蝸牛黏液活體提取及成分特性分析

吳 影 馬雨浩 王亮飛 閆佳琦 趙超亞 李長(zhǎng)福 古紹彬，2，3*

（1 河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 河南洛陽(yáng) 471023）

2 河南省食品微生物工程技術(shù)研究中心 河南洛陽(yáng) 471023）

3 食品加工與安全國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心 河南洛陽(yáng) 471023）

蝸牛黏液是蝸牛爬行過(guò)程中足腺分泌出的光滑黏液，它可讓靜止的軟體動(dòng)物吸附在巖石表面，形成暫時(shí)的封閉結(jié)構(gòu)[1]。在運(yùn)動(dòng)中，黏液使足部保持濕潤(rùn)，減少腹足肌肉與地面直接摩擦，避免蝸牛爬行時(shí)受到損傷。在捕食中，蝸牛黏液可以幫助蝸牛將食物從觸角轉(zhuǎn)運(yùn)到嘴處，凈化被唇和觸角拋棄的食物，通過(guò)分泌黏液來(lái)保護(hù)自身免受水生食肉動(dòng)物的捕食，還可以保護(hù)自身免于水分的蒸發(fā)[2]。在冬眠或夏眠時(shí)，蝸牛足腺分泌出來(lái)的黏液，干涸后在殼口形成一個(gè)薄膜，把身體嚴(yán)密地封閉起來(lái)，待外界環(huán)境適宜時(shí)即破膜而出重新修復(fù)身體[3]。

蝸牛黏液含豐富的天然膠原質(zhì)、彈力蛋白、尿囊素、蛋白質(zhì)、多種維生素、甘醇酸、天然的抗菌劑[4]。膠原蛋白是皮膚重要結(jié)締組織成分，具有保持水分的功效。彈力蛋白，保持皮膚組織的彈性蛋白，適當(dāng)補(bǔ)充彈力蛋白可防止皺紋提早出現(xiàn)。尿囊素，有效修補(bǔ)傷痕，幫助皮膚對(duì)抗自由基，具保濕、傷口愈合、抗發(fā)炎、剌激細(xì)胞再生及舒緩的作用，是皮膚柔軟劑和抗氧化劑[5]。葡（萄）糖醛酸，可使肌膚表皮表層的黏膠性脂質(zhì)松軟，以利于去除老舊角質(zhì)，加速細(xì)胞再生，減少皮膚皺紋及疤痕。此外，黏液還是一種天然抗生素，能夠殺死皮膚上的某些細(xì)菌，并能消除皮膚斑點(diǎn)和痤瘡，這是因?yàn)樗軡B透到皮膚的第3個(gè)層面[6]。從蝸牛黏液中提煉出的尿囊素可以使皮膚再生；蛋白質(zhì)和維生素可以增加皮膚的營(yíng)養(yǎng)，使肌膚更加細(xì)膩和光滑。此外，研究還發(fā)現(xiàn)蝸牛黏液有抗氧化活性，其包含許多SOD酶、谷胱甘肽、轉(zhuǎn)硫酶和低分子質(zhì)量的能還原ABTS的抗氧化物質(zhì)[7]；同時(shí)還與細(xì)胞再生和保護(hù)相關(guān)的FGF活性存在有關(guān)[8]。

蝸牛作為高蛋白、低脂肪的上等食品和動(dòng)物性蛋白飼料，被廣泛利用，促進(jìn)了蝸牛養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展[9-10]。然而，現(xiàn)有技術(shù)中，蝸牛黏液是在蝸牛肉中提取的，是加工蝸牛肉時(shí)的副產(chǎn)品。蝸牛在沸水中瞬間死亡，其受到刺激分泌的黏液無(wú)法保存分離，且獲取蝸牛黏液時(shí)經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的高溫處理，既破壞了黏液有效成分，也影響其中一些活性物質(zhì)的功效[11-12]。天然的蝸牛黏液分泌量非常稀少，造成市場(chǎng)上添加蝸牛黏液相關(guān)的產(chǎn)品價(jià)格居高不下。目前蝸牛黏液的提取技術(shù)有限，產(chǎn)品雜質(zhì)多且保存條件高，使得蝸牛黏液的應(yīng)用受限。本文研究從活體蝸牛中提取具有活性成分的黏液及其特性，對(duì)其后續(xù)的成分分析和產(chǎn)品開發(fā)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試菌：產(chǎn)毒性大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia coli）、志賀氏菌（Shigella）、豬沙門氏菌（Salmonella suis）、禽巴氏桿菌（Pasteurella multocida）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），由河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院微生物學(xué)教研室保存。

