全基因組關(guān)聯(lián)分析在乳酸菌研究中的應(yīng)用

余中節(jié) 趙 潔 宋宇琴 孫志宏 張和平

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)蒙古自治區(qū)乳品生物技術(shù)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 呼和浩特 010018）

乳酸菌是指糖發(fā)酵能產(chǎn)生50%以上乳酸的一類(lèi)無(wú)芽孢、不運(yùn)動(dòng)、過(guò)氧化氫酶反應(yīng)陰性、革蘭氏染色陽(yáng)性細(xì)菌的總稱(chēng)[1]。乳酸菌是重要的工業(yè)用微生物之一，其能夠使食品酸化，產(chǎn)生酒精，改善食品風(fēng)味，維持腸道微生態(tài)，抑制病原菌生長(zhǎng)，從而緩解乳糖不耐、腹瀉、胃潰瘍等病癥，被廣泛用于食品和生物醫(yī)藥行業(yè)。在青貯飼料發(fā)酵過(guò)程中，乳酸菌能夠調(diào)節(jié)飼料內(nèi)的生物區(qū)系，促進(jìn)多糖與粗纖維轉(zhuǎn)換，提高飼料轉(zhuǎn)化率，促進(jìn)反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)育；乳酸菌分泌的有機(jī)酸可以溶解土壤中的梨酸鹽并通過(guò)螯合作用釋放磷元素有助于植物生長(zhǎng)。然而，傳統(tǒng)的分析技術(shù)存在分辨率低，重復(fù)性差等缺點(diǎn)，未能全面解析乳酸菌的進(jìn)化過(guò)程和遺傳背景，在很大程度上限制了高生產(chǎn)性能和優(yōu)良益生特性乳酸菌的應(yīng)用領(lǐng)域和自身價(jià)值的發(fā)揮。

全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome-wide association study，GWAS）的出現(xiàn)為乳酸菌的分離篩選以及溯源、進(jìn)化研究提供了更為可靠的證據(jù)和新的思路。GWAS技術(shù)在細(xì)菌的基因-性狀關(guān)聯(lián)分析方面的應(yīng)用已經(jīng)漸趨成熟，這方面的研究也已成為細(xì)菌分子生物學(xué)的熱門(mén)領(lǐng)域。本文綜述GWAS在細(xì)菌中應(yīng)用的現(xiàn)狀，并分析了將GWAS分析技術(shù)應(yīng)用于乳酸菌基因組研究及分離篩選的可行性，意在推動(dòng)和倡導(dǎo)在我國(guó)加快對(duì)該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用研究。

1 乳酸菌分子生物學(xué)研究進(jìn)展

人類(lèi)對(duì)乳酸菌的應(yīng)用有著長(zhǎng)遠(yuǎn)的歷史，根據(jù)《圣經(jīng)·舊約》的記載，公元前 4000年，人類(lèi)已經(jīng)開(kāi)始食用發(fā)酵肉制品及蔬菜腌漬物。1873年李斯特（Lister）利用稀釋法，從酸乳中分離純化出乳桿菌（Bacterium lactis），也就是目前的乳酸乳球菌（Lactococcus lactis），這是乳酸菌最早被分離出來(lái)的紀(jì)錄[2]。目前在自然界發(fā)現(xiàn)的乳酸菌主要包括乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）、明串珠球菌屬（Leuconostoc）、奇異菌屬（Atopobium）等43個(gè)屬373個(gè)種及亞種[3]。

據(jù)新思界產(chǎn)業(yè)研究發(fā)布的《2016-2019年中國(guó)乳酸菌市場(chǎng)深度分析報(bào)告》顯示，在2015年我國(guó)乳酸菌的市場(chǎng)規(guī)模達(dá)到了660億元，并且每年保持15%～18%以上的增速，而我國(guó)大部分乳酸菌市場(chǎng)被外資和合資企業(yè)所壟斷，這是一種極不正常的現(xiàn)象，乳酸菌呈現(xiàn)出較強(qiáng)的地域性，特定地區(qū)的人群因其飲食習(xí)慣及腸道消化系統(tǒng)的差異，更適合本地區(qū)的乳酸菌，也就是習(xí)慣上所說(shuō)的國(guó)民益生菌。然而，我國(guó)本土益生菌產(chǎn)品缺失，主要原因是對(duì)乳酸菌分離鑒定的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究缺失，因而快速分離篩選出具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)且生產(chǎn)、益生性能良好的乳酸菌，以及闡明乳酸菌的分離學(xué)地位、進(jìn)化過(guò)程和遺傳背景，對(duì)發(fā)展民族乳酸菌產(chǎn)業(yè)非常重要。

