血清miR-221、MMP-2、MMP-9聯(lián)合檢測對卵巢上皮癌的診斷意義

薛玲玲 馬會峰

卵巢癌是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌，而致死率卻位于女性生殖器官惡性腫瘤首位[1]。卵巢上皮癌約占卵巢惡性腫瘤的85%～90%，因其早期診斷困難，且易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者的五年生存率僅約20%[2]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA-221(microRNA-221，miR-221)與基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)在卵巢上皮癌患者體內(nèi)存在異常表達(dá)，且與卵巢上皮癌的發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移等過程密切相關(guān)[3-5]。在本次實(shí)驗(yàn)中，我們通過比較分析卵巢上皮癌患者與健康女性的血清miR-221、MMP-2、MMP-9水平，并分析三者與卵巢上皮癌臨床病理特征及發(fā)病風(fēng)險之間的關(guān)系，旨在尋找更穩(wěn)定有效的生物標(biāo)志物，以期為卵巢上皮癌的診斷提供新思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象的納入與基本資料采集

收取我院2012年9月至2017年12月確診的卵巢上皮癌患者210例為病例組，患者年齡37～73歲，平均年齡(48.6±10.9)歲。其中Ⅰ～Ⅱ期57例，Ⅲ～Ⅳ期患者153例。患者均為首次住院且經(jīng)病理學(xué)確診為卵巢上皮癌。卵巢上皮癌的分期參照國際婦產(chǎn)科聯(lián)合會制定的FIGO分期系統(tǒng)(2013)[6]。對照組來源于同期在我院行常規(guī)體檢的健康女性250例，年齡35～71歲，平均年齡(46.3±11.2)歲。由研究人員對研究對象的BMI、吸煙史、飲酒史等基本資料進(jìn)行采集。所有研究對象均排除其他系統(tǒng)惡性腫瘤、糖尿病、嚴(yán)重的心腦血管疾病及自身免疫性疾病。本研究的開展經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有納入對象均簽署了項(xiàng)目知情同意書。

1.2 血清miR-221、MMP-2和MMP-9水平的檢測

受試者禁食10 h以上，次日清晨由專業(yè)醫(yī)護(hù)人員使用含促凝劑采血管抽取靜脈血10 ml，血液標(biāo)本在1 h內(nèi)于4 ℃條件下以12 000 g離心力離心15 min，收集上層血清進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。

血清總RNA的提取按照血液RNA提起試劑盒(中國Bioteke公司)說明書步驟進(jìn)行。取提取的RNA，使用去除基因組逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(中國Takara公司)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用實(shí)時熒光定量PCR(Real-time PCR，RT-PCR)法檢測血清miR-221及內(nèi)參基因GAPDH表達(dá)水平。檢測過程中所用引物序列如下：miR-221上游引物：5'-AGTGTGTCATAGAGCTTCCTGTTTCATCTCCCAGT-3'下游引物：5'-TGGAACCAGGCCCCAGGGAATCTTTCAGCTGCATT-3'；GAPDH上游引物：5'-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3'，下游引物：5'-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3'；采用2-ΔΔCt法計算miR-221的相對表達(dá)量，△Ct值=目的基因Ct值-GAPDH Ct值。

血清MMP-2、MMP-9的檢測采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法，試劑盒由武漢默沙克生物科技有限公司提供，檢測儀器為多功能酶標(biāo)儀DR-3506(無錫華衛(wèi)德朗)，操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 研究對象的基本臨床資料與血清miR-221、MMP-2、MMP-9水平

病例組和對照組的臨床基本信息與血清miR-221、MMP-2、MMP-9水平，見表1。兩組在年齡、吸煙史、飲酒史等方面均無顯著差異(P>0.05)。相比于對照組，血清miR-221、MMP-2、MMP-9水平在卵巢上皮癌患者中顯著升高，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 研究對象的臨床基本信息與血清miR-221、MMP-2、MMP-9水平

2.2 血清miR-221、MMP-2、MMP-9水平與卵巢上皮癌臨床病理特征的關(guān)系

如表2所示，血清miR-221、MMP-2和MMP-9水平與卵巢上皮癌患者的年齡、BMI、吸煙史、飲酒史等因素均無顯著相關(guān)性(P>0.05)，而與卵巢上皮癌的FIGO分期顯著相關(guān)(P<0.05)，三者水平在Ⅲ～Ⅳ期卵巢上皮癌患者中的增高最為明顯。

表2 血清miR-221、MMP-2、MMP-9水平與卵巢上皮癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 ROC曲線分析

ROC曲線(圖1)分析顯示，血清miR-221、MMP-2和MMP-9在區(qū)分卵巢上皮癌與健康女性的AUC分別為：0.887(95%CI：0.822～0.951，P<0.001)、0.784(95%CI：0.701～0.866，P<0.001)、0.704(95%CI：0.613～0.995，P<0.001)；靈敏度和特異度分別為：79.7%/92.8%，63.8%/90.3%，49.3%/86.7%(圖1A/B/C)；診斷界值分別為：8.6(-log)、45.6 pg/ml和30.2 pg/ml。當(dāng)聯(lián)合血清miR-221、MMP-2和MMP-9時，區(qū)分卵巢上皮癌與健康女性的AUC為0.913(95%CI：0.855～0.971，P<0.001)，靈敏度為84.1%，特異度為92.3%(圖1D)。

