microRNA-21靶向cdc4影響人卵巢癌干細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的價值

譚長安 郭金珠

卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)是常見的婦科腫瘤，發(fā)現(xiàn)時大多已處于疾病晚期，因此死亡率比較高[1-2]。并且卵巢癌干細(xì)胞具有高度惡性的生物學(xué)行為，容易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重威脅著婦女的身心健康[3-4]。放化療為晚期卵巢癌的常見治療方法，但是治療后容易復(fù)發(fā)[5]。microRNA(miRNA)是近年來在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類長度約為22個核苷酸的非編碼的小RNA分子，miRNA可通過靶向作用于多種腫瘤抑制基因，對腫瘤肝細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移等有調(diào)節(jié)作用[6-7]。miRNA在腫瘤中的表達往往是失調(diào)的，與其他腫瘤相似，卵巢癌也有其特異的miRNA表達譜，miRNA可通過靶向作用于多種腫瘤抑制基因或轉(zhuǎn)移抑制基因，調(diào)節(jié)卵巢癌的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[8]。MicroRNA-21(miR-21)是在肺癌、肝癌、乳腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、胃癌等多種癌組織中過高表達[9]，在腫瘤各個階段演變過程中，伴隨有信號傳導(dǎo)基因、抑癌基因、致癌基因等異常表達，也存在凋亡受阻、增殖侵襲、失控、轉(zhuǎn)移等異常變化等[10]。細(xì)胞分裂周期蛋白4(cell division cyclin 4，cdc4)是1種細(xì)胞分裂周期蛋白質(zhì)，是控制細(xì)胞周期進入M期的關(guān)鍵因子之一，在真核生物的細(xì)胞有絲分裂中起重要調(diào)節(jié)作用[11]。本文具體探討了miR-21靶向cdc4影響人卵巢癌干細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的價值，希望為卵巢癌的防治提供可能的靶點?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000、凋亡試劑盒、Trizol、FBS胎牛血清、青霉素/鏈霉素、0.25%胰酶、CCK-8檢測試劑盒、DMEM培養(yǎng)液(美國GIBCO)，蛋白質(zhì)提取試劑、6×上樣緩沖液、ECL檢測試劑盒、蛋白BCA定量試劑盒(日本TaKaRa)，miR-21 mimics、miRNA陰性對照(NC)、miR-21 inhibitor(上海吉瑪)，IGF-1抗體、GAPDH抗體(美國abcam)；卵巢癌干細(xì)胞OVCAR3。

制冰機、低溫冰箱(日本SANYO)，細(xì)胞培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板、離心管(美國sigma)，臺式離心機(上海奧豪斯)，電泳儀(美國Bio-RAD)。

卵巢癌干細(xì)胞OVCAR3細(xì)胞株(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

實驗分組：miR-21 inhibitor組、miR-21 inhibitor NC組、miR-21 mimic組、miR-21 mimic NC組、blank組。

采用脂質(zhì)體細(xì)胞進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前1天，5000個/孔卵巢癌干細(xì)胞OVCAR3接種于96孔板上，細(xì)胞生長密度在24 h后約為80.0%，在100 μl的無血清培養(yǎng)基中加入6 pmol 的樣本(miR-21 inhibitor、miR-21 inhibitor NC、miR-21 mimic、miR-21 mimic NC)進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染體系終體積200 μl，轉(zhuǎn)染樣本的終濃度30 nM，每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔。

1.3 細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡檢測

在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h進行細(xì)胞活性的檢測，加入10 μl 的CCK-8試劑，孵育2 h，用酶標(biāo)儀測定每孔在波長為450 nm處的吸光度，計算相對增殖活性。同時將手記細(xì)胞重懸在AnnexinV 結(jié)合緩沖液中，稀釋至1×106個細(xì)胞/ml；取100 μl 細(xì)胞懸液加入和5 μl Alexa Fluor 488 Annexin V 工作液和1 μ 100 μg/ml 的PI，避光室溫孵育15 min；然后加入400 μl AnnexinV 結(jié)合緩沖液，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.4 細(xì)胞周期檢測

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h，取細(xì)胞樣本進行固定，用PBS洗2次，加入100 μl PBS后混勻，同時加入等體積的碘化丙錠染液低溫(4 ℃)混合，尼龍膜過濾后上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.5 cdc4的表達檢測

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h，收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，在冰上靜置30 min，使細(xì)胞充分裂解，4 ℃ 14 000 rpm 離心10 min，取上清蛋白液。使用BCA 法檢測蛋白樣品的濃度，經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵一抗、孵二抗、ECL發(fā)光等步驟，根據(jù)曝光所得條帶的灰度值分析cdc4蛋白的表達水平(actin為內(nèi)參)。

上述所有實驗重復(fù)三次，每個樣品取3個平行。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用統(tǒng)計軟件GraphPad prism 6.0與SPSS 22.00進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對比方法主要為方差分析、t檢驗、LSD-t檢驗等，檢驗水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染后miR-21表達水平對比

以blank組為參照，轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后，qRT-PCR檢測顯示mimic組、mimic NC組、inhibitor組、inhibitor NC組的miR-21的相對表達量分別為10.49±2.18，1.29±0.55，0.20±0.08，1.39±0.19，對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 細(xì)胞增殖與凋亡水平對比

轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后，mimic組比mimic NC組細(xì)胞的增殖活性下降，inhibitor組比inhibitor NC組細(xì)胞的增殖活性增強，對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；mimic組、mimic NC組、inhibitor組、inhibitor NC組、blank組凋亡率分別為(40.00±3.18)%、(18.19±2.01)%、(7.44±1.11)%、(18.11±1.86)%、(17.22±3.84)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同組別轉(zhuǎn)染后不同時間點的細(xì)胞增殖與凋亡水平對比

注：*為與相應(yīng)的NC組相比，P<0.05。

2.3 細(xì)胞周期狀況對比

轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后，mimic組的G0/G1期細(xì)胞數(shù)目顯著高于blank組與mimic NC組，S、G2/M期細(xì)胞數(shù)目顯著減少(P<0.05)。見表2。

2.4 cdc4蛋白表達水平對比

轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后，cdc4蛋白在mimic組、mimic NC組、inhibitor組、inhibitor NC組、blank組中的相對表達水平分別為0.45±0.22，1.45±0.14，3.89±0.11，1.66±0.33，1.74±0.32，對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 不同組別的細(xì)胞周期狀況對比

注：*為與相應(yīng)的NC組相比，P<0.05。

3 討論

卵巢癌是高度惡性的婦科腫瘤，在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)病率次于宮頸癌和乳腺癌，且其易發(fā)生廣泛的腹腔內(nèi)種植播散，臨床死亡率比較高[12]。雖然根治卵巢癌的方法是早期手術(shù)切除，但大部分患者在確診時已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，失去了手術(shù)治療的指征[13]。目前對于卵巢癌病理與預(yù)后因素的研究已日趨成熟，但是有關(guān)其分析發(fā)病機制方面沒有定論。

miRNA是1類內(nèi)源性的非編碼的小分子RNA，其參與細(xì)胞增殖、凋亡、腫瘤發(fā)生及侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成等過程，且具有重要的調(diào)控作用[14]。miRNA是重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，其可作為癌基因或抑癌基因發(fā)揮作用，特別是其異常表達可參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。miR-21 mimic的導(dǎo)入能夠模擬細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源性miR-21，建立miRNA過表達的模型；而miRNA inhibitor是可以與miR-21完全互補的反義寡核苷酸序列，轉(zhuǎn)染后可抑制miRNA的功能[15]。miRNA在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中存在直接調(diào)控作用，研究顯示卵巢癌組織中有35個miRNA的表達與正常對照標(biāo)本相比有統(tǒng)計學(xué)差異，其中31個miRNA呈現(xiàn)低表達[16]。本研究顯示過表達miR-21能抑制卵巢癌干細(xì)胞的增殖活性，增加細(xì)胞的凋亡。

miRNAs在腫瘤中的表達往往是失調(diào)的，與其他腫瘤相似。鼻咽癌鱗狀腫瘤也有其特異的miRNA表達譜，miRNAs可通過靶向作用于多種腫瘤抑制基因或轉(zhuǎn)移抑制基因，調(diào)節(jié)卵巢癌干細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[17]。卵巢癌的主要致病基因尚不清楚，而對卵巢癌相關(guān)基因定位，或?qū)ふ彝蛔兾稽c對卵巢癌發(fā)病機制起重要作用，有利于鼻咽癌的早期診斷[18]。有研究顯示卵巢癌中cdc4蛋白的表達顯著低于癌旁組織及正常組織，cdc4蛋白的表達與卵巢癌患者的性別、年齡、腫瘤部位無關(guān)，而與腫瘤浸潤深度、分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可成為早期診斷、判斷卵巢癌預(yù)后及浸潤轉(zhuǎn)移的生物學(xué)指標(biāo)[19-20]。本研究顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后，mimic組的G0/G1期細(xì)胞數(shù)目顯著高于blank組與mimic NC組，S、G2/M期細(xì)胞數(shù)目顯著減少(P<0.05)。表明miR-21可使大部分細(xì)胞分裂處于G0/G1期，但是在此過程中還有哪些原癌基因和抑癌基因的參與，還需要深入研究。

cdc4是控制細(xì)胞周期進入M期的關(guān)鍵因子之一，其表達量的變化與腫瘤的發(fā)生機制有關(guān)，已被發(fā)現(xiàn)是1種新的腫瘤相關(guān)抗原[21]。cdc4能促使cyclin E、c-Myc、c-Jun等癌基因蛋白類的降解，可成為腫瘤生物治療的新靶點[22]。miRNAs可通過與靶基因mRNA的特異性結(jié)合來降解mRNA或抑制蛋白的翻譯，miRNAs除參與腫瘤癌細(xì)胞的分化外，還在腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移過程過程中發(fā)揮重要作用[23]。本研究顯示轉(zhuǎn)染miR-21到卵巢癌干細(xì)胞48 h后，cdc4蛋白的表達量顯著降低。相關(guān)研究也顯示cdc4對腫瘤的發(fā)生起促進作用，很多腫瘤中存在cdc4的高表達，抑制cdc4表達可以起到抑癌作用[24]。不過本研究也有一定的缺陷，首先是研究樣本數(shù)目較少，其次雖然明確miR-21能抑制細(xì)胞增殖與促進細(xì)胞凋亡，但是其是否為卵巢癌的抑癌基因還有待深入分析。

綜上所述，過表達miR-21能抑制卵巢癌干細(xì)胞的增殖與促進細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，其具體機制可能是miR-21通過負(fù)調(diào)控cdc4的表達而實現(xiàn)。