乙醛脫氫酶1在乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達(dá)及其臨床意義

楊麗青，劉 威

(廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院，暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬廣州紅十字會(huì)醫(yī)院乳腺科，廣東 廣州 510220)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，具有高度異質(zhì)性，不同類型的乳腺癌治療效果、預(yù)后差異較大[1]。經(jīng)過規(guī)范的診治后，患者還是可能因?yàn)樽罱K的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移而死亡。因此，有人提出腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)理論，期待能解決惡性腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的問題。CSCs理論認(rèn)為，目前的治療方法針對的靶細(xì)胞是已經(jīng)分化的腫瘤細(xì)胞，并不能殺滅具有自我更新能力的CSCs，殘留的少量CSCs是腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的原因[2]。乙醛脫氫酶1(aldehyde dehydrogenase 1，ALDH1)是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP)依賴性酶，具有催化乙醛氧化為乙酸的作用，在干細(xì)胞中呈現(xiàn)較高活性，是干細(xì)胞生長、分化的重要物質(zhì)[3]。2007年有研究者利用ALDH1鑒定和分離出乳腺癌干細(xì)胞，為乳腺癌的研究開辟了新方向[4]。目前的研究結(jié)果認(rèn)為，ALDH1的表達(dá)與乳腺癌患者的預(yù)后相關(guān)，是乳腺癌干細(xì)胞較理想的標(biāo)志物之一[5]。但是，ALDH1在乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達(dá)及其臨床意義的相關(guān)研究較少。因此，本研究檢測了ALDH1在乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達(dá)，探討其在乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中表達(dá)的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2012年2月至2014年1月在廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院行乳腺癌手術(shù)患者的臨床資料，其中乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)患者47例，未轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)患者15例。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)女性；(2)原發(fā)乳腺浸潤性導(dǎo)管癌，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；(3)術(shù)前未進(jìn)行抗腫瘤治療；(4)患者行單側(cè)乳腺癌改良根治術(shù)；(5)術(shù)后按相關(guān)指南進(jìn)行規(guī)范診療，保存完整的臨床病案資料。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者37～85歲，中位年齡60歲；淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移患者40～78歲，中位年齡58歲，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和未轉(zhuǎn)移患者年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。

1.2 主要試劑與儀器兔抗人ALDH1多克隆抗體購自英國Abcam公司，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)、二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)購自北京索萊寶科技有限公司；光學(xué)顯微鏡購自日本尼康公司。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)和未轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中ALDH1的表達(dá)將ALDH1多克隆抗體稀釋100倍。取常規(guī)石蠟包埋的淋巴結(jié)組織標(biāo)本連續(xù)切片，片厚4 μm。烤片、脫蠟、水化。切片放入微波爐加熱的乙二胺四乙酸抗原修復(fù)液(150稀釋) 中進(jìn)行抗原修復(fù)，加熱沸騰后持續(xù)10 min，隨后自然冷卻至常溫。置于體積分?jǐn)?shù)3%H2O2中室溫孵育15 min。用山羊血清進(jìn)行封閉，室溫下孵育 30 min。滴加適量的ALDH1抗體，4 ℃冰箱濕盒內(nèi)過夜。次日于37 ℃恒溫箱中復(fù)溫30 min。滴加適量的二抗，37 ℃恒溫箱孵育30 min。滴加DAB顯色劑(150配制)，控制反應(yīng)時(shí)間(約20 s)，自來水沖洗5 min。蘇木精復(fù)染、自來水沖洗5 min。鹽酸乙醇分化約5 s，自來水沖洗20 min。梯度乙醇脫水，封片。參照FROMOWITZ等[6]的評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行免疫組織化學(xué)評分，以鏡下目標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性表達(dá)，陰性表達(dá)細(xì)胞呈淡藍(lán)色，400倍高倍鏡下根據(jù)觀察到的陽性細(xì)胞染色程度和陽性細(xì)胞比例進(jìn)行半定量分析。陽性細(xì)胞所占比例評分：無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞所占比例<25%為1分，≤25%陽性細(xì)胞所占比例≤50%為2分，50%<陽性細(xì)胞所占比例≤75%為3分，陽性細(xì)胞所占比例>75%為4分；染色程度：無染色計(jì)為0分，淡黃色計(jì)為1分，棕黃色計(jì)為2分，棕褐色計(jì)為3分。二者得分總和即為最后評分，最終評分0～1分為陰性，2～7分為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌患者淋巴結(jié)中ALDH1表達(dá)情況結(jié)果見圖1。47例乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中ALDH1陽性表達(dá)率為36.17%(17/47)；15例未轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中ALDH1陽性表達(dá)率為6.67%(1/15)；轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中ALDH1陽性表達(dá)率顯著高于未轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.804,P<0.05)。

A:轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)；B：未轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)。

圖1 乳腺癌患者淋巴結(jié)中ALDH1表達(dá)情況(免疫組織化學(xué)染色，×400)

Fig.1 Expression of ALDH1 in lymph node of breast cancer patients(immunohistochemistry staining,×400)

2.2 乳腺癌患者轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中ALDH1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系結(jié)果見表1。乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中ALDH1表達(dá)與患者腫瘤臨床分期、腫瘤直徑、雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone，PR)、人類表皮生長因子受體2 (human epidermal growth factor receptor 2，HER-2)、Ki-67表達(dá)情況及原發(fā)灶分子分型無關(guān)(P>0.05)，與腫瘤分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)有關(guān)(P<0.05)。

表1 ALDH1在乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

Tab.1 Relationship of the expression of ALDH1 in metastatic lymph nodes of breast cancer and clinicopathological features of patients

