不同左旋聚乳酸支架微結(jié)構(gòu)對(duì)心源干細(xì)胞增殖、分化的影響

鄭 輝，殷勝利，劉云奇，姜福清

支架的空間結(jié)構(gòu)對(duì)干細(xì)胞增殖和分化具有重大的影響，在心源干細(xì)胞中尤為突出，與心肌的特殊功能特性密切相關(guān)，為探索空間微結(jié)構(gòu)對(duì)干細(xì)胞增殖及分化的影響，本研究探求三種不同微結(jié)構(gòu)：層狀結(jié)構(gòu)（layered structure，LS）、球體結(jié)構(gòu)（spherical structure，MS）和納米纖維結(jié)構(gòu)（nanofiber structure，NS）的左旋聚乳酸（L-polylactic acid，PLLA）支架對(duì)心源干細(xì)胞增殖、分化的影響，綜合評(píng)價(jià)其效果，為組織工程材料微結(jié)構(gòu)的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 標(biāo)準(zhǔn)誤差（standard deviation，SD）的雄性大鼠（8周齡）1只、三種不同微結(jié)構(gòu)的PLLA支架分別56個(gè)、96孔板7個(gè)、細(xì)胞培養(yǎng)基（dulbecco＇s modified eagle medium，DMEM）培養(yǎng)液、免疫熒光染色劑、種子細(xì)胞懸浮液、顯微鏡、培養(yǎng)箱等。

1.2 方法

1.2.1 心源性干細(xì)胞的制備 取SD雄性大鼠（8周齡）1只，通過(guò)分離、培養(yǎng)、鑒定，最后得到心源性干細(xì)胞。

1.2.2 PLLA空間結(jié)構(gòu)的制備 利用 PLLA制備空間結(jié)構(gòu)，分別為 LS、MS、NS的支架，其截面積均為0.25 cm2，孔隙率≥94%。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組 取第三代培養(yǎng)的心源性干細(xì)胞（cardiac stem cells，CSCs）， 以 1×105／ml接種到7個(gè)96孔板中，每塊板選取中間24孔，分為3組，每組8孔，將消毒備用的三種材料支架置于孔中，加入 DMEM 培養(yǎng)液 100 μl，靜置 3～5 min后吸除孔中的DMEM培養(yǎng)液，隨后在各支架孔中加入制備好的種子細(xì)胞懸浮液120 μl，靜置3 min，顯微鏡下觀察。將種植好的支架放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h更換一次培養(yǎng)液，組間互為對(duì)照。

1.2.4 細(xì)胞活力檢測(cè) 采用MTT方法檢測(cè)細(xì)胞在第 24 h，48 h，72 h，96 h，120 h，144 h，168 h 的細(xì)胞活力，每組重復(fù)測(cè)量三次，取平均值。

1.2.5 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè) 取培養(yǎng)1周的三種微結(jié)構(gòu)材料支架，給以固定、破膜、敷一抗、二抗及DAPI染色后用抗熒光淬滅封片液封膠，行激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)。結(jié)果用confocal應(yīng)用軟件ZEN 2008行免疫熒光強(qiáng)度的分析，間接反應(yīng)出細(xì)胞分化情況分析。

1.2.6 電鏡掃描檢測(cè) 取培養(yǎng)1周的三種微結(jié)構(gòu)材料支架，經(jīng)固定、干燥、噴金后在掃描電鏡下檢查。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，數(shù)值均以±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用one-way anova分析方法分析數(shù)值，檢驗(yàn)水準(zhǔn)a＝1.0，P＜0.05 認(rèn)為是有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞的增殖情況 根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，三種不同微結(jié)構(gòu)的PLLA支架均能促進(jìn)心源性干細(xì)胞的增殖（表1），從第48 h后開(kāi)始，三種空間微結(jié)構(gòu)之間的增值率明顯不同（P＜0.05）。以生長(zhǎng)時(shí)間為橫軸，單位有效接觸面積內(nèi)吸光度的大小為縱軸繪制生長(zhǎng)曲線（圖1）。在a＝0.10檢驗(yàn)水準(zhǔn)下，球形檢驗(yàn)的P＝0.357，故沒(méi)有足夠的證據(jù)可以否認(rèn)該資料符合重復(fù)測(cè)量的方差分析條件，方差分析的結(jié)果表明，處理效應(yīng)與時(shí)間效應(yīng)的交互作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝1.678，P＝0.82），處理主效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝108.5，P＜0.001），時(shí)間主效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝18.38，P＜0.001），兩兩比較結(jié)果表明：吸光度均數(shù)隨著培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)而增加，并且相鄰時(shí)間點(diǎn)的增加差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均小于0.001）。

表1 三種不同微結(jié)構(gòu)中干細(xì)胞不同時(shí)間測(cè)得的吸光度（AU，±s）

材料類型 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 144 h 168 h LS 0.041±0.005 0.099±0.027 0.307±0.032 0.666±0.019 0.695±0.012 0.680±0.020 0.681±0.017 MS 0.081±0.007 0.263±0.030 0.706±0.068 1.178±0.037 1.063±0.041 1.138±0.031 1.221±0.014 NS 0.119±0.019 0.368±0.045 1.234±0.173 2.116±0.123 1.762±0.103 2.112±0.075 2.217±0.053

