鏈霉菌L10608來源木聚糖酶xyn-GH10/11基因的克隆與生物信息分析

熊 科 熊蘇玥 柳佳蕓 高思宇 鄧 蕾 裴鵬鋼

（1 北京工商大學(xué) 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心 北京 100048

2 北京工商大學(xué) 北京市質(zhì)量與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100048

3 北京工商大學(xué) 北京市風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100048

4 北京工商大學(xué) 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 北京 100048）

木聚糖作為植物半纖維素的重要組分，是自然界中除纖維素以外含量最豐富的可再生生物質(zhì)資源[1]。這些農(nóng)業(yè)廢棄物資源再生利用率極低，大部分被浪費(fèi)。大力開發(fā)利用這些資源可以緩解環(huán)境、資源和糧食危機(jī)。此農(nóng)業(yè)廢棄物再利用成為近十幾年各國研究的熱點(diǎn)。在眾多應(yīng)用中，以木聚糖制備有較高附加值的功能低聚糖，是富含半纖維素材料的農(nóng)業(yè)廢棄物再生利用的有效增值途徑，具有巨大的潛在經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)保意義[2-4]。低聚木糖作為一種益生元，是近幾年引起廣泛關(guān)注并逐步發(fā)展起來的功能性低聚糖。低聚木糖具有降低癌癥風(fēng)險(xiǎn)，抗齲齒，降血壓，降低血清膽固醇，抑制病原菌和腹瀉潤腸通便等作用，可應(yīng)用于酸奶、焙烤食品、功能性食品等[5]。低聚木糖中的主要有效成分為木二糖與木三糖。而目前酶法生產(chǎn)采用的微生物來源的木聚糖酶水解木聚糖時(shí)，除了菌株本身產(chǎn)酶活力低下外，水解產(chǎn)物中木二糖、木三糖等特異性成分含量大多低于30%，且含大量木糖、阿拉伯糖等單糖和其它非功能性成分，后期需要較復(fù)雜的工藝和高額的成本來進(jìn)行提純，以提高功能低聚木糖純度（60%～70%）[6]。只有極少數(shù)菌株具有底物水解高酶活力，且水解底物時(shí)產(chǎn)物中木二糖、木三糖比例超過50%[7]。酶法制取低聚木糖的過程中提高催化過程中木二糖、木三糖特異功效成分，消除和減少產(chǎn)生木糖，避免低聚木糖進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)槟咎鞘秦酱鉀Q的一關(guān)鍵問題。而木聚糖酶來源主要依靠真菌、細(xì)菌等微生物的發(fā)酵產(chǎn)生，低聚木糖的工業(yè)生產(chǎn)中采用鏈霉菌屬來源的木聚糖酶已實(shí)現(xiàn)初步的應(yīng)用[8]，具有一定的安全性與應(yīng)用潛力。通過基因工程手段對(duì)鏈霉菌屬來源的木聚糖酶蛋白進(jìn)行改造，以提高其水解產(chǎn)物中功能低聚木糖的產(chǎn)量，降低酶法生產(chǎn)成本，減少后期純化過程中的能耗、污水排放等，降低環(huán)境污染，實(shí)現(xiàn)高效利用低值農(nóng)業(yè)廢棄物生產(chǎn)高附加值低聚木糖的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。