培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基。

原料：白玉蝸牛，洛陽(yáng)綠爾農(nóng)業(yè)科技有限公司。

試劑：胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶，北京保順科技有限公司；濃硫酸、氯胺T、對(duì)二氨基苯甲醛、酵母粉、胰蛋白胨、瓊脂、乙醇等生化試劑，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

K9860凱氏定氮儀，濟(jì)南海能儀器有限公司；Vertex 70紅外光譜儀，Bruker公司；UV2600紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，島津國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；LGJ-10D型冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蝸牛黏液的制備 挑選質(zhì)量在25 g以上的鮮活蝸牛，清水洗凈、晾干。取出蝸牛，用去針頭的1 mL注射器吸取質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%～25%的5個(gè)梯度NaCl溶液各1 mL，均布浸涂在蝸牛腹足部，靜置0.5～2 min，使蝸牛腹足部分泌的黏液流至收集器皿中；之后立即用清水沖洗蝸牛。分泌黏液后的蝸牛需補(bǔ)充清水和精飼料飼養(yǎng)5 d后方可再次提取黏液。將提取的黏液過(guò)陶氏納濾膜（NF200）除去水和氯化鈉，再加水沖洗幾次，確保氯化鈉被去除干凈，再次過(guò)NF200納濾膜，濃縮黏液。將純化的黏液倒入平皿中，用保鮮膜封口并用銳器戳適量小孔透氣，將其放入真空冷凍干燥箱中降溫，待溫度降至-50℃，將物料放入，抽真空，當(dāng)真空度<10 Pa時(shí)，關(guān)閉真空泵，真空冷凍干燥處理3～5 h，得到白色粉狀物。

1.3.2 粗蛋白含量測(cè)定（凱氏定氮法）將1 g樣品移入250 mL三角瓶中，加入0.2 g硫酸銅、6 g硫酸鉀、20 mL濃硫酸，搖勻，小火加熱使其炭化，待瓶?jī)?nèi)液體變?yōu)槌吻逋该骶G色溶液，冷卻后移入100 mL容量瓶中，定容后于K9860凱氏定氮儀中進(jìn)行蛋白含量測(cè)定。同時(shí)做空白對(duì)照。

1.3.3 膠原蛋白含量測(cè)定 膠原蛋白含量測(cè)定采用 Woessner法[13]。 參照 ISO3496（E）法[14]繪制羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：稱量50 mg羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，溶解后移入100 mL容量瓶，滴加1滴3 mol/L硫酸，定容。吸取10 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于1 000 mL容量瓶中定容，得到5 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。按表1加羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液，定容至100 mL，取 4 mL于具塞試管中，加入2 mL氯胺T搖勻，室溫放置20 min。加入2 mL顯色劑搖勻，水浴鍋中60℃加熱20 min。冷卻后放置30 min，在波長(zhǎng)558 nm處測(cè)吸光值。以羥脯氨酸溶液濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)吸光值為縱坐標(biāo)建立羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線加樣體系Table1 Addition system of hydroxyproline standard curve

樣品中羥脯氨酸含量測(cè)定：取凍干蝸牛黏液樣品1 g，用6 mol/L鹽酸在115℃烘箱中水解8 h，加入檸檬酸緩沖液定容100 mL。取4 mL溶液于具塞試管中，按繪制羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟測(cè)定樣品中羥脯氨酸含量。樣品中羥脯氨酸含量按公式（1）計(jì)算。

式中，m——提取出的羥脯氨酸含量，mg/g；C——標(biāo)準(zhǔn)曲線上相應(yīng)的羥脯氨酸質(zhì)量濃度，μg/mL；M——稱取樣品質(zhì)量，g；F——稀釋倍數(shù)。

