小鼠活體腦部生物活性分子的熒光成像研究進(jìn)展

王昕　李平　張雯　唐波

摘?要?大腦在分子水平上具有獨(dú)特的化學(xué)組成和反應(yīng)活性。腦部的生物活性分子（包括金屬離子，活性氧物種，神經(jīng)遞質(zhì)及神經(jīng)遞質(zhì)水解酶等）在腦功能的行使過程中，扮演著不同卻又極其關(guān)鍵的角色。正常穩(wěn)態(tài)濃度的生物活性分子對維持穩(wěn)定的腦部和功能發(fā)揮了重要作用，而生物活性分子水平的異常變化又與帕金森病、阿爾茲海默癥、抑郁癥等多種腦部疾病的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。因此探究大腦中生物活性分子的濃度及調(diào)控作用，對揭示大腦的奧秘、理解腦部疾病的發(fā)生和發(fā)展具有重要作用。熒光成像方法具有高靈敏、高時(shí)空分辨、易操作等優(yōu)勢，是探究大腦中生物活性分子的真實(shí)濃度和功能的重要工具。近年來，隨著熒光成像技術(shù)的發(fā)展，研究者構(gòu)建了多種熒光探針用于檢測鼠腦中生物活性分子。本文綜述了近年來用于大腦中生物活性分子檢測的分子探針、納米探針及蛋白探針的發(fā)展概況，探討了構(gòu)建新型熒光探針、利用熒光成像方法進(jìn)一步深入剖析生物活性分子調(diào)控大腦功能等方面的研究，對未來的發(fā)展進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞?熒光探針; 腦部成像; 生物活性分子; 評述

1?引 言

大腦作為神經(jīng)系統(tǒng)最高級的器官，是認(rèn)知和運(yùn)動功能的指揮中心，具有獨(dú)特和復(fù)雜的物質(zhì)結(jié)構(gòu)[1]。在分子水平上，大腦該特殊的器官具有獨(dú)特的化學(xué)組成和反應(yīng)活性[2]。大腦的化學(xué)組成復(fù)雜，而且大腦的物質(zhì)組成中包含著許多獨(dú)特的分子，其中許多只存在于神經(jīng)系統(tǒng)中。這些不同的分子對于腦功能的行使，扮演著不同卻又非常關(guān)鍵的角色[3]。例如，大腦中的金屬離子（Ca2+＼， Cu2+＼， Zn2+＼， Fe2+等）對維持生物分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和功能發(fā)揮了重要的作用[4]，包括核酸折疊、轉(zhuǎn)錄、催化、離子通道和傳遞信號等;神經(jīng)遞質(zhì)（5?羥色胺、多巴胺、乙酰膽堿等）在突觸傳遞中承擔(dān)著“信使”的角色，維持神經(jīng)元彼此之間的相互通訊聯(lián)系等[5，6]。但是，生物活性分子水平的異常變化又與帕金森病、阿爾茲海默癥、抑郁癥等多種腦部疾病的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。 研究發(fā)現(xiàn)， 帕金森?。≒D）患者腦中Fe2+含量增加[7]，進(jìn)而導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生和活性氧物種（ROS）的爆發(fā)[8];抑郁癥患者腦中神經(jīng)遞質(zhì)5?羥色胺含量下降[9];阿爾茲海默癥（AD）患者腦部Aβ淀粉樣蛋白含量顯著增多[10，11]等。因此，準(zhǔn)確檢測大腦中生物活性分子的濃度并深入探究其在大腦中的功能及相關(guān)調(diào)控機(jī)制，對揭示大腦的奧秘、闡明腦部疾病的病理機(jī)制顯得尤為重要。

目前， 用于腦部成像的方法有計(jì)算機(jī)X線斷層攝影（CT掃描）[12]、正電子發(fā)射斷層掃描術(shù)（PET）[13]、磁共振成像（MRI）及血管造影術(shù)[14]等。然而，上述方法均無法實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)示蹤活性分子濃度變化。由于熒光成像方法具有高靈敏、高時(shí)空分辨、易操作等優(yōu)勢，原位熒光成像分析方法已成為目前實(shí)現(xiàn)對大腦中生物活性分子的真實(shí)濃度檢測和功能探究最理想的手段[15～17]。而該方法的核心技術(shù)是構(gòu)建可用于大腦中特異性檢測的熒光探針。因此，近年來，眾多課題組設(shè)計(jì)合成了多種熒光探針，并用于檢測小鼠神經(jīng)元和大腦中的金屬離子、活性氧物種、神經(jīng)遞質(zhì)及神經(jīng)遞質(zhì)水解酶等[18]。本文從被檢測的生物活性分子出發(fā)，綜述了近年用于大腦中生物活性分子檢測的分子探針、納米探針以及蛋白探針的發(fā)展，并在構(gòu)建新型熒光探針、利用熒光成像方法進(jìn)一步深入剖析生物活性分子調(diào)控大腦功能等方面進(jìn)行探討與展望。