本研究以實(shí)驗(yàn)室先前從全國各地300余份土壤樣品中篩選得到的水解產(chǎn)物中木二糖與木糖產(chǎn)量較高的菌株L10608為目標(biāo)菌株，通過高效液相色譜法檢測(cè)其木糖：木二糖：木三糖的產(chǎn)物比例約為4∶5∶2。該菌株發(fā)酵液在酶譜中顯示具有兩種分子質(zhì)量的木聚糖酶，在高產(chǎn)木二糖的同時(shí)，木糖的產(chǎn)量也在一定程度上限制了其在低聚木糖生產(chǎn)工業(yè)中應(yīng)用。研究擬先通過巢式PCR[9]獲得L10608中木聚糖酶基因的全長，并對(duì)該木聚糖酶基因進(jìn)行序列分析。為進(jìn)一步闡明木聚糖酶結(jié)構(gòu)與水解產(chǎn)物的聯(lián)系，提高酶蛋白的水解產(chǎn)物中功能低聚木糖等提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。研究同時(shí)對(duì)獲得的兩段木聚糖酶基因GH-xyn10/11進(jìn)行原核表達(dá)驗(yàn)證其酶活力，構(gòu)建木聚糖酶GH-xyn10/11的原核大腸桿菌（E.coli）BL21（DE3）表達(dá)系統(tǒng)，奠定對(duì)該基因后續(xù)進(jìn)行更深層次研究的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株L10608為實(shí)驗(yàn)室所篩選保藏（CGMCC NO.13271），酶學(xué)性質(zhì)優(yōu)良，且產(chǎn)物中低聚木糖含量較高，具有潛在的改造應(yīng)用價(jià)值?？寺≥d體pMD18-T、表達(dá)載體pET28-a，日本TaKaRa公司；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、E.coli BL21（DE3），天根生化科技有限公司。真菌DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒，美國OMEGA公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，中國Solarbio公司；瓊脂糖，西班牙Biowest；其余試劑均為國產(chǎn)分析純級(jí)。序列測(cè)定由華大基因完成。

1.2 儀器與設(shè)備

PCR儀，德國Biometra公司；凝膠成像儀ImageQuant300、MultitempIII恒溫循環(huán)水浴器，美國GE公司；瓊脂糖凝膠電泳儀，北京六一；DHZ-DA全溫振蕩器，江蘇太倉培英；Sigma1-14小型臺(tái)式離心機(jī)，美國Sigma公司；HR60-IIA2生物安全柜，青島海爾特種電器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海STIK公司；DHZ-DA大容量全溫振蕩器，江蘇太倉實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基：酵母粉 5 g/L，NaCl 10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，pH 7.0；LB固體培養(yǎng)基需加入瓊脂粉20 g/L。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 基因組DNA的提取及編碼基因保守序列擴(kuò)增 將菌株L10608接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃，180 r/min培養(yǎng)24 h，吸取菌液1.5 mL置于2 mL離心管中10 000×g室溫離心5 min，得到菌體。參考OMEGA基因組提取試劑盒說明書提取細(xì)菌基因組。取5 μL混合6*loading buffer上樣，進(jìn)行1%質(zhì)量分?jǐn)?shù)瓊脂糖凝膠電泳。

根據(jù)GenBank中已經(jīng)發(fā)表的青霉及曲霉所產(chǎn)GH11/10族木聚糖酶基因序列，在Block Maker網(wǎng)站設(shè)計(jì)簡并引物，引物設(shè)計(jì)采用primer5.0，引物設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 簡并引物序列Table1 Primers for xyn-core

以所提取的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得木聚糖酶基因的保守序列；通過基因組步移巢式PCR的方法獲得木聚糖酶基因的側(cè)翼，巢式PCR程序參考文獻(xiàn)[10]。采用兩輪PCR擴(kuò)增，第2輪擴(kuò)增以第1輪擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物稀釋40倍為模板，將所得保守序列以及側(cè)翼序列運(yùn)用DNAMAN軟件進(jìn)行拼接得到木聚糖酶基因的全長。引物設(shè)計(jì)采用primer5.0，引物設(shè)計(jì)如表2所示。第1輪PCR擴(kuò)增選用Q5超保真DNA聚合酶，以基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增（98℃ 30 s；98℃ 8 s；59℃25 s；72 ℃ 20 s；循環(huán) 30 次；72 ℃ 2 min），擴(kuò)增反應(yīng)體系參照Q5超保真DNA聚合酶說明書標(biāo)準(zhǔn)體系；第2輪將第1輪的PCR產(chǎn)物膠回收作為模板，選用LA taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增（95℃ 3 min；95℃ 30 s；59 ℃ 30 s；72 ℃ 45 s；循環(huán) 30 次；72 ℃10 min）。

表2 擴(kuò)增木聚糖酶基因xyn A保守序列以及側(cè)翼序列引物設(shè)計(jì)Table2 Primers for xyn A conserved sequence and flanking sequence