早期對(duì)于乳酸菌的研究主要集中在利用其生理生化特性進(jìn)行分類(lèi)鑒定，以及分離篩選，這種手段一是要通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論，時(shí)間成本和實(shí)驗(yàn)成本很高；二是生物的表型與其基因型并不完全對(duì)應(yīng)，因而該方法存在分辨率低，工作量大等諸多限制。分子生物學(xué)的發(fā)展使得乳酸菌的快速分離篩選，以及闡明乳酸菌的起源、進(jìn)化成為可能。由此產(chǎn)生的一系列新型技術(shù)，如以16S rRNA基因間隔區(qū)（Intergenic spacer region，ISR）序列分析技術(shù)為代表的DNA指紋圖譜技術(shù)，為乳酸菌的分離鑒定提供了豐富的方法。

基因芯片技術(shù)是上世紀(jì)90年代興起的一種對(duì)成百上千甚至上萬(wàn)個(gè)基因同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)的新技術(shù)，有高通量、并行化等特點(diǎn)。Frese等[4]利用比較基因組雜交（Comparative genomic hybridization，CGH）技術(shù)對(duì)57株分離自不同脊椎動(dòng)物的羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）的基因組多態(tài)性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)分離自嚙齒動(dòng)物的菌株在聚類(lèi)分析中形成了單獨(dú)的分支，表明其與其它5個(gè)分離源的分離株在基因組上存在明顯差異。當(dāng)然該方法也存在一定的局限性，首先其只能將參考基因組中的有限基因用于設(shè)計(jì)基因陣列，其次低雜交率的基因?qū)⒉荒苡糜谘芯縖5]。

隨著逐步克隆法和全基因組鳥(niǎo)槍法等一代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，對(duì)乳酸菌基因組的研究進(jìn)入了測(cè)序時(shí)代。2014—2016年內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室“乳品生物技術(shù)與工程實(shí)驗(yàn)室”采用高分辨率的多位點(diǎn)序列分型技術(shù)（Multilocus sequence typing，MLST）對(duì)包括分離自中國(guó)、蒙古國(guó)和俄羅斯等地的多個(gè)乳酸菌進(jìn)行研究[6-13]，闡明菌株基因重組與變異對(duì)其進(jìn)化的貢獻(xiàn)，進(jìn)化與世系、分離地和分離源的關(guān)系，加深了對(duì)乳酸菌遺傳多樣性和群落結(jié)構(gòu)的理解，并對(duì)菌株分類(lèi)學(xué)地位的劃分提供新的建議，為乳酸菌的溯源提供了新的理論依據(jù)。然而，在試驗(yàn)研究過(guò)程中，由于生物繁殖中不可避免的同源重組現(xiàn)象，使得菌株間垂直遺傳信號(hào)受到干擾，因此僅依靠幾個(gè)靶標(biāo)基因序列無(wú)法還原菌株真實(shí)的垂直進(jìn)化關(guān)系[14]；在菌株分離篩選層面，MLST技術(shù)也只能進(jìn)行推測(cè)，Song等[12]利用將與工業(yè)用菌株位于同一世系的分離株為依據(jù)來(lái)推測(cè)可能用于工業(yè)生產(chǎn)的新菌株，縮小了人工篩選的范圍，卻未能給出具體影響生產(chǎn)性能的基因。