2?檢測金屬離子的熒光探針

在過去的幾十年里，研究者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞/組織中金屬離子的異常穩(wěn)態(tài)與多種疾病有關(guān)，如神經(jīng)退行性疾病，癌癥和糖尿病等。雖然它們在疾病病理中的確切作用尚不清楚，但越來越多的疾病已被定性為金屬離子失衡相關(guān)的疾病[4]。如神經(jīng)退行性疾病腦組織中存在Cu2+、Zn2+、Fe2+等轉(zhuǎn)運(yùn)金屬離子的異常積累[19]。Cu2+水平升高已被證明與阿爾茲海默癥有關(guān)。在抑郁癥患者的外周血內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了Zn2+和Cu2+濃度的異常變化。帕金森病患者腦中的Fe2+含量增加。因此，在活體、細(xì)胞中，甚至在單個(gè)細(xì)胞器和亞細(xì)胞間隔的水平上，精確監(jiān)測金屬離子的濃度，進(jìn)而探究其功能，對于理解這些疾病和發(fā)展診斷方法至關(guān)重要。

2.1?檢測Zn2+的熒光探針

Zn2+的金屬?神經(jīng)化學(xué)是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。Zn是人腦中第二豐富的d區(qū)金屬，在海馬區(qū)中含量較高。腦內(nèi)的Zn2+存在類型通常分為兩種：蛋白結(jié)合型和松散結(jié)合型，后者也被稱為流動型鋅。目前，流動型鋅的神經(jīng)生理學(xué)和神經(jīng)病理學(xué)意義尚不清晰。由于Zn本身不具有典型的光譜特征，因此，探究Zn2+在大腦內(nèi)的分布、遷移和功能，就需要發(fā)展具有高選擇性、時(shí)空可分辨的熒光成像工具[20]。

Li等[21]設(shè)計(jì)并合成了一種基于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移的雙光子比率熒光探針（探針1），并將其用于活細(xì)胞、海馬組織和斑馬魚內(nèi)Zn2+的成像分析。 探針1可快速、高選擇性識別Zn2+，并且具有高的雙光子吸收截面和量子產(chǎn)率。探針1的初始發(fā)射峰在465 nm處，隨著Zn2+濃度的增加而下降，初始發(fā)射峰的熒光強(qiáng)度逐漸降低，同時(shí)在550 nm處生成一個(gè)新的發(fā)射峰，且熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，這使得探針1對Zn2+的比率檢測具有較高的準(zhǔn)確度。而且探針1可進(jìn)行熒光壽命成像，并準(zhǔn)確地反映Zn2+在單細(xì)胞水平上的分布。由于探針1擁有雙光子熒光深層組織穿透的顯著優(yōu)勢，成功地對小鼠大腦組織切片和斑馬魚中Zn2+進(jìn)行了深度成像，并揭示出AD小鼠海馬組織中Zn2+水平高于正常小鼠。該探針具有快速響應(yīng)，高選擇性，優(yōu)異的雙光子性質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，為探究Zn2+在活體中的分布和功能提供了有力的成像工具，對闡明Zn2+在腦內(nèi)相關(guān)生理和病理過程發(fā)揮的作用具有重要意義（圖 1）。

為研究神經(jīng)元溶酶體內(nèi)Zn2+的功能，Zhu等[22]報(bào)道了一種靶向溶酶體、比率檢測Zn2+的探針（探針2）。探針2以BODIPY染料為母體，以二甲基吡啶胺（DPA）為Zn2+識別基團(tuán)，以嗎啉基團(tuán)為溶酶體的靶向基團(tuán)。根據(jù)軟硬酸堿理論，BODIPY熒光團(tuán)上的間位給電子基團(tuán)使該探針更傾向于與Zn2+絡(luò)合，而不是與Cd2+絡(luò)合，大大提高了探針的選擇性。與Zn2+結(jié)合后，探針2在578 nm處的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，578/680 nm處熒光強(qiáng)度的比值也發(fā)生變化。細(xì)胞共聚焦成像實(shí)驗(yàn)表明，探針2可定位到神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）、MCF?7細(xì)胞和Hela細(xì)胞的溶酶體中，并可實(shí)現(xiàn)NSCs內(nèi)外源性Zn2+的檢測。此外，通過雙發(fā)射比率成像，探針2還成功地用于檢測H2O2刺激下NSCs中溶酶體內(nèi)Zn2+的釋放。因此，基于高選擇性、細(xì)胞器靶向、雙發(fā)射比率成像的優(yōu)勢，探針2可作為一種潛在的工具洞察大腦中Zn2+在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮的作用（圖 1）。