1.4.2 木聚糖酶基因cDNA的擴(kuò)增對(duì)拼接好的含木聚糖酶基因開放讀碼框（ORF）的一段序列進(jìn)行分析，根據(jù)該基因編碼的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量，確定ORF的起始密碼子（ATG）和終止密碼子（TGA，TAA，TAG），即得到木聚糖酶基因xyn-GH10與xyn-GH11。在NCBI網(wǎng)站上對(duì)基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，并設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的引物（表3），以擴(kuò)增木聚糖酶基因片段。

表3 擴(kuò)增全長序列帶酶切位點(diǎn)的引物Table3 Amplification full-length sequence primers with enzyme

按照設(shè)計(jì)好的全長引物進(jìn)行常規(guī)PCR得到全長序列，將PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。膠回收產(chǎn)物與pMD18-T克隆載體在16℃保溫3 h進(jìn)行連接，42℃，60 s熱激導(dǎo)入E.coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有 IPTG、X-gal、Amp的LB平板，37℃培養(yǎng)過夜，通過藍(lán)白斑篩選，挑取陽性克隆子，送至北京華大基因研究中心測(cè)序確認(rèn)。

1.4.3 木聚糖酶基因序列分析 基因序列分析主要由理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)3個(gè)部分分析組成。理化性質(zhì)包括蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的分析網(wǎng)站：http：//web.expasy.org/protparam/；蛋白質(zhì)的疏水性質(zhì)分析網(wǎng)站：http：//web.expasy.org/protscale/；跨膜區(qū)域的預(yù)測(cè)網(wǎng)站：http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/；結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)網(wǎng)站：http：//smart.emblheidelberg.de/與 http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域中催化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)網(wǎng)站：http：//prosite.expasy.org/；蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析網(wǎng)站：http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/和http：//www.compbio.dundee.ac.uk/jpred/；蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)網(wǎng)站http：//swissmodel.expasy.org/interactive和三級(jí)結(jié)構(gòu)的比對(duì)http：//www.rcsb.org/pdb/secondary.do?p=v2/secondary/search.jsp#search_sequences。

1.4.4 重組質(zhì)粒pET28a-xyn-GH10/11連接與轉(zhuǎn)化 獲得目的基因xyn-GH10/11后，用NcoRⅠ和XhoⅠ同時(shí)對(duì)表達(dá)載體pET28a和帶有酶切位點(diǎn)的xyn-GH10/11進(jìn)行雙酶切，37℃反應(yīng)3 h。酶切過后通過1%質(zhì)量分?jǐn)?shù)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并切膠回收帶有粘性末端的xyn-GH10/11和線性化pET28a。

用T4DNA連接酶將回收的帶有粘性末端的xyn-GH10/11和線性pET28a按摩爾比1～7，置于反應(yīng)體系中連接，25℃中反應(yīng)1 h，從而構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-xyn-GH10/11。

將10 μL連接體系以體積比1∶5的關(guān)系加入到剛?cè)诨腂L21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，輕柔地混勻，冰浴30 min，42℃熱擊60 s，隨即靜置于冰上2 min。并將其混合物轉(zhuǎn)移到裝有1 mL預(yù)熱至37℃的SOC培養(yǎng)基中，37℃，175 r/min振蕩1 h使菌體復(fù)蘇。將上述菌液在無菌條件下涂布至LB抗性篩選平板，37℃倒置培養(yǎng)，直至菌落長出。

1.4.5 重組蛋白表達(dá)及酶活力測(cè)定 挑取驗(yàn)證成功的轉(zhuǎn)化子對(duì)其進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)[11]。（1）菌種活化：將轉(zhuǎn)化子接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基，37℃，200 r/min過夜培養(yǎng)。（2）擴(kuò)大培養(yǎng)：以2%的接種量，將活化菌液轉(zhuǎn)接至100 mL的LB液體培養(yǎng)基（含 40 μg/mL 卡納霉素）中，37℃，180 r/min 培養(yǎng)至OD600在0.6～0.8之間。（3）誘導(dǎo)產(chǎn)酶：在無菌條件下，添加IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，16℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)16 h，誘導(dǎo)產(chǎn)酶。（4）超聲破壁獲得粗酶液：4℃下，8 000×g離心 5 min，棄上清收集菌體，用0.02 mol/L，pH 5.5醋酸緩沖液重懸菌體。對(duì)重懸液超聲破壁，離心后保留上清即獲得粗酶液。木聚糖酶活力的測(cè)定參照DNS法[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 木聚糖酶基因xynA保守序列以及側(cè)翼序列擴(kuò)增