之后隨著計(jì)算和生物技術(shù)的不斷發(fā)展，測(cè)序成本快速降低，通量不斷提高，對(duì)乳酸菌基因組的大規(guī)模測(cè)序得以實(shí)現(xiàn)。2001年Bolotin等[15]完成對(duì)第一株乳酸菌-乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactis ssp.lactis）IL1403的全基因組測(cè)序。2010年，Zhang等[16]完成了我國(guó)第一株乳酸菌——干酪乳桿菌 Zhang（Lactobacillus casei Zhang）的全基因組測(cè)序。Sun等[17]、Zhong等[18]分別對(duì)45株雙歧桿菌（Bifidobacterium）和37株腸球菌（Enterococcus）進(jìn)行了比較基因組學(xué)分析，找到了雙歧桿菌屬和腸球菌屬的祖先，闡明了雙歧桿菌和腸球菌的傳播過(guò)程。2015年，Sun等[19]完成了對(duì)213株乳桿菌（Lactobacilli）的重測(cè)序，并重構(gòu)了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，建議將乳桿菌屬、片球菌屬（Pediococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、嗜果糖乳酸菌屬（Fructobacillus）和酒球菌屬（Oenococcus）命名為乳桿菌屬?gòu)?fù)合體（Lactobacilli complex），并詳細(xì)闡述了蛋白代謝和糖代謝的基因，同時(shí)解析了CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)，為將來(lái)對(duì)乳桿菌的基因編輯打下了基礎(chǔ)。全基因組序列雖然能夠更完整的表達(dá)乳酸菌的進(jìn)化過(guò)程，但其也僅能將基因存在/缺失的數(shù)據(jù)利用Phenolink等[20]、CFAS等[21]相關(guān)性分析工具找到具體某個(gè)基因的存在與缺失對(duì)特定表型的影響，忽略了基因結(jié)構(gòu)、拷貝數(shù)、基因間隔區(qū)、基因表達(dá)能力等差異對(duì)表型的影響。GWAS是在全基因組層面上開(kāi)展大樣本、多中心、重復(fù)驗(yàn)證的技術(shù)，并對(duì)相關(guān)基因與復(fù)雜性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)研究，從而能夠全面揭示出乳酸菌生長(zhǎng)速度、產(chǎn)酸量、耐高溫、耐酸、耐膽鹽等性狀的遺傳機(jī)制，同時(shí)也為乳酸菌的分離篩選提供更可靠的證據(jù)。

2 全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome-wide association study，GWAS）

從1865年Gregor Johann Mendel“顆粒遺傳”概念的提出到1953年WatsonCrick提出DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型；從20世紀(jì)70年代Fred Sanger及其同事發(fā)明第一代DNA測(cè)序技術(shù)到2005年以 Solexa、ABI SOLiD為代表的第二代DNA測(cè)序技術(shù)的研發(fā)與應(yīng)用，從1977年Fred Sanger完成對(duì)全長(zhǎng)為5 375 bp的PhiX174噬菌體基因組的測(cè)定到2003年人基因組計(jì)劃（Human genome project，HGP）的完成，人類(lèi)完成了對(duì)遺傳物質(zhì)從認(rèn)識(shí)到結(jié)構(gòu)解析再到精準(zhǔn)測(cè)序的演變。隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的完成、基因芯片和第二代基因組測(cè)序技術(shù)的大規(guī)模應(yīng)用，標(biāo)志著人類(lèi)正式進(jìn)入后基因組時(shí)代，全基因組關(guān)聯(lián)分析應(yīng)運(yùn)而生。

2.1 GWAS的概述

全基因組關(guān)聯(lián)分析最初應(yīng)用于人類(lèi)基因組，其原理是應(yīng)用基因組中數(shù)以萬(wàn)計(jì)的單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide phlymophism，SNP）、插入和缺失（Insertions and deletions，InDels）或拷貝數(shù)變異（Copy number variations，CNV）進(jìn)行病例-對(duì)照的關(guān)聯(lián)分析，以發(fā)現(xiàn)影響疾病發(fā)生的遺傳特征[22]，之后隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，也逐漸應(yīng)用于其它模式和非模式的動(dòng)植物中，甚至是一些經(jīng)典的原核生物中。第一篇在人類(lèi)中成功應(yīng)用GWAS的文獻(xiàn)于2005年在Science上發(fā)表[23]。Klein等[24]在96個(gè)老年性黃斑病變的病例和50個(gè)同樣來(lái)自非西班牙裔的白人作為對(duì)照組的研究中共找到116 204個(gè)SNPs位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)其中位于補(bǔ)體因子H的內(nèi)含子中的SNP rs3380390和rs1329428與疾病顯著相關(guān)。雖然對(duì)于GWAS方法的某些方面仍然存在爭(zhēng)議，但截止到2013年National human genome research institute（NHGRI）已經(jīng)有 1 751篇GWAS文章被出版，共找到11 912個(gè)SNPs與疾病相關(guān)[25]。