Lee等[23]開發(fā)了一種新型雙光子熒光探針（探針3），用于選擇性檢測多種生物過程中溶酶體內(nèi)的Zn2+變化。作者將溶酶體的定位基團(tuán)嗎啉分子和Zn2+配體DPEN引入萘甲酰亞胺熒光染料中。探針3的最大吸收峰在450 nm處，只有在溶酶體pH值下，且Zn2+存在時(shí)才有熒光，該設(shè)計(jì)極大地提高了探針的選擇性和定位能力。在900 nm的激發(fā)光波長下，探針3可對小鼠大腦溶酶體內(nèi)較低濃度的Zn2+進(jìn)行可視化研究，探針3為探究溶酶體內(nèi)Zn2+調(diào)控的多種生物事件的分子機(jī)制提供了有效的雙光子成像工具（圖 2）。

Zn2+在谷氨酸能神經(jīng)元突觸前囊泡中累積，并且在神經(jīng)興奮時(shí)隨谷氨酸的釋放而釋放。為了在突觸水平上理解Zn2+的時(shí)空調(diào)控，Khan等[24]利用一種Zn2+響應(yīng)熒光探針（探針4）和雙光子熒光顯微鏡實(shí)現(xiàn)了對成年小鼠海馬切片齒狀回神經(jīng)元苔蘚纖維端NMDA受體依賴性長期電位介導(dǎo)的Zn2+動態(tài)成像。探針4以熒光素為母體，共價(jià)偶聯(lián)了兩個(gè)Zn2+的結(jié)合位點(diǎn)。在熒光素母體結(jié)構(gòu)上引入五氟芐基，是為了增加探針的pKa，從而改善pH值改變對探針熒光的干擾情況，此外，引入的兩個(gè)羧基增加了探針的膜滲透性。基于該探針良好的膜滲透性和優(yōu)異的雙光子性能，利用探針4孵育海馬苔蘚纖維端突觸前囊泡，可觀察到由于KCl誘導(dǎo)去極化后引起的細(xì)胞內(nèi)吞和囊泡修復(fù)，因而導(dǎo)致的單個(gè)神經(jīng)元突觸前的Zn2+信號降低的現(xiàn)象，表明突觸電位增強(qiáng)時(shí)Zn2+從囊泡釋放。這種突觸水平的雙光子Zn2+成像方法可監(jiān)測突觸前Zn2+的動態(tài)變化，有助于加深對Zn2+在正常和異常神經(jīng)功能中的生理作用的理解。該方法將進(jìn)一步促進(jìn)關(guān)于Zn2+恢復(fù)突觸可塑性和其它神經(jīng)功能的研究（圖 2）。

基于熒光團(tuán)的推拉電子效應(yīng)，Bourassa等[25]Fahrni課題組開發(fā)了一種具有膜透性的Zn2+熒光探針（探針5）。探針5在與Zn2+反應(yīng)前后具有明顯的熒光光譜位移，適用于熒光發(fā)射比率成像。探針5的Kd=1.5 nmol/L，對Zn2+展現(xiàn)出了較強(qiáng)的結(jié)合能力，可用于觀察小鼠成纖維細(xì)胞中Zn2+水平隨時(shí)間的變化情況。探針5具有優(yōu)異的雙光子熒光成像能力，尤其適合于在多種生理和病理?xiàng)l件下探索活細(xì)胞中Zn2+池的作用。他們使用探針5監(jiān)測細(xì)胞不同發(fā)育階段的少突膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中游離的Zn2+濃度。細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞分化時(shí)探針熒光強(qiáng)度的降低，表明在細(xì)胞成熟過程中，細(xì)胞內(nèi)Zn2+濃度整體降低。此外，雙光子比率熒光成像有利于觀察少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化過程中Zn2+的細(xì)微變化。在發(fā)育的少突膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞質(zhì)Zn2+的濃度范圍是135～152 pmol/L，而在成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，Zn2+的濃度在65～95 nmol/L范圍內(nèi)，比發(fā)育過程中Zn2+的濃度低了近2倍，這是首次利用雙光子比率熒光成像監(jiān)測到了細(xì)胞分化過程中Zn2+的變化。因此，探針5具有比率熒光成像的優(yōu)勢，以及可視化Zn2+穩(wěn)態(tài)變化的能力，為探索調(diào)控Zn2+穩(wěn)態(tài)和Zn2+信號傳導(dǎo)提供了有效手段（圖 2）。