圖1 吸光度與時(shí)間的關(guān)系

2.2 激光掃描共聚焦顯微鏡結(jié)果 通過(guò)confocal應(yīng)用軟件，ZEN 2008對(duì)激光掃描共聚焦顯微鏡結(jié)果行免疫熒光強(qiáng)度的分析發(fā)現(xiàn)，三種微結(jié)構(gòu)材料上的心源性干細(xì)胞均有分化的心肌樣細(xì)胞（圖2），其中NS材料結(jié)構(gòu)中的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，其次為MS材料，最后為L(zhǎng)S材料，說(shuō)明心源性干細(xì)胞在三種微結(jié)構(gòu)材料上的分化情況，其效果最明顯的為NS，其次為MS，最差為L(zhǎng)S。

2.3 掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果 三種不同空間微觀結(jié)構(gòu)的支架中，心源性干細(xì)胞及分化的心肌樣細(xì)胞所分泌的細(xì)胞外基質(zhì)均比較豐富（圖3）。說(shuō)明三種材料中的細(xì)胞生長(zhǎng)和分化情況良好。

圖2 免疫熒光強(qiáng)度（×200）

圖3 掃描電鏡結(jié)果（15 Kv×1000倍）

3 討 論

心血管疾病的發(fā)病率及死亡率不斷升高，并出現(xiàn)年輕化的趨勢(shì)，其中以缺血性心肌病最為常見(jiàn)［1］，嚴(yán)重威脅著人的生存和生活質(zhì)量。對(duì)于缺血性心肌病的治療主要有內(nèi)科藥物、介入、外科手術(shù)及機(jī)械支持治療等，均存在一定的缺陷及不足［2］。隨著干細(xì)胞組織工程學(xué)的快速發(fā)展，為缺血性心肌病的治療帶來(lái)了新的希望［3］。

心臟組織工程通常應(yīng)用于疾病建模和藥物篩選［4］，其最終目的在于構(gòu)建出有生物功能活性的特異性心肌組織。心源性干細(xì)胞具有自我更新、克隆形成、多種分化潛能，并能在體內(nèi)外分化成心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，具有定向分化心臟細(xì)胞系的趨勢(shì)，具有治療缺血性心肌病的潛能［5-6］。影響心源性干細(xì)胞的增殖和分化因素包括：基因特性、培養(yǎng)條件及周圍生存環(huán)境及材料支架性質(zhì)［7-9］。其中材料支架固有特性可以影響組織工程心肌細(xì)胞的性能，如：細(xì)胞附著、肥大及雙核化，離子通道的重塑，心鈉素的釋放，生物力學(xué)應(yīng)力及結(jié)構(gòu)重構(gòu)等［10］。至今相關(guān)研究表明材料支架的整體宏觀和微觀孔隙度以及表面化學(xué)修飾均可誘導(dǎo)干細(xì)胞的定向分化［11-12］，但是不同空間微結(jié)構(gòu)的支架對(duì)干細(xì)胞增殖及定向分化的方面暫無(wú)比較性研究。本研究探索支架微結(jié)構(gòu)對(duì)心源性干細(xì)胞的影響，篩選性能較好的空間微結(jié)構(gòu)，促進(jìn)心臟組織的發(fā)展。

本次實(shí)驗(yàn)中的實(shí)驗(yàn)條件除材料的空間微結(jié)構(gòu)外，其余的所有條件基本相似，即實(shí)驗(yàn)中唯一的變量為不同的空間微結(jié)構(gòu)，空間微結(jié)構(gòu)不同而使細(xì)胞的有效接觸面積不同。NS材料中的細(xì)胞有效接觸面積及細(xì)胞增殖空間均少于其他兩種，但該結(jié)構(gòu)促進(jìn)細(xì)胞的增殖的效果較其他兩種材料好。通過(guò)免疫熒光染色在共聚焦顯微鏡下均可觀察到三種微結(jié)構(gòu)材料上的心源性干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化，支架微結(jié)構(gòu)促進(jìn)心源性干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化，其效果最明顯的為NS，其次為MS。細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)細(xì)胞的生存及改善細(xì)胞的生長(zhǎng)微環(huán)境，有利于干細(xì)胞的生存、生長(zhǎng)及分化，本實(shí)驗(yàn)中觀察到豐富的胞外基質(zhì)，說(shuō)明支架結(jié)構(gòu)能促進(jìn)心源性干細(xì)胞增殖分化并能促進(jìn)其細(xì)胞外基質(zhì)的分泌。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)比三種支架微結(jié)構(gòu)的優(yōu)劣，在PLLA的NS，MS，LS三種結(jié)構(gòu)中，NS可作為心肌組織工程優(yōu)先選擇的結(jié)構(gòu)之一。

本次實(shí)驗(yàn)中仍存在一定的不足，對(duì)于細(xì)胞增殖及分化的比例、最終分化的組織細(xì)胞情況、細(xì)胞功能結(jié)構(gòu)、支架性能及降解情況等需要進(jìn)一步深入研究。