電泳如圖1a，其中泳道1，2，3為xyn10族核心片段，大小接近200 bp左右的條帶，泳道4，5，6大小為250 bp左右的條帶xyn11族的核心片段，切膠回收，連接T載體pMD18-T進(jìn)行測(cè)序，分別得到一段大小為176 bp與239 bp的序列，即為10族和11族的核心序列xyn-Core。

依據(jù)基因組步移巢式PCR的方法對(duì)11族片段3’端與5’端以LAD1-4為引物進(jìn)行側(cè)翼序列的擴(kuò)增。經(jīng)二次擴(kuò)增后得到了1 500 bp和2 000 bp大小的兩條亮帶，切膠回收，連T克隆載體測(cè)序。分別得到L10608-xyn11的3’端與5’端側(cè)翼序列片段。依照方法1.4.1節(jié)中10族核心片段進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，經(jīng)第1輪擴(kuò)增后，以LAD1-3為引物擴(kuò)增時(shí)在750 bp左右均出較為單一且特異性較好的條帶，可直接切膠回收連T克隆載體測(cè)序得到5’端側(cè)翼序列。同時(shí)以LAD-4為引物時(shí)在750 bp與1 500 bp處均出現(xiàn)較為單一的條帶，為避免側(cè)翼步移長度不足，將1 500 bp處條帶切膠回收連T克隆載體測(cè)序得到3’端側(cè)翼序列。

將連接PMD18-T的送出測(cè)序后得到的基因序列進(jìn)行對(duì)接，特異性設(shè)計(jì)引物是基于核心片段的兩側(cè)所設(shè)計(jì)的，因此得到的側(cè)翼片段與核心有部分重疊，使用DNAMAN對(duì)兩個(gè)片段重疊一致部分進(jìn)行拼接，在基因組步移距離足夠的情況下，得到基因的全長。

2.2 木聚糖酶基因序列全長及cDNA序列的獲得

圖1 核酸電泳圖Fig.1 Nucleic acid electrophoresis

拼接核心序列和側(cè)翼序列得到基因全長xyn-GH10/11。經(jīng)NCBI比對(duì)可以確定分別得到以ATG為起始密碼子，TGA為終止密碼子的木聚糖酶10族與11族基因。得到兩段基因全長為之后進(jìn)行序列的生物信息學(xué)分析及水解產(chǎn)物研究提供了材料。采用帶有酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增全長片段，結(jié)果如圖1b所示，1～4泳道為xyn10族基因在1 500 bp處有明顯的目的基因條帶，5、6泳道為xyn11族基因在700 bp左右處有明顯的目的基因條帶。分別切膠回收連接T載體測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明未發(fā)生突變?？蓪⑺眠B接木聚糖酶10族與11族基因的PMD18-T質(zhì)粒用于后續(xù)研究?；虻娜蛄薪?jīng)測(cè)序后如圖2a、圖2b所示，找到完整的開放閱讀框，10族木聚糖酶基因全長1 462 bp，11族木聚糖酶基因全長729 bp。經(jīng)測(cè)序可得xyn-GH10/11序列如圖2所示。