Peng等[26]通過組裝摻鑭的上轉(zhuǎn)換納米粒子（UCNPs）合理設(shè)計(jì)和構(gòu)建了快速靈敏檢測水溶液中Zn2+的熒光傳感平臺（探針6）。以聚丙烯酸和化合物1構(gòu)建多層UCNPs，以NaYF4：Yb/Tm@NaYF4為能量供體，具有Zn2+反應(yīng)性的化合物1為能量受體，化合物1通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）猝滅UCNPs的上轉(zhuǎn)換發(fā)光（UCL）。化合物1與Zn2+結(jié)合后，抑制了FRET，UCNPs熒光恢復(fù)，從而實(shí)現(xiàn)Zn2+的定量監(jiān)測。探針6具有良好的光物理性能，較高的靈敏度（檢出限為0.78 μmol/L）、較快的反應(yīng)速度（反應(yīng)時(shí)間小于5 s），優(yōu)良的生物兼容性等優(yōu)點(diǎn)，可適用于AD腦組織切片和斑馬魚淀粉樣斑塊中Zn2+的體內(nèi)、體外檢測。該納米傳感系統(tǒng)為臨床醫(yī)學(xué)中與Zn2+相關(guān)的疾病診斷提供了新機(jī)會（圖 3）。

2.2?檢測Ca2+的熒光探針

Ca2+是細(xì)胞信號通路中重要的第二信使。它在許多細(xì)胞事件中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，如受精、發(fā)育、學(xué)習(xí)和記憶，觸發(fā)免疫、神經(jīng)內(nèi)分泌和神經(jīng)元細(xì)胞的分泌過程[27，28]。因此，精確監(jiān)測Ca2+的濃度，繪制Ca2+信號的時(shí)空圖譜，進(jìn)而探究其功能對于理解Ca2+的生物學(xué)功能至關(guān)重要。研究者已開發(fā)了多種成像材料，用于準(zhǔn)確檢測Ca2+的濃度和分布。

Roberts等[29]發(fā)展了一種具有選擇性和細(xì)胞滲透性的Ca2+光聲傳感器（探針7）。探針以氨基部花菁為熒光和光聲信號母體，以1，2?雙（2?氨基苯氧基）乙烷?N，N，N'，N'?四乙酸（BAPTA）為Ca2+螯合基團(tuán)，并引入乙酰氧基甲基酯，提高探針生物兼容性。探針7與Ca2+結(jié)合后，吸收光譜藍(lán)移，基于光誘導(dǎo)電荷轉(zhuǎn)移（PCT）機(jī)制，探針的光聲信號明顯降低，對Ca2+表現(xiàn)出特異性光聲響應(yīng)。通過熒光和光聲成像技術(shù)，首次實(shí)現(xiàn)了對未經(jīng)基因修飾的細(xì)胞和心臟器官以及斑馬魚幼蟲的大腦中的Ca2+的實(shí)時(shí)成像（圖 4）。

Mishra等[30]還設(shè)計(jì)了一種新型Ca2+近紅外可逆光聲探針（探針8），將Ca2+螯合劑APTRA連接到七甲基花菁染料上，實(shí)現(xiàn)Ca2+光聲成像。基于探針8與Ca2+結(jié)合前后，光聲信號的可逆變化，實(shí)現(xiàn)了對Ca2+的波動的光聲成像。此外，探針8對Ca2+的親和力是Mg2+的3倍，并可通過改變螯合部分和/或改變其在熒光團(tuán)上的位置，進(jìn)一步調(diào)節(jié)探針的選擇性。由于探針8結(jié)構(gòu)具有易修飾的特點(diǎn)，可作為平臺構(gòu)建一系列近紅外金屬熒光傳感器，用于深層組織中二價(jià)陽離子的光聲成像研究（圖 4）。