2.2 GWAS的原理及分析流程

GWAS分析的主要原理是在群體中選擇病例組和對(duì)照組或連續(xù)分布的數(shù)量性狀，比較全基因組范圍內(nèi)所有遺傳標(biāo)記位點(diǎn)的等位基因或基因型頻率在病例組和對(duì)照組之間的差異，若某個(gè)遺傳標(biāo)記位點(diǎn)的等位基因或基因型在病例中出現(xiàn)的頻率明顯高于或低于對(duì)照組，則認(rèn)為該位點(diǎn)與性狀存在關(guān)聯(lián)，之后根據(jù)該位點(diǎn)在基因組中的位置和連鎖不平衡關(guān)系推測(cè)與性狀相關(guān)的基因。全基因組關(guān)聯(lián)分析的主要流程包括樣品采集、表型數(shù)據(jù)的測(cè)量、全基因組測(cè)序、基因組拼接、SNP、idnel、CNV等分子標(biāo)記檢測(cè)、群體遺傳分析、連鎖不平衡分析、性狀關(guān)聯(lián)分析和目標(biāo)性狀相關(guān)區(qū)域基因功能注釋。

2.3 GWAS的優(yōu)勢(shì)

相關(guān)性分析總體上可以分為“自下而上”和“自上而下”兩種方法?！白韵露稀保匆曰蚪M為基礎(chǔ)方法，以DNA序列為基礎(chǔ)，檢測(cè)其對(duì)表型的影響，該方法已被廣泛應(yīng)用，然而存在諸多限制，例如：其工作量較大，無(wú)法應(yīng)用在共生細(xì)菌中，只能判斷基因的存在與缺失對(duì)表型的影響，而無(wú)法判斷基因的調(diào)控或蛋白質(zhì)的多態(tài)性對(duì)表型的影響。“自上而下”，即從表型開(kāi)始，檢測(cè)特定的基因組區(qū)域與表型的不同聯(lián)系，也就是GWAS[26]。GWAS是以自然群體為研究對(duì)象，以長(zhǎng)期重組后保留的基因間的連鎖不平衡（Linkage disequilibrium，LD）為基礎(chǔ)，將目標(biāo)性狀表型的多態(tài)性與基因的多態(tài)性相結(jié)合，共同分析，能夠直接鑒定出與表型密切相關(guān)且具有特定功能的基因位點(diǎn)，擴(kuò)大了相關(guān)性分析的應(yīng)用范圍，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了在提高相關(guān)性信號(hào)分辨率的基礎(chǔ)上減小試驗(yàn)工作量。

2.4 GWAS的應(yīng)用條件

無(wú)論將GWAS方法應(yīng)用在人類(lèi)或是細(xì)菌中，其都必須滿(mǎn)足以下3個(gè)先決條件，即可測(cè)的表型和可測(cè)的基因型，以及足夠樣品數(shù)量來(lái)保證統(tǒng)計(jì)學(xué)效力，并在此前提下選擇正確的統(tǒng)計(jì)分析方法。眾所周知，更多樣品的統(tǒng)計(jì)學(xué)可靠性更好，所以為了保證基因組的異質(zhì)性以及數(shù)據(jù)的正態(tài)性，應(yīng)保證樣品數(shù)不少于30個(gè)[27]。