1.3.4 膠原蛋白的提取

1）酶解法[15-17]胃蛋白酶：取10 g蝸牛黏液于小燒杯中，按照1∶5料液比添加50 mL緩沖液，加入0.5 g胃蛋白酶，充分?jǐn)嚢韬笤谑覝胤胖?8 h酶解，沸水浴10 min滅酶。

胰蛋白酶：取10 g蝸牛黏液于小燒杯中，按照1∶5料液比添加50 mL緩沖液，加入0.5 g胰蛋白酶，充分?jǐn)嚢韬笫覝胤胖?8 h酶解，沸水浴10 min滅酶。

木瓜蛋白酶：取10 g蝸牛黏液于小燒杯中，按照1∶5料液比添加50 mL蒸餾水，加入0.5 g木瓜蛋白酶，充分?jǐn)嚢韬笫覝胤胖?8 h酶解，沸水浴10 min滅酶。

2）酸解法[18，20-21]取10 g蝸牛黏液于小燒杯中，按1∶5料液比添加50 mL蒸餾水，加入1.05 g檸檬酸（0.1 mol/L），充分?jǐn)嚢韬笤?℃冰箱中放置72 h酸解。

3）水提法[19-21]取10 g蝸牛黏液于小燒杯中，按照1∶5料液比添加50 mL蒸餾水，于70℃水浴鍋中加熱6 h。

將處理好的黏液分裝于5 mL離心管中，12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，取上清液于平皿中，置于真空冷凍干燥箱中凍干處理。

1.3.5 蝸牛黏液膠原蛋白的定性分析 紫外-可見(jiàn)吸收光譜法[21]：將酶解法、酸解法和水提法獲得的樣品凍干后溶解于0.5 mol/L冰乙酸溶液中，設(shè)定波長(zhǎng)范圍190～400 nm，將0.5 mol/L冰乙酸溶液倒入石英比色皿中調(diào)零，加入待測(cè)樣品測(cè)定吸光值。

紅外光譜法[22]：將酸解法凍干后樣品放入60℃烘箱中全干燥，取1 mg與干燥的100 mg溴化鉀在瑪瑙研缽中研磨使顆粒達(dá)到2 μm。將混合物均勻放入固體壓片模具的頂模和底模間，將模具放入壓力機(jī)，在15 MPa壓力下保持1 min，得到透明或均勻半透明錠片。將錠片取出，放入固體樣品測(cè)試架中測(cè)試。

1.3.6 高效液相色譜成分分析 取新鮮蝸牛黏液1.25 mL溶解到 25 mL流動(dòng)相（pH 2.7的10 mmoL/L磷酸二氫鉀）中，混勻，60℃加熱20 min，冷卻后用10 moL/L氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值至2.9，混勻2 min，用等體積正己烷提取樣品，待分層后吸取下層樣品溶液用0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾。磷酸氫二鉀（C）和乙腈（D）為流動(dòng)相，采用梯度洗脫法，將乙腈體積分?jǐn)?shù)由0增加至70%，流速為0.7 mL/min。

1.3.7 蝸牛黏液抑菌性試驗(yàn) 每皿培養(yǎng)基加0.10 mL供試菌菌懸液，涂勻后，置于 3個(gè)牛津杯。將蝸牛黏液的凍干樣品0.2 g充分溶解在4 mL水中，用移液槍吸取200 μL，分別注入牛津杯。37℃培養(yǎng)24 h后觀察、記錄。每組重復(fù) 3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 活體蝸牛黏液的制備

分別用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，10%，15%，20%，25%梯度的NaCl溶液浸涂于蝸牛腹足部，發(fā)現(xiàn)5個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaCl均可刺激蝸牛分泌黏液（見(jiàn)表2），其中20%的NaCl處理蝸牛獲得的黏液量最大，達(dá)蝸牛自身體重的30%左右。

表2 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)蝸牛黏液分泌量的影響Table2 Effect of NaCl concentration on mucus secretion of snails

2.2 蝸牛黏液粗蛋白含量的測(cè)定

用凱氏定氮儀測(cè)得白玉蝸牛新鮮黏液中的粗蛋白含量為0.42%，而凍干樣品中粗蛋白含量為31.48%。文獻(xiàn)報(bào)道，豬皮的粗蛋白含量為24.59%，魷魚皮的粗蛋白含量為11.13%，凍干后粗蛋白含量為56.23%，海蜇皮中粗蛋白含量為1.82%?？梢钥闯鑫伵ｐひ褐写值鞍缀窟m中，具有一定的研究?jī)r(jià)值。