Liu等[31]合成了一種比率檢測Ca2+的納米熒光探針（探針9）。探針結(jié)構(gòu)中的兩個(gè)甲醛基團(tuán)為Ca2+配體（CaL），將CaL與聚乙烯亞胺（PEI）連接，利用席夫堿（Schiff base）合成了一種新的模板分子（PEI?CaL）。PEI?CaL不僅是Ca2+的特異性識別元件，而且是合成銅納米團(tuán)簇（CuNCs）的配體。他們以PEI?CaL為模板，在抗壞血酸（AA）存在下還原Cu2+，合成了CuNCs，將商業(yè)化熒光分子Alexa Fluor 660 （AF660）偶聯(lián)到制備好的CuNCs表面，以此得到了比率檢測Ca2+的納米熒光探針。該探針的熒光強(qiáng)度與Ca2+濃度具有良好的線性關(guān)系，檢測范圍為2～350 μmol/L，檢出限為（220±11） nmol/L。此外，探針9對Ca2+的響應(yīng)時(shí)間小于2 s，穩(wěn)定性好，選擇性高。鑒于探針9具有低細(xì)胞毒性、良好的生物相容性和快速響應(yīng)動力學(xué)的優(yōu)勢，可應(yīng)用于神經(jīng)元Ca2+的生物傳感和成像。利用探針9，發(fā)現(xiàn)組胺誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)中Ca2+增加程度的異質(zhì)性，神經(jīng)元近端軸突Ca2+的增加與胞體相似，遠(yuǎn)端軸突Ca2+的變化小于胞體，而樹突Ca2+濃度無明顯變化。此外，他們還發(fā)現(xiàn)超氧陰離子誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡可能是由于神經(jīng)元Ca2+過載引起的，這為理解氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的機(jī)制提供了新的視角（圖 5）。

基于二芳基乙烯的結(jié)構(gòu)，Lv等[41]設(shè)計(jì)并合成了可特異性檢測Aβ淀粉樣蛋白的熒光探針（探針17）。在Aβ淀粉樣蛋白的存在下，探針熒光強(qiáng)度顯著增加，并伴有光譜藍(lán)移現(xiàn)象。此外，該探針具有良好的光致變色性能，其熒光強(qiáng)度在紫外光和可見光的交替照射下可發(fā)生可逆變化，具有良好的抗疲勞性和抗光漂白性能。探針17可選擇性地成像大腦切片中的Aβ沉積。探針結(jié)構(gòu)中的DAE和ANCA部分對Aβ淀粉樣蛋白疏水區(qū)域的結(jié)合作用，極大提高了探針的對Aβ的結(jié)合效率?；谔结?7對Aβ淀粉樣的高選擇性識別，作者提出的該光控可變熒光成像策略為活體大腦高分辨成像提供了新思路（圖 8）。

Li等[42]開發(fā)了3種基于電子供體?受體結(jié)構(gòu)的新型近紅外染料（探針18，a～c）。該探針可與Aβ淀粉樣蛋白緊密結(jié)合，同時(shí)在近紅外區(qū)域有明顯的熒光增強(qiáng)。其中，烷基鏈長度適中的探針18b對Aβ淀粉樣蛋白具有最高的結(jié)合力和選擇性，同時(shí)探針具有較高穩(wěn)定性，較好親脂性，較低細(xì)胞毒性以及良好的血腦屏障通透性。對腦切片中的Aβ淀粉樣蛋白進(jìn)行熒光染色和對Tg小鼠進(jìn)行活體近紅外成像，結(jié)果表明探針18對Aβ淀粉樣蛋白具有良好的捕獲能力和清除能力，顯示了探針18作為近紅外探針在生物成像應(yīng)用中的優(yōu)勢。這是首個(gè)兼具在體內(nèi)對Aβ淀粉樣蛋白的近紅外成像和抑制Aβ淀粉樣蛋白聚集的多功能染料。該設(shè)計(jì)策略將為開發(fā)具有良好的血腦屏障通透性和生物相容性的，更有效的Aβ成像工具開辟了一條新途徑。該近紅外染料探針18在AD的診斷和治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景（圖 8）。

4?檢測活性氧（ROS）的熒光探針

氧化損傷與多種腦部疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[43]?；钚匝跷锓N（ROS）多具有較強(qiáng)的氧化能力，可造成生物大分子的嚴(yán)重?fù)p傷[44]，加速細(xì)胞衰老及死亡，從而導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生，探究活體腦部ROS濃度變化與腦部疾病的發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，將有助于加深對腦部疾病的發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制的理解。生物體內(nèi)ROS氧化性強(qiáng)、壽命短、濃度低，所以，高選擇性、高靈敏度、瞬時(shí)原位成像活體腦部的ROS一直是難題。近年來，研究者開發(fā)了多種熒光探針用于成像分析腦部的ROS的濃度變化。