2.5 GWAS在細(xì)菌中的應(yīng)用現(xiàn)狀

GWAS是基因組分析的重要工具，并且近幾年已經(jīng)成功應(yīng)用到細(xì)菌基因組分析上（表1）。早期的細(xì)菌基因組主要基于PCR技術(shù)或比較基因組雜交技術(shù)，通過(guò)與表型結(jié)合，以尋找基因組中特定基因的存在或缺失與表型的關(guān)系，然而因?yàn)槌杀竞推脚_(tái)的限制，以及某些細(xì)菌自身的核苷酸多樣性較低，如炭疽桿菌（Bacillus anthracis）[28]，使得其無(wú)法在細(xì)菌基因組中大規(guī)模應(yīng)用。2013年Sheppard等[29]首次實(shí)現(xiàn)GWAS在細(xì)菌中的應(yīng)用，將192株分離自牛和雞腸道的彎曲桿菌（Campylobacter）的DNA序列劃分成30 bp長(zhǎng)的“word”來(lái)尋找菌株與特定宿主定殖能力方面的相關(guān)性，共檢測(cè)到7 307個(gè)“word”與彎曲桿菌在牛腸道中的特異性定殖有關(guān)，注釋到3個(gè)與維生素B5生物合成相關(guān)基因，因而認(rèn)為彎曲桿菌自身能否合成維生素B5是其能否在牛腸道定殖的關(guān)鍵。之后Chewapreecha等[30]的研究首次使GWAS在細(xì)菌中的研究達(dá)到了人類(lèi)遺傳學(xué)研究的規(guī)模，他們總共分析了收集自緬甸和泰國(guó)邊境的3 085株和收集自美國(guó)馬薩諸塞州的616株肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）用于檢測(cè)β-內(nèi)酰胺抗性相關(guān)的基因組變異。

結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis），俗稱(chēng)結(jié)核桿菌，是引起結(jié)核病的病原菌。Farhat等[31]利用基于進(jìn)化收斂性的方法找到123株結(jié)合分枝桿菌的獨(dú)立突變位點(diǎn)，并以卡內(nèi)蒂分枝桿菌（Mycobacterium canettii）作為外群構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，驗(yàn)證了全部前人研究發(fā)現(xiàn)的抗性基因并且發(fā)現(xiàn)39個(gè)主要編碼細(xì)胞壁生物合成、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和DNA修復(fù)通路的基因與分枝結(jié)核桿菌的抗性有關(guān)。D-環(huán)絲氨酸是治療結(jié)核病的高毒性二線藥物，Christopher等[32]通過(guò)對(duì)498株結(jié)核分枝桿菌的相關(guān)性分析，找到21個(gè)基因的功能缺失突變與常用于治療結(jié)核病9種藥物的耐藥性有關(guān)，其中編碼L-丙氨酸脫氫酶的ald基因擁有11種不同的功能缺失突變與D-環(huán)絲氨酸的抗藥性有關(guān)，通過(guò)基因敲除試驗(yàn)驗(yàn)證了相關(guān)性分析結(jié)果。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）是人體皮膚和鼻腔的常見(jiàn)定殖菌。Laabei等[33]通過(guò)對(duì)收集的90株耐甲氧西林金黃色葡萄球 菌（Methicillin-resistant S.aureus，MRSA）的GWAS分析，發(fā)現(xiàn)了121個(gè)基因座位與分離株的不同毒性有關(guān)。同樣，Alam等[34]在49株萬(wàn)古霉素敏感金黃色葡萄球菌（Vancomycin-sensitive S.aureus）和26株萬(wàn)古霉素中度敏感金黃色葡萄球菌（Vancomycin-intermediate S.aureus）中檢測(cè)到55 977個(gè)SNPs，發(fā)現(xiàn)編碼RNA聚合酶的rpoB基因第481位密碼子的非同義替換與金黃色葡萄球菌的萬(wàn)古霉素抗性顯著相關(guān)。

由上述研究可知，GWAS已經(jīng)有在細(xì)菌中成功應(yīng)用的先例，成功的定位彎曲桿菌、肺炎鏈球菌、結(jié)核分枝桿菌和金黃色葡萄球菌等細(xì)菌的毒力基因和抗性基因，因而GWAS技術(shù)在定位乳酸產(chǎn)酸量、產(chǎn)酸速度等與生產(chǎn)特性相關(guān)的基因，以及闡明分離源、分離地等選擇壓力對(duì)乳酸菌進(jìn)化的影響充滿(mǎn)了希望，然而同時(shí)也面臨著挑戰(zhàn)。

表1 近幾年全基因組關(guān)聯(lián)分析在細(xì)菌中應(yīng)用的文獻(xiàn)Table1 Genome-wide association study application in bacteria in recent years