2.3 蝸牛黏液中膠原蛋白的定性分析

在蛋白質(zhì)的氨基酸中，色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和組氨酸具有共軛雙鍵它們?cè)?80 nm處有較強(qiáng)的吸收峰，在測(cè)蛋白質(zhì)濃度時(shí)常采用紫外分光光度法。膠原蛋白的結(jié)構(gòu)較特殊，組成它的氨基酸中幾乎不含共軛雙鍵的氨基酸，在280 nm處無(wú)吸收峰，而在220～230 nm處有明顯的吸收峰。通過(guò)此特征可以鑒定樣品中是否存在膠原蛋白。

由圖1可見(jiàn)，圖1a～1e在230 nm處均存在最大吸收峰，說(shuō)明蝸牛黏液中存在膠原蛋白。圖1a～1d在其它波長(zhǎng)處也存在吸收峰，可能是由于酶解法和水提法提取膠原蛋白不徹底，仍存在其它雜蛋白，或者滅酶處理不徹底等。酸解法處理的蝸牛黏液，在波長(zhǎng)230 nm處存在顯著的吸收峰，在其它波長(zhǎng)處沒(méi)有吸收峰，表明酸提法、酶解法和水提法相比可從蝸牛黏液中獲得較純的膠原蛋白。

圖1 蝸牛黏液紫外吸收光譜圖Fig.1 Ultraviolet absorption spectra of snail’s mucus

Ⅰ型膠原蛋白為各種動(dòng)物體內(nèi)膠原蛋白的主要存在形式，為了分析蝸牛黏液中的膠原蛋白類型，采用紅外光譜法對(duì)酸解獲得的樣品進(jìn)行掃描，結(jié)果表明，3 404 cm-1處存在峰值是由于氮?dú)滏I之間發(fā)生的伸縮振動(dòng)，說(shuō)明該處有氫鍵；有強(qiáng)烈的O-H伸縮振動(dòng)峰，表明有羥基結(jié)構(gòu)。1 652 cm-1處存在峰值是由于酰胺Ⅰ帶間的碳氧單鍵發(fā)生伸縮振動(dòng)，1 540 cm-1處存在峰值是因?yàn)樵诟浇孽０发驇е械?氫間發(fā)生彎曲狀波動(dòng)，表明存在乙酰氨基結(jié)構(gòu)。1 125 cm-1處有吸收峰表明膠原蛋白結(jié)構(gòu)中三股螺旋完整。以上多種吸收峰的存在表明蝸牛黏液中的膠原蛋白為Ⅰ型膠原蛋白。將圖2與標(biāo)準(zhǔn)sigmaⅠ型膠原蛋白紅外圖[22]相比，均有Ⅰ型膠原的特征峰，表明蝸牛黏液中的膠原蛋白為Ⅰ型膠原蛋白。

2.4 膠原蛋白含量

白玉蝸牛分泌液的凍干樣品在長(zhǎng)時(shí)間的高溫、強(qiáng)酸環(huán)境中，其膠原蛋白會(huì)變性、解離，變成可檢測(cè)的游離氨基酸。其中，羥脯氨酸為膠原蛋白中的特征性氨基酸，作為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)woessenr法處理，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在558 nm處測(cè)羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖3。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線推測(cè)出羥脯氨酸含量，由公式（1）即可得出凍干樣品中所含羥脯氨酸的量。目前有關(guān)白玉蝸牛分泌液中膠原蛋白的研究較少，還沒(méi)有一個(gè)關(guān)于膠原蛋白和羥脯氨酸之間的標(biāo)準(zhǔn)換算系數(shù)。本文采用的換算系數(shù)為11.1（參考海蜇膠原蛋白的測(cè)定[21]）。經(jīng)測(cè)定，凍干樣品中羥脯氨酸含量為15.04 mg/g，經(jīng)換算，膠原蛋白含量占凍干樣品總重的16.69%。上文凱氏定氮法測(cè)得凍干樣品中蛋白質(zhì)含量為31.48%，膠原蛋白占總蛋白的53%。與其它文獻(xiàn)相比，膠原蛋白含量較少。其原因可能是處理凍干樣品時(shí)的水解時(shí)間較短，羥脯氨酸沒(méi)有完全從中分離出來(lái)。