Tang等[45]設(shè)計(jì)合成了一種新型的雙光子熒光成像探針（探針19），用于腦部羥基自由基（·OH）的成像。探針19與·OH發(fā)生自由基加成反應(yīng)，造成分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致探針19的熒光增強(qiáng);探針19結(jié)構(gòu)中的三氟甲基有助于分子穿過血腦屏障到達(dá)大腦，這是首個(gè)用于成像活體大腦中·OH的雙光子熒光探針。活體小鼠大腦雙光子成像結(jié)果表明，·OH的濃度在輕度與重度刺激導(dǎo)致的抑郁行為中有不同程度的明顯上升。通過蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)·OH是通過氧化去乙?；?（SIRT1），導(dǎo)致其失活，從而造成抑郁癥的發(fā)生。該工作為闡明抑郁癥的發(fā)生與發(fā)展的分子機(jī)制，為尋找治療靶點(diǎn)及預(yù)后評價(jià)提供了新方法（圖 9）。

基于臭氧（O3）與烯丁基中末端雙鍵發(fā)生特異性的環(huán)加成反應(yīng)，Li等[46]設(shè)計(jì)合成了一種用于檢測小動物活體腦部O3的近紅外熒光探針（探針20）。O3與探針20烯丁基中末端雙鍵發(fā)生特異性的環(huán)加成反應(yīng)，導(dǎo)致“前”七甲川花菁的共軛體系增大，發(fā)射出近紅外熒光。探針具有特異性、高靈敏度、組織穿透性深等優(yōu)點(diǎn)。作者利用探針20對小鼠腦部進(jìn)行了成像分析，首次揭示了抑郁癥小鼠腦內(nèi)O3含量較正常小鼠有明顯上升。他們還進(jìn)一步揭示了抑郁小鼠腦部過量的O3導(dǎo)致產(chǎn)生過量的促炎癥細(xì)胞因子IL8，進(jìn)而誘導(dǎo)抑郁癥的產(chǎn)生。該工作證明了O3的升高在抑郁癥的發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用，為在活體水平上探究抑郁癥相關(guān)的分子機(jī)制提供了新方法（圖 9）。

McQuade等[47]報(bào)道了一種基于Cu配合物的熒光探針（探針21），用于檢測小鼠腦內(nèi)NO的產(chǎn)生。作者將熒光團(tuán)與Cu的配體相連，配體通過分子內(nèi)光誘導(dǎo)的電子轉(zhuǎn)移而淬滅熒光團(tuán)熒光。探針與NO反應(yīng)后導(dǎo)致金屬的還原和/或配體的交換，從而熒光恢復(fù)。在模擬生理?xiàng)l件的緩沖液中，探針21對NO反應(yīng)迅速且具有較好的選擇性。探針21在細(xì)胞內(nèi)被酯酶水解，生成帶有負(fù)電荷、膜不滲透性的羧酸結(jié)構(gòu)，極大地提高了探針在細(xì)胞內(nèi)的駐留率。更重要的是，他們利用該探針成像發(fā)現(xiàn)了小鼠主嗅球組織切片上NO的產(chǎn)生?？傊?，該探針為更深入了解中樞神經(jīng)系統(tǒng)NO信號的時(shí)空特性和生理調(diào)節(jié)機(jī)制提供了有力的成像工具（圖10）。

5?檢測神經(jīng)遞質(zhì)及相關(guān)酶的熒光探針

大腦中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及多種神經(jīng)功能包括學(xué)習(xí)、獎賞、注意力和運(yùn)動控制等的發(fā)揮離不開神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)控。大腦中神經(jīng)遞質(zhì)的失調(diào)會導(dǎo)致精神疾病或神經(jīng)退行性疾病，如多動癥、精神分裂癥、帕金森氏病等。而神經(jīng)遞質(zhì)的失調(diào)與神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)的合成酶和水解酶直接相關(guān)[48]。因此，為更好地研究神經(jīng)遞質(zhì)及相關(guān)合成和水解酶在生理和病理過程中起到的作用，需要實(shí)時(shí)檢測活體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)及相關(guān)合成和水解酶變化?；诖?，研究者發(fā)展了許多檢測神經(jīng)遞質(zhì)及相關(guān)酶的熒光探針。