2.6 GWAS在細(xì)菌基因組中應(yīng)用存在的限制

2005年二代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)使得對(duì)細(xì)菌基因組的大規(guī)模測(cè)序得以實(shí)現(xiàn)，而GWAS并未立即應(yīng)用于細(xì)菌基因組分析。究其原因，主要是由于原核細(xì)胞與真核細(xì)胞在組成上存在差異，細(xì)菌是單倍體生物，缺乏著絲粒與紡錘體結(jié)構(gòu)，雙鏈環(huán)形DNA隨著細(xì)胞的伸長(zhǎng)采用二分裂的方式分開(kāi)，因而使其無(wú)法像真核細(xì)胞在減數(shù)分裂四分體時(shí)期非姐妹染色單體之間發(fā)生同源重組，從而導(dǎo)致細(xì)菌基因組出現(xiàn)嚴(yán)重的種群分層和較高的連鎖不平衡現(xiàn)象，也就使得在人類(lèi)基因組中廣泛應(yīng)用的GWAS分析無(wú)法直接套用于細(xì)菌基因組中。

2.7 GWAS在細(xì)菌中應(yīng)用所面臨困難的解決方法

群體分層的問(wèn)題不僅在細(xì)菌的GWAS研究中出現(xiàn)，同樣也出現(xiàn)在人類(lèi)的GWAS研究中，即在病例對(duì)照的研究中，如果某遺傳標(biāo)記的等位基因的頻率在病例和對(duì)照組中出現(xiàn)顯著差異，而該遺傳標(biāo)記并不與表型相關(guān)，則認(rèn)為該研究中存在群體分層現(xiàn)象[35]，簡(jiǎn)單來(lái)講就是等位基因在亞群中非隨機(jī)分布。因?yàn)榧?xì)菌特殊的克隆繁殖方式使得其群落高度相關(guān)，導(dǎo)致細(xì)菌的GWAS研究受到群體分層的嚴(yán)重干擾，可是這往往被研究者所忽視，相關(guān)性結(jié)果的出現(xiàn)是因?yàn)檫z傳的相關(guān)性而不是基因組的變異，從而使得相關(guān)性檢驗(yàn)的P值膨脹，與表型相關(guān)的和不相關(guān)的突變同時(shí)關(guān)聯(lián)到同一個(gè)連鎖區(qū)域內(nèi)，從而出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果，使得研究結(jié)果難以重復(fù)。解決群體分層的方法可以通過(guò)有選擇性的采樣，采集隔離或來(lái)自同一家系的不同表型的群體樣品，Maury等[36]通過(guò)該方法收集了104株單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌（Listeria monocytogenes），通過(guò)GWAS分析發(fā)現(xiàn)內(nèi)化蛋白基因InlA的截短是低毒性李斯特菌的主要變異特征，而一個(gè)由6個(gè)基因構(gòu)成的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（Phosphotransferase system，PTS）是高毒性李斯特菌的主要毒力因子。另外，可以通過(guò)使用線性混合模型（Linear mixed model，LMM）來(lái)消除不同祖先或有相關(guān)性的樣品造成的有偏倚的相關(guān)性。Earle等[37]使用該方法用于查找來(lái)自4個(gè)不同種的3 363株致病菌在17種藥物中的潛在的抗性基因。還可通過(guò)使用重建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[31，34]，或聚類(lèi)后進(jìn)行大量置換檢驗(yàn)的方法[33]以及基因組控制[38]等方法來(lái)消除。