圖2 蝸牛黏液的紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectroscopy of mucus from snail

2.5 黏液主要成分分析

圖3 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of hydroxyproline

通過(guò)高相液相色譜法分析蝸牛黏液成分和其所含活性因子。圖4中有兩個(gè)較明顯的峰值，這與Mubarak等[23]做出的色譜圖大致相同。根據(jù)尿囊素和乙醇酸的特性，以及尿囊素的極性大于乙醇酸，尿囊素的出峰時(shí)間比乙醇酸早，由此得出第1個(gè)峰為尿囊素，第2個(gè)峰為乙醇酸（如圖5a和5b）。Mubarak等[23]作出的光譜圖中，尿囊素峰值高于乙醇酸，而本次分析相反，這可能是因蝸牛種類不同而導(dǎo)致各成分濃度的差異。

2.6 蝸牛黏液抑菌活性

采用牛津杯法測(cè)定了蝸牛黏液對(duì)5種供試菌的抑制效果（見(jiàn)表3）。蝸牛黏液對(duì)志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、豬沙門氏菌、產(chǎn)毒大腸桿菌和禽巴氏桿菌的生長(zhǎng)均有一定的抑制作用，其中對(duì)金黃色葡萄球菌、志賀氏菌的抑菌圈較大，抑菌效果較強(qiáng)；對(duì)豬沙門氏菌有一定抑制作用，對(duì)禽巴氏桿菌抑菌作用較弱，而對(duì)產(chǎn)毒大腸桿菌沒(méi)有抑菌效果。由此得出蝸牛黏液中所含某些活性成分對(duì)所測(cè)試菌株均具有抑菌性。Zhong等[24]在非洲大蝸牛中發(fā)現(xiàn)一種新的富含半胱氨酸的抗菌肽，與本研究結(jié)果相近。白玉蝸牛體內(nèi)是否含有新型抑菌成分仍需進(jìn)一步研究。

圖4 蝸牛粘液高相液相色譜圖Fig.4 High phase liquid chromatography of snail’s mucus

圖5 高效液相全波長(zhǎng)掃描圖Fig.5 Full wavelength scanning map of high performance liquid chromatography

表3 蝸牛黏液抑菌活性Table3 Antimicrobial activity of snail’s mucus

3 結(jié)論

本文利用NaCl刺激法在活體蝸牛中獲得大量的白玉蝸牛黏液，約占蝸牛自身體重的30%。對(duì)黏液的組成成分進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)蝸牛黏液中粗蛋白含量為0.42%，凍干樣品中的粗蛋白含量為31.48%。利用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定表明蝸牛黏液中含有膠原蛋白，紅外光譜掃描表明蝸牛黏液中存在Ⅰ型膠原蛋白。借助 Woessner法測(cè)得白玉蝸牛黏液中膠原蛋白含量為16.69%。此外，通過(guò)高效液相色譜分析，發(fā)現(xiàn)黏液中含大量的活性物質(zhì)，如尿囊素、乙醇酸小分子抗氧化類物質(zhì)。抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明：獲得的活體蝸牛黏液對(duì)志賀氏菌、豬沙門氏菌、禽巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌具有抑菌活性。張?zhí)鹛鸬萚2]研究蝸牛黏液的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)蝸牛黏液中的抗氧化類物質(zhì)對(duì)溫度有較好的穩(wěn)定性，可應(yīng)用于抗氧化的保健食品。另外，蝸牛黏液的提取物具有尿囊素、乙醇酸等保濕活性物質(zhì)、修復(fù)細(xì)胞因子和抗衰老類活性物質(zhì)，可將蝸牛黏液應(yīng)用于化妝品等用品中。Zhong等[24]研究發(fā)現(xiàn)蝸牛黏液中含有富含半胱氨酸的抗菌肽，對(duì)革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和真菌白色念珠菌均有抑菌活性，且對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性最強(qiáng)，最小肽質(zhì)量濃度（MIC）為1.9 μg/mL。蝸牛黏液不僅在化妝品領(lǐng)域，在食品和藥品領(lǐng)域都有較高的研究和利用價(jià)值。