Sun等[49]開發(fā)出了可基因編碼的多巴胺探針（探針22）。該探針將對結(jié)構(gòu)變化敏感的綠色熒光蛋白（cpEGFP）嵌入到人源多巴胺受體，當(dāng)多巴胺受體結(jié)合多巴胺時(shí)，受體構(gòu)象發(fā)生變化，從而cpEGFP的熒光發(fā)生變化，這就將多巴胺該化學(xué)信號轉(zhuǎn)化為熒光信號。探針具有極高的分子特異性和時(shí)空分辨率，結(jié)合顯微成像技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測小鼠大腦內(nèi)多巴胺濃度的動態(tài)變化情況。此外，該課題組還對探針進(jìn)行了全方位的優(yōu)化，發(fā)展出具有高/低親和力的兩種探針，適用于多巴胺釋放量不同的腦區(qū)的成像。該研究策略為今后開發(fā)其它神經(jīng)遞質(zhì)的熒光探針開辟了新思路（圖11）。

基于相似的原理，Jing等[50]還首次成功開發(fā)了靈敏、特異、可遺傳編碼的乙酰膽堿熒光探針（探針23），通過對于神經(jīng)遞質(zhì)特異的G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）進(jìn)行改造，嵌入對結(jié)構(gòu)變化敏感的熒光蛋白，將受體在被神經(jīng)遞質(zhì)激活后的構(gòu)象變化轉(zhuǎn)變?yōu)闊晒獾鞍谉晒庑盘柕淖兓?，進(jìn)而反映對應(yīng)神經(jīng)遞質(zhì)的濃度變化。通過對乙酰膽堿受體的改造，以及一系列突變篩選和優(yōu)化，作者獲得了對于乙酰膽堿具有靈敏光學(xué)響應(yīng)的熒光探針，其對于生理濃度乙酰膽堿具有高信噪比的光學(xué)信號變化，并且具有較快的反應(yīng)速度（亞秒級）以及良好的分子特異性，可對乙酰膽堿信號進(jìn)行精確指征，并在不同生物體系中成功實(shí)現(xiàn)了內(nèi)源乙酰膽堿信號的實(shí)時(shí)檢測，為理解乙酰膽堿的神經(jīng)生物學(xué)功能提供了重要工具（圖12）。

乙酰膽堿酯酶（AChE）作為膽堿能系統(tǒng)中關(guān)鍵性的水解酶，直接決定了神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的代謝。Wang等[51]唐波課題組設(shè)計(jì)合成了一種高靈敏、高選擇性、實(shí)時(shí)、原位檢測活體腦部AChE活性的雙光子熒光探針（探針24）。該探針具有響應(yīng)迅速、高選擇性、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，首次利用該探針進(jìn)行雙光子成像分析，發(fā)現(xiàn)了重度抑郁癥小鼠腦內(nèi)AChE活性顯著高于正常小鼠。同時(shí)，借助雙光子超氧陰離子自由基指示劑，首次觀察到AChE水平的變化和超氧陰離子在抑郁癥過程中呈正相關(guān)，說明氧化應(yīng)激導(dǎo)致了AChE的過度激活，引發(fā)抑郁癥。該研究為氧化應(yīng)激調(diào)控AChE的活性在抑郁癥病理學(xué)過程中發(fā)揮的作用提供了新策略與新途徑。

Chao等[52]合成了兩個(gè)近紅外熒光探針， 探針25a和探針25b，并對其在不同組織中對AChE的檢測進(jìn)行了原位分析[52]。這兩種探針對AChE均表現(xiàn)出較高的親和力和選擇性，IC50值在nmol/L水平。探針25b對AChE具有很高的選擇性和靈敏度，也可應(yīng)用于AChE濃度較低的大腦區(qū)域，如在紋狀體區(qū)域進(jìn)行成像。此外，作者還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)AChE受到有機(jī)磷等有毒分子的抑制時(shí)，探針25b的結(jié)合也會受到影響。該工作為在生物體內(nèi)可視化檢測乙酰膽堿酯酶的活性提供了一種新工具（圖13）。

6?結(jié)論與展望

小分子、納米、蛋白和化學(xué)發(fā)光探針等多種成像工具均可實(shí)現(xiàn)成像分析神經(jīng)元及活體腦部的生物活性分子（包括金屬離子，活性氧物種，神經(jīng)遞質(zhì)及神經(jīng)遞質(zhì)水解酶等）的變化，但各類探針在解決不同的科學(xué)問題時(shí)各有優(yōu)勢。小分子探針具有操作簡便、生物相容性好的特點(diǎn)，更適用于原位、無損地檢測神經(jīng)元及活體腦部的生物活性分子的真實(shí)濃度，以及在病理狀態(tài)下的濃度改變;而納米探針具有易組裝的特點(diǎn)，更適于構(gòu)建具有多功能的成像工具，但由于血腦屏障的存在，活體成像受到限制;蛋白探針雖構(gòu)建復(fù)雜，但可實(shí)現(xiàn)大腦不同部位的精準(zhǔn)定位，更適于分析特定腦區(qū)的生物活性分子的濃度變化，從而深入分析其調(diào)控的神經(jīng)功能。因此，應(yīng)根據(jù)需要解決的問題和實(shí)際檢測的環(huán)境，合理設(shè)計(jì)與應(yīng)用成像工具。