圖2 基因序列全長Fig.2 Full length of gene sequence

2.3 木聚糖酶基因的序列分析

xyn-GH11蛋白序列中包含242氨基酸；預(yù)測(cè)氨基酸分子質(zhì)量：24.003 ku；理論pI等電點(diǎn)：8.98；氨基酸組成中最多為Gly（G）有42個(gè)占17.4%；帶負(fù)電的氨基酸殘基數(shù)目（Asp+Glu）為13個(gè)；帶正電的氨基酸數(shù)目（Arg+Lys）為17個(gè)；預(yù)測(cè)分子式：C1142H1685N323O363S8；蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)：25.92，低于閾值40，因此判斷為穩(wěn)定蛋白；圖3a為各個(gè)位點(diǎn)的親疏水系數(shù)，平均親水系數(shù)：-0.5369可判斷為親水蛋白。由xyn-GH10的預(yù)測(cè)結(jié)果可知，xyn-GH10蛋白序列包含476個(gè)氨基酸；預(yù)測(cè)氨基酸分子質(zhì)量：50.677 ku；理論 pI等電點(diǎn)：6.98；氨基酸組成中Ala（A）有57個(gè)占12.0%最多；帶負(fù)電的氨基酸殘基數(shù)目（Asp+Glu）為41個(gè)；帶正電的氨基酸數(shù)目（Arg+Lys）為41個(gè)；預(yù)測(cè)分子式：C2188H3399N653O705S17；蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)：27.33，低于閾值40，因此判斷為穩(wěn)定蛋白；圖3b為各個(gè)位點(diǎn)的親疏水系數(shù)，平均親水系數(shù)：-0.365可判斷為親水蛋白。

圖3 氨基酸親疏水性分析Fig.3 Hydrophilic-hydrophobic property analysis of amino acid

如圖4a可見xyn-GH11酶蛋白唯一可能存在的跨膜區(qū)域位22-48處于信號(hào)肽部分。信號(hào)肽預(yù)測(cè)為“MHQDGSQQDRTQNPAPFGGLSRRGFLV GAGTGAAALAAGSGLLLPGTAHA”1-50 位 氨 基酸。而xyn-GH10蛋白很可能不存在任何跨膜蛋白如圖4b。經(jīng)信號(hào)肽預(yù)測(cè)可知其含有一段1-41位氨基酸“MGIQALPRAAVRQKLRTPLPALAAGVL GLTAALVPPTNADA”的信號(hào)肽序列。

圖4 跨膜蛋白預(yù)測(cè)分析Fig.4 Analysis of transmembrane protein

蛋白序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析如圖5a所示，xyn-GH11蛋白質(zhì)序列共含2個(gè)α螺旋，有一個(gè)在信號(hào)肽中，有14個(gè)β片層。如圖5b所示，xynGH10蛋白質(zhì)序列共含12個(gè)α螺旋，有一個(gè)在信號(hào)肽中，有15個(gè)β片層。

如圖6中NCBI的結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示：氨基酸第61位到第239為Glyco_hydro11結(jié)構(gòu)域，e-value為3.2e-73，小于10-6，證明其結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)可靠。無其它有效的結(jié)構(gòu)域。經(jīng)NCBI與Streptomyces sp.JHA19 11家族木聚糖酶（NCBI accession number：WP_055619964）序列相似度為100%，可以確定其為木聚糖酶11家族基因序列。

圖5 酶蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Prediction of enzyme protein secondary structure

圖6 xyn-GH11預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)域Fig.6 Structural domain prediction of xyn-GH11

如圖6b所見，該序列分析具有：功能區(qū)域雙精氨酸易位信號(hào)（雙精氨酸易位（TAT）途徑提供跨越傳感能量膜輸送折疊的蛋白質(zhì)，該區(qū)域?qū)儆谛盘?hào)肽部分）；以及功能區(qū)域GH11_3糖苷水解酶家族 11（GH11）域：56-241 與圖6a的NCBI預(yù)測(cè)接近；預(yù)測(cè)催化位點(diǎn)（在圖中為紅點(diǎn)表示）136位谷氨酸為親核體228位谷氨酸為質(zhì)子供體。

如圖7a在NCBI的結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示：氨基酸第46位到第338為Glyco_hydro10結(jié)構(gòu)域，e-value為4.5e-69，小于10-6，證明其結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)可靠。366-472為RICIN_B_lectin結(jié)構(gòu)域，預(yù)測(cè)該結(jié)構(gòu)域有纖維素酶活性?；蛐蛄信c Streptomyces sp.JHA19 10家族基因木聚糖酶（GenBank accession number：WP_055619031）相似度為100%，可確定其為10家族木聚糖酶基因序列。