2.4 風(fēng)險評估

單因素分析顯示，血清高miR-221、MMP-2和MMP-9水平是卵巢上皮癌發(fā)病的危險因素；多因素分析顯示，在校正年齡、BMI、吸煙史、飲酒史等因素的影響后，血清高miR-221、MMP-2和MMP-9水平仍是卵巢上皮癌發(fā)病的獨(dú)立危險因素，見表3。

3 討論

miR-221是1種最新發(fā)現(xiàn)的基因調(diào)控因子，能在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達(dá)或蛋白質(zhì)翻譯，已被證實(shí)在肝癌、胃癌、乳腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、前列腺癌等多種腫瘤中異常高表達(dá)[7-9]。高表達(dá)的miR-221通過對其靶基因，如抑癌基因CDKN1B(p27kip1)、CDKN1C(p57kip2)、MMAC1(PTEN)轉(zhuǎn)錄后負(fù)性調(diào)控而抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移[10]。周寧等[11]通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染含有miR-221 sponge的質(zhì)粒，下調(diào)卵巢癌細(xì)胞中miR-221的表達(dá)水平后，發(fā)現(xiàn)卵巢癌細(xì)胞的增殖能力與遷移能力會顯著下降。朱小丹等[12]的研究進(jìn)一步證實(shí)，瞬時轉(zhuǎn)染miR-221 mimics的卵巢上皮癌細(xì)胞，其增殖與遷移能力均受到明顯抑制。在本次研究中，我們發(fā)現(xiàn)血清miR-221在卵巢上皮癌患者中水平顯著高于健康女性，且在Ⅲ～Ⅳ期患者中的增高最明顯。ROC分析表明，血清miR-221鑒別卵巢上皮癌與健康女性的靈敏度79.7%，表明miR-221對卵巢上皮癌的診斷具有潛在價值。

A為血清miR-221對卵巢上皮癌鑒別診斷的ROC曲線；B為血清MMP-2對卵巢上皮癌鑒別診斷的ROC曲線；C為血清MMP-9對卵巢上皮癌鑒別診斷的ROC曲線；D為聯(lián)合血清miR-221、MMP-2和MMP-9對卵巢上皮癌鑒別診斷的ROC曲線。

項(xiàng)目單因素分析OR(95%CI)P多因素分析OR(95%CI)PmiR-221(-log)2.32(1.79～4.31)0.0722.02(1.33～4.41)0.213MMP-2/(pg·ml-1)5.38(2.69～8.91)<0.0014.77(1.47～6.08)<0.001MMP-9/(pg·ml-1)4.61(2.08～6.33)<0.0013.51(1.53～5.72)0.001

MMP-2、MMP-9是癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移過程中的兩個關(guān)鍵酶。二者的激活可以形成Ⅳ型膠原酶，降解細(xì)胞外基質(zhì)，破壞完整的基底膜，促進(jìn)癌細(xì)胞浸潤周圍組織，侵入血管和淋巴管，向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[13-14]。目前，關(guān)于MMP-2、MMP-9與卵巢癌的相關(guān)研究已取得較大進(jìn)展。申麗媛等[15]對47例卵巢癌、30例卵巢良性腫瘤和21例正常卵巢組織中MMP-2、MMP-9的表達(dá)進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，MMP-2及MMP-9在卵巢癌中的表達(dá)水平均高于正常卵巢組織及卵巢良性組織，且二者與卵巢癌的臨床分期相關(guān)。Che等[16]的體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高分泌的MMP-2、MMP-9可通過C3G/Rap1信號通路增強(qiáng)卵巢上皮癌細(xì)胞的侵襲能力，這可能是高水平MMP-2、MMP-9預(yù)示卵巢癌不良預(yù)后的原因之一。在本次研究中，我們證實(shí)卵巢上皮癌患者的血清MMP-2、MMP-9水平較健康女性顯著增高，且在Ⅲ～Ⅳ期患者中的增高最為顯著，二者鑒別卵巢上皮癌與健康女性的特異度分別為90.3%和86.7%。當(dāng)聯(lián)合檢測血清miR-221、MMP-2與MMP-9三項(xiàng)指標(biāo)時，靈敏度高達(dá)84.1%，特異度為92.3%，優(yōu)于單項(xiàng)指標(biāo)檢測。此外我們還對血清miR-221、MMP-2、MMP-9水平與卵巢上皮癌發(fā)病風(fēng)險進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，高表達(dá)的miR-221、MMP-2、MMP-9均為卵巢上皮癌發(fā)病的獨(dú)立危險因素，提示定期檢測上述三者水平，對卵巢上皮癌的發(fā)病具有預(yù)測價值。

本研究尚存在以下不足之處：①研究中收集的病例數(shù)有限，未來還需更多多中心大樣本的前瞻性研究對本研究結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證；②本次研究未對miR-221、MMP-2、MMP-9參與卵巢上皮癌發(fā)病的機(jī)制進(jìn)行深入挖掘，未來可設(shè)計相應(yīng)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探究。

綜上所述，在本次研究中，我們首次探究了聯(lián)合檢測血清miR-221、MMP-2、MMP-9三項(xiàng)指標(biāo)對卵巢上皮癌的診斷與發(fā)病風(fēng)險預(yù)測價值，有望為卵巢癌的臨床診療提供新思路。