連鎖不平衡是指一個(gè)基因座位上的某些等位基因與同一個(gè)染色體上另一個(gè)基因座位上的某些等位基因同時(shí)出現(xiàn)的頻率大于單獨(dú)隨機(jī)出現(xiàn)的頻率，連鎖不平衡的程度可以用r2來(lái)衡量[39]。同樣由于細(xì)菌無(wú)性克隆的繁殖方式以及單倍體基因組結(jié)構(gòu)，使得其只能通過(guò)接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生重組和交換遺傳信息，造成細(xì)菌基因組的高度連鎖不平衡，通過(guò)連鎖區(qū)域中其它連鎖位點(diǎn)使真正與特定表型有因果關(guān)系的變異位點(diǎn)變得模糊，從而限制經(jīng)典的基因組作圖工具，只能將有相關(guān)性的區(qū)域定位到較長(zhǎng)連鎖片段，形成所謂的“馬賽克基因”，降低了相關(guān)性信號(hào)的分辨率。要解決連鎖不平衡最直接的辦法就加大樣本量，Chewapreecha等[30]使用了3 701株肺炎鏈球菌，為GWAS分析提供了足夠的重組事件。減少連鎖不平衡的不利影響第一步是要明確所研究細(xì)菌連鎖不平衡的水平，four-gamete test[40]或 D′measure[41]等工具可以評(píng)價(jià)細(xì)菌的連鎖不平衡水平，之后可以通過(guò)定義一個(gè)變異是否能夠引起表型功能上的改變，例如抗藥性、菌落總數(shù)等，來(lái)確定該變異是否為因連鎖不平衡造成的假陽(yáng)性變異[42]。同時(shí)還可以結(jié)合細(xì)菌基因組具有顯著的正向選擇的特點(diǎn)，來(lái)提高GWAS的分辨率。

3 GWAS在乳酸菌中應(yīng)用的意義

GWAS利用廣泛分布于基因組中的SNP，In-Del，CNV等分子標(biāo)記，將目標(biāo)性狀表型的多態(tài)性與基因的多態(tài)性相結(jié)合，共同分析，相比于MLST技術(shù)、比較基因組學(xué)技術(shù)具有更高的分辨率，能夠在單核苷酸的水平解析乳酸菌生產(chǎn)性能的不同，為乳酸菌的分離篩選提供更可靠的證據(jù)。在遺傳進(jìn)化方面，不僅可以驗(yàn)證前人的研究結(jié)果，還能夠提供更多、更完善的信息，為乳酸菌的溯源、遺傳多樣性的研究提供新的思路。目前GWAS在細(xì)菌基因組中的應(yīng)用尚處于發(fā)展初期，而且已完成的研究也主要集中在致病菌中，在包括乳酸菌等工業(yè)用微生物中還鮮有報(bào)道[43]。目前我研究團(tuán)隊(duì)正在開(kāi)展對(duì)于嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）的GWAS研究，在已完成的研究中發(fā)現(xiàn)，以分離源和發(fā)酵特性分別做為表型，發(fā)現(xiàn)冷激蛋白（Cold-shock protein）和鈣轉(zhuǎn)移 P型 ATP酶（Calcium-translocating P-type ATPase）、胞壁質(zhì)水解酶調(diào)控酶lrgA（Murein hydrolase regulator LrgA）、膜蛋白（Membrane protein）分別與菌株的分離地的海拔和產(chǎn)酸量、產(chǎn)酸速率呈顯著相關(guān)關(guān)系。早期研究已經(jīng)證明GWAS不僅是一個(gè)尋找特定表型與其所關(guān)聯(lián)的基因型的可靠方法，而且是一個(gè)揭示復(fù)雜性狀表達(dá)水平的強(qiáng)有力的工具[44]，因而將GWAS應(yīng)用于乳酸菌等工業(yè)微生物的分離篩選、進(jìn)化以及溯源將具有開(kāi)創(chuàng)性意義。

人類(lèi)對(duì)于乳酸菌的應(yīng)用有著很長(zhǎng)的歷史，對(duì)于乳酸菌的研究已經(jīng)深入到分子水平，GWAS技術(shù)可以使乳酸菌的基因組研究精確到核苷酸水平，為乳酸菌的分離篩選以及進(jìn)化溯源提供更可靠度證據(jù)和新的思路。我國(guó)立足于民族乳酸菌從收集、篩選、分離、鑒定等基礎(chǔ)和應(yīng)用研究起步較晚，且與發(fā)達(dá)國(guó)家存在較大差距，而GWAS技術(shù)的應(yīng)用為我們?cè)谳^短時(shí)間內(nèi)縮短與發(fā)達(dá)國(guó)家的差距提供了可行的途徑。為此，將GWAS技術(shù)應(yīng)用于乳酸菌的遺傳和進(jìn)化研究以及分離篩選，具有更加現(xiàn)實(shí)的意義。