盡管目前已經(jīng)發(fā)展了多種用于神經(jīng)元及活體大腦中成像生物活性分子的熒光成像工具，但是若要利用熒光成像方法進(jìn)一步深入剖析生物活性分子調(diào)控大腦功能，揭示與疾病相關(guān)的分子機(jī)制，用于成像檢測大腦中生物活性分子的熒光探針還應(yīng)從以下幾個(gè)方面進(jìn)行發(fā)展：（1）更深組織成像?？山柚喙庾印⒐饴暤瘸上窦夹g(shù)，發(fā)展具有組織穿透深度更深的探針，實(shí)現(xiàn)在生理或病理過程中活體原位示蹤腦部的生物活性分子的變化。（2）精準(zhǔn)定位成像。由于腦部的生物活性分子在大腦的功能與分布具有區(qū)域性，所以要發(fā)展多種精準(zhǔn)定位不同腦區(qū)以及神經(jīng)元亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的熒光探針，借助超高分辨顯微成像技術(shù)，深入探究相關(guān)生物活性分子在不同區(qū)域的調(diào)控作用，從而揭示與腦部疾病相關(guān)的分子機(jī)制。（3）多組分同時(shí)成像。在大腦中一個(gè)信號變化可能是多個(gè)生物活性分子協(xié)同作用的結(jié)果，因此要發(fā)展可實(shí)現(xiàn)同一位置、同時(shí)成像多個(gè)組分成像材料，探究在同一生理病理過程中多個(gè)生物活性分子的協(xié)同調(diào)控作用，進(jìn)一步揭示與疾病相關(guān)的信號通路。（4）構(gòu)建融合多種探針技術(shù)的成像工具。根據(jù)需要解決的問題，將多種類型探針技術(shù)融合。如結(jié)合蛋白的探針精準(zhǔn)定位和小分子探針的高穩(wěn)定性的特點(diǎn)，利用納米探針易組裝的優(yōu)點(diǎn)，構(gòu)筑出在細(xì)胞內(nèi)集精準(zhǔn)定位、多組分實(shí)時(shí)成像與治療一體化的多功能成像工具。

總之，發(fā)展檢測腦部生物活性分子的新型熒光探針仍將是熒光成像領(lǐng)域發(fā)展前沿的重要研究內(nèi)容之一，這將為揭示腦部疾病發(fā)生與發(fā)展過程中活性分子的調(diào)控作用提供重要的新材料和新方法。

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Recent Advances in Fluorescence Imaging

of Bioactive Molecules in Neurons and in Vivo

WANG Xin， LI Ping*， ZHANG Wen， TANG Bo*

（Key Laboratory of Molecular and Nano Probes， Ministry of Education; College of Chemistry，

Chemical Engineering and Materials Science， Shandong Normal University， Jinan 250014， China）

Abstract?Brain possesses a unique chemical composition and reactivity. Bioactive molecules in brains including metal ions， reactive oxygen species， neurotransmitters and neurotransmitter hydrolases play multifarious and pivotal roles in the function of brain. These molecules keep steady?state concentrations for maintaining the structure and function of brain. However， the abnormal changes at bioactive molecular levels are associated with various brain diseases such as Parkinson's disease， Alzheimer's disease， depression， and so on. Therefore， to explore the concentration and regulation of those molecules in brains is particularly essential for revealing the mysteries of brains and understanding the occurrence and development of brain diseases. Fluorescence imaging is a powerful tool to track bioactive molecules in neurons and in brain because of its remarkable advantages， such as high temporal?spatial resolution， excellent biocompatibility and high sensitivity. In recent years， with the development of fluorescence imaging technology， a variety of fluorescent probes for brain and neurons imaging have been reported. In this review， we summarized the progress of molecular probes， nanoprobes and protein probes for detection of bioactive molecules in neurons and in brain. Furthermore， future research for fluorescence imaging was prospected.

Keywords?Fluorescent probe; Brain imaging; Bioactive molecule; Review