缺血再灌注期間GSH消耗增加，CAA組較CA組明顯增加（P＝0.028），表明Alda-1激活ALDH2后氧化應激得以改善（圖4）。

2.4 心肌損傷指標 三組間不同時點CKMB存在統(tǒng)計學差異［重復測量方差分析（ANOVA）：F＝25.402，P＜0.001］，時間與分組不存在交互效應（F＝2.614，P＝ 0.057），三組間 CKMB 存在統(tǒng)計學差異（F＝5.271，P＝0.016），CKMB 水平 CA 組顯著高于C組（P＝0.006），Alda-1減輕 CKMB 釋放，CAA組CKMB水平顯著低于CA組（P＝0.028）（圖5）。

PC為心肌細胞氧化應激損傷指標，本研究發(fā)現(xiàn)CA組與C組相比PC水平明顯升高（P＝0.007），CAA組 PC水平較 CA組明顯降低（P＝0.012）（圖 6）。

圖3 4-HNE及MDA表達

圖4 GSH／GSSG水平

圖5 不同時點血清CKMB水平

圖6 三組心肌蛋白PC比較

2.5 心功能指標 停機后dp／dtmaxCA組較C組降低（P＝0.032），Alda-1改善心肌收縮功能，CAA 組dp／dtmax較 CA 組明顯增加（P＝0.040），三組間 dp／dtmin無顯著統(tǒng)計學差異（圖7）。心率和平均動脈壓、LVEDP、LVESP在三組間無統(tǒng)計學差異（見表2）。

圖7 三組心功能變化比較

表2 血流動力學及心功能指標（n＝7，±s）

表2 血流動力學及心功能指標（n＝7，±s）

項目 C組 CA組 CAA組 P值平均動脈壓（mm Hg） 80±9 78±10 83±10 0.697心率（次／min） 220±10 200±16 207±25 0.149 LVEDP（mm Hg） 10.9±2.8 10.4±3.4 10.6±2.8 0.964 LVESP（mm Hg） 95.9±12.3 92.6±10.1 93.7±14.1 0.880 dp／dtmax（mm Hg／s） 1076±117 748±115 1059±425 0.045 dp／dtmin（mm Hg／s） -921±125 -581±88 -651±37 0.184

3 討 論

CPB心臟手術期間主動脈的阻斷與開放使得心肌難以避免缺血再灌注損傷，目前多種心肌保護液應用于臨床，但世界各地心肌保護策略迥異，如何優(yōu)化CPB心肌保護策略仍是臨床關注的重要問題［6］。陳燕等在HTK液中添加依布硒啉，發(fā)現(xiàn)依布硒啉可明顯減輕心肌的氧化應激，保護心肌線粒體結構，防止早期凋亡事件發(fā)生［7］。氧化應激過程中產生的ROS可直接或間接損傷脂質、蛋白質、DNA等［8-9］，不飽和脂肪酸在ROS作用下發(fā)生過氧化反應生成有毒醛類，4-HNE占脂質過氧化產物的95%。醛類物質可加合到蛋白質、DNA等大分子物質，進而引起后者結構、功能變化，此外醛類物質還可作為自由基的第二信使發(fā)揮毒性作用［1］。研究表明，有毒醛類與心肌抗氧化能力減弱、心功能損傷顯著相關［10-11］。

ALDH2為醛類氧化的關鍵酶，可將醛類氧化生成無活性乙酸排出體外，進而起到解毒作用。心肌ALDH2活性與低溫、毒性醛類以及個體差異有關。大鼠Langendorff離體心臟灌流模型中觀察到，缺血心肌的ALDH2活性在4℃低溫下持續(xù)下降，1 h后為缺血前60%～70%，2 h后下降至缺血前的20%～30%，心臟恢復常溫且血供恢復1 h后ALDH2活性才上升至缺血前水平［2］。其次，有毒醛類既作為ALDH2底物，又是ALDH2強有效的抑制劑，可使ALDH2活性完全缺失。此外，ALDH2具有基因多態(tài)性，全世界ALDH2突變基因攜帶率約8%，而亞洲人則高達40%，表現(xiàn)為ALDH2活性缺失或下降，飲酒后出現(xiàn)紅臉效應［12］。研究發(fā)現(xiàn)攜帶ALDH2突變基因的紫紺型先天性心臟病患兒，心肌GSH含量代償性增加［13］。

Alda-1為ALDH2特異性激活劑，它暴露ALDH2酶解作用的關鍵部位，同時部分封堵ALDH2底物結合的通道，使其免受醛類對其活性的反向抑制而始終保持活性。Alda-1還可糾正突變型酶結合位點的結構異常，恢復突變型ALDH2的活性。研究證實其可通過提高ALDH2活性減輕心肌缺血損傷［4］。

本研究發(fā)現(xiàn)心肌缺血再灌注后GSH／GSSG下降，可能與缺血再灌注期間氧化應激水平增強，抗氧化物質GSH耗竭有關。Alda-1通過激活ALDH2，加強醛類的清除，減輕心肌氧化應激，改善抗氧化能力，GSH／GSSG明顯升高。氧化應激過程中，ROS通過氧化修飾氨基酸殘基形成PC，從而損傷蛋白功能，這些氨基酸包括蘇氨酸、脯氨酸、賴氨酸和精氨酸，因而蛋白PC可作為氧化應激損傷指標［12］。既往研究發(fā)現(xiàn)，4-HNE加合產物的形成伴隨蛋白PC化水平的增加，離體研究亦證實缺血期間心肌蛋白PC 水平迅速增加［2，14］。 本研究發(fā)現(xiàn)，ALDH2 活化后PC化水平明顯下降。

綜上所述，CPB期間心肌ALDH2活化可加強毒性醛類清除，增強心肌的抗氧化損傷能力，減輕心肌的氧化應激水平，改善心肌收縮功能。