如圖7b所見，該序列分析具有：功能區(qū)域GH10_2為40-340位，與NCBI預(yù)測(cè)結(jié)果相近；以及功能區(qū)域RicinB-typelectin篦麻毒素結(jié)構(gòu)域在362-476位與圖7a的NCBI同樣預(yù)測(cè)接近，同時(shí)其中包含三對(duì)二硫鍵 365-384，407-424，448-465；預(yù)測(cè)催化位點(diǎn)（在圖中為紅點(diǎn)表示）277位谷氨酸為親核體169位谷氨酸為質(zhì)子供體。

蛋白序列的三級(jí)結(jié)構(gòu)的分析使用建模網(wǎng)站SWISS-MODEL對(duì)已知序列建立模型，如表4中所示RMSD<2.0?，在規(guī)定的范圍內(nèi)是可靠的。且從圖8a和圖8b中可以看出重合度較高，xyn-GH11相似度為84.4%，xyn-GH10相似度為72.6%，均高于40%，屬于可信的模板。

圖7 xyn-GH10預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)域Fig.7 Structural domain prediction of xyn-GH10

表4 GH10/11序列建模RMSD預(yù)測(cè)Table4 GH10/11 sequence modeling RMSD prediction

圖8 酶蛋白序列的三級(jí)結(jié)構(gòu)的分析（a）xyn-GH11經(jīng)SWISS-MODEL建模與其模板1hix的比對(duì)；（b）xyn-GH10經(jīng)SWISS-MODEL建模與其模板1XYF比對(duì)（模板不包括RicinB-lectin結(jié)構(gòu)域）Fig.8 Analysis of tertiary structure of enzyme protein（a）xyn-GH11 by SWISS-MODEL modeling and its template 1hix comparison；（b）xyn-GH10 by SWISS-MODEL modeling and its template 1XYF comparison（without RicinB-lectin structure）

2.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及驗(yàn)證

采用T4DNA連接酶將經(jīng)過雙酶切的xynAGH10/11和pET28a進(jìn)行連接，并得到重組質(zhì)粒。按方法3.3.2節(jié)中構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-xyn的構(gòu)建，NcoRⅠ和XhoⅠ將外源片段導(dǎo)入pET28a中，并利用Kan抗生素進(jìn)行篩選。

將隨機(jī)挑選的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR，采用T7與T7ter做為引物時(shí)，會(huì)在目的片段兩端加約150 bp左右的PET28A質(zhì)粒的片段，如圖8a與圖8b中可以看到749 bp的xyn-GH11加上質(zhì)粒的部分在接近1 000 bp的位置出現(xiàn)了明亮的條帶，1 462 bp的xyn-GH10加上質(zhì)粒的部分在接近2 000 bp的位置出現(xiàn)了明亮的條帶，用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)20 h后送出菌液測(cè)序，均與得到的基因序列一致。

圖9 克隆子驗(yàn)證PCR電泳圖Fig.9 Clone of xyn-GH11 and xyn-GH10 was verified by PCR

2.5 重組蛋白IPTG誘導(dǎo)表達(dá)

按照1.4.5節(jié)中DNS法測(cè)定酶活。如表5可見信號(hào)肽對(duì)表達(dá)酶活影響較大，10族與11族木聚糖酶未剪切信號(hào)肽的重組酶酶活均高于剪切信號(hào)肽重組酶酶活?？赡苡捎谛盘?hào)肽部分位于木聚糖酶基因的N端，N端的改變對(duì)木聚糖酶酶活有一定影響，李琴等[13]分別對(duì)通過N端延伸與定點(diǎn)突變結(jié)合的技術(shù)手段，構(gòu)造了3個(gè)突變體SrxynF，SrxynM與SrxynFM酶活分別上升了 2.1倍，3.2倍和5.3倍，與此同時(shí)，其水解產(chǎn)物中具有益生元作用的低聚木糖含量上升，木糖含量下降。Zheng等[14]研究的N端改造體xyn△NC4在以櫸木木聚糖、樺木木聚糖和燕麥木聚糖為底物時(shí)，酶活分別上升了1.78倍，2.23倍和1.4倍。Cheng等[15]對(duì)來自Neocallinmastix patriciarum的木聚糖酶切除了N端的11個(gè)氨基酸后，酶活力在55℃與75℃時(shí)的的殘余酶活分別為61.5%與19.5%。