臨床病理特征nALDH1陽性/例(%)ALDH陰性/例(%)χ2P臨床分期 II期228(36.4)14(63.6)0.0010.974 III期259(36.0)16(64.0)腫瘤直徑 ≤2 cm164(25.0)12(75.0) 2～5 cm187(38.9)11(61.1)1.4840.476 >5 cm136(46.2)7(53.8)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù) 1～3個(gè)349(26.5)25(73.5)5.0090.025 ≥4個(gè)138(61.5)5(38.5)腫瘤分級 I級152(13.3)13(86.7) II級145(35.7)9(64.3)6.3190.042 III級1810(55.6)8(44.4)ER +3512(34.3)23(65.7)0.2110.646 -125(41.7)7(58.3)PR +3313(39.4)20(60.6)0.4990.480 -144(28.6)10(71.4)HER-2 +126(50.0)6(50.0)1.3350.248 -35 11(31.4)24(68.6)Ki-67 ≥14%3614(38.9)22(61.1)0.4920.483 <14%113(27.3)8(72.7)原發(fā)灶分子分型 Luminal A 型123(25.0)9(75.0) Luminal B 型133(23.1)10(76.9)3.6330.304 HER2 過表達(dá)型115(45.5)6(54.5) 三陰型116(54.5)5(45.5)

2.3 生存分析結(jié)果見圖2。乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中ALDH1陽性表達(dá)患者和ALDH1陰性表達(dá)患者各死亡3例，5 a生存率分別為82.4%(14/17)、90.0%(27/30)，乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)ALDH1陽性表達(dá)患者與ALDH1陰性表達(dá)患者5 a生存率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.576，P>0.05)。

A:轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)；B：未轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)。

圖2 ALDH1表達(dá)陽性患者和ALDH1表達(dá)陰性患者生存期

Fig.2 Survival time of ALDH1 positive patients and ALDH1 negative patients

3 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，乳腺癌是世界范圍內(nèi)女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤[7]。中國女性乳腺癌發(fā)病率和病死率低于歐美發(fā)達(dá)國家，但由于中國龐大的人口基數(shù)，每年仍有約27.9萬的乳腺癌新發(fā)病例[8]。手術(shù)、化學(xué)治療、內(nèi)分泌治療、靶向治療、放射治療、免疫治療及綜合治療是乳腺癌的主要治療方法。經(jīng)過規(guī)范、合理的診治，乳腺癌的預(yù)后有了明顯改善，但最終還是有部分患者因出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移而死亡。因此，有學(xué)者提出CSCs理論，期待能解決惡性腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的問題。

CSCs理論認(rèn)為，乳腺癌細(xì)胞中存在數(shù)量極少的、具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞亞群，這類細(xì)胞亞群稱之為乳腺癌干細(xì)胞，乳腺癌干細(xì)胞與乳腺癌的耐藥、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[9-11]。研究表明，多種實(shí)體腫瘤干細(xì)胞和造血干細(xì)胞中ALDH1呈高表達(dá)[12-13]。國內(nèi)有學(xué)者對12個(gè)研究進(jìn)行薈萃分析，結(jié)果顯示，ALDH1在乳腺癌組織中的表達(dá)與其組織學(xué)分化差、ER 受體陰性、PR 受體陰性、HER-2陽性呈正相關(guān)，且與總生存率呈負(fù)相關(guān)[5]，DEMIR等[14]研究證實(shí)了該結(jié)果。總之，現(xiàn)有的研究認(rèn)為，ALDH1在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，參與乳腺癌干細(xì)胞的分化，是乳腺癌干細(xì)胞較理想的標(biāo)志物之一。

但是，ALDH1在乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達(dá)及其臨床意義未明。目前，國內(nèi)外只有少量關(guān)于乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中ALDH1表達(dá)情況的研究。SAKAKIBARA等[15]的研究結(jié)果提示，乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中ALDH1的高表達(dá)與患者不良預(yù)后相關(guān)；NOGAMI等[16]研究發(fā)現(xiàn)，ALDH1在腋窩轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達(dá)與原發(fā)灶組織學(xué)分級、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)相關(guān)，而且在1～3個(gè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者中與不良預(yù)后相關(guān)。國內(nèi)有研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌前哨淋巴結(jié)中ALDH1的表達(dá)與乳腺癌原發(fā)灶的病理學(xué)類型、病理學(xué)分級、ER、PR、HER-2、分子分型、患者預(yù)后均無關(guān)，與腫瘤的腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)[17]。

本研究結(jié)果顯示，ALDH1乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的陽性表達(dá)率顯著高于未轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)，提示ALDH1可能參與乳腺癌的轉(zhuǎn)移。分析乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中ALDH1的表達(dá)情況與患者臨床病理特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中ALDH1的表達(dá)與患者的臨床分期、腫瘤直徑、原發(fā)灶分子分型、ER、PR、HER-2及Ki-67的表達(dá)情況無關(guān)，與腫瘤分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)有關(guān)，這與NOGAMI等[16]的研究結(jié)果一致。生存分析結(jié)果顯示，乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中ALDH1陽性表達(dá)患者與ALDH1陰性表達(dá)患者5 a生存率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中ALDH1的表達(dá)與患者預(yù)后無關(guān)。本結(jié)果與NOGAMI等[16]的研究結(jié)論不一致，推測可能是本研究樣本量較小，隨訪時(shí)間不夠長導(dǎo)致的。未來期待擴(kuò)大樣本量、延長隨訪時(shí)間來進(jìn)一步研究。