表5 重組蛋白的酶活測(cè)定Table5 Determination of enzyme activity of recombinant proteins

3 結(jié)論

隨著低聚木糖在諸多領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，采用木聚糖酶酶解生產(chǎn)低聚木糖的生產(chǎn)方式相較物理化學(xué)等其它方式體現(xiàn)出環(huán)保、高效的優(yōu)勢(shì)[16]。然而通過篩選的天然產(chǎn)木聚糖酶菌株來生產(chǎn)低聚木糖的模式存在天然酶產(chǎn)量低，催化效率低，產(chǎn)酶不穩(wěn)定等問題。因此實(shí)現(xiàn)木聚糖酶的實(shí)際工業(yè)應(yīng)用逐漸成為人們研究的焦點(diǎn)[17]。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，利用基因工程改造菌株特性，構(gòu)建工程菌株的方法成為解決這些問題的有效手段[18]。常用的基因工程手段如通過定點(diǎn)突變木聚糖酶序列中的氨基酸，除了影響酶自身的性質(zhì)還會(huì)改變與底物的結(jié)合能力，當(dāng)改變結(jié)合方式時(shí)，水解產(chǎn)物的種類或所占比例會(huì)受影響。

研究根據(jù)GenBank上已發(fā)表的來源于鏈霉菌屬的兩個(gè)不同家族木聚糖酶基因序列，通過巢式PCR方法從克隆出Streptomyces.sp L10608的兩段編碼木聚糖酶基因序列xyn-GH10和xyn-GH11。xyn-GH10蛋白序列包含476個(gè)氨基酸，12個(gè)α螺旋，15個(gè)β片層。預(yù)測(cè)氨基酸分子質(zhì)量：50.677 ku；理論等電點(diǎn) pI：6.98；經(jīng)信號(hào)肽預(yù)測(cè)可知其含有一段1-41位氨基酸 “MGIQALPRAAVRQKL RTPLPALAAGVLGLTAALVPPTNADA”的信 號(hào) 肽序列；除催化域結(jié)構(gòu)外，第366-472位為RICINB-lectin結(jié)構(gòu)域，該非催化結(jié)構(gòu)域有纖維素酶活性。277位谷氨酸為親核體169位谷氨酸為質(zhì)子供體。xyn-GH11蛋白序列中包含242氨基酸，共含2個(gè)α螺旋，有一個(gè)在信號(hào)肽中，有14個(gè)β片層；預(yù)測(cè)氨基酸分子質(zhì)量：24.003 ku；理論等電點(diǎn)pI：8.98；信號(hào)肽預(yù)測(cè)為“MHQDGSQQDRTQNPAPFG GLSRRGFLVGAGTGAAALAAGSGLLLPGTAHA”的1-50位氨基酸；預(yù)測(cè)催化位點(diǎn)為136位谷氨酸為親核體228位谷氨酸為質(zhì)子供體。

研究在對(duì)Streptomyces.sp L10608來源的木聚糖酶基因xyn-GH10/11進(jìn)行分子克隆的基礎(chǔ)上，采用分子生物學(xué)手段分析其酶結(jié)構(gòu)，通過原核表達(dá)的方式得到了具有生物活性的酶蛋白，并對(duì)其是否帶信號(hào)肽基因序列進(jìn)行表達(dá)，發(fā)現(xiàn)保留信號(hào)肽的重組酶表達(dá)酶活更高，研究為后續(xù)深入研究不同家族的木聚糖酶的水解特性，以及針對(duì)基因序列的改造等基因工程研究提供了基礎(chǔ)材料及理論依據(jù)。