基于碘刻蝕金銀納米立方塊利用暗場(chǎng)顯微鏡高靈敏檢測(cè)腦透析液中碘

劉佳　李巧君　王超　李凱　林雨青

摘?要?采用局域表面等離子體共振（LSPR）技術(shù)研究了金銀納米立方塊（Au@Ag NCs）與I2的反應(yīng)過(guò)程，以Au@Ag NCs為探針，在暗場(chǎng)顯微鏡（DFM）下分析探針與不同濃度I/I2作用后的顏色比和散射光強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)探針顏色由藍(lán)色逐漸變?yōu)辄S綠色，同時(shí)其散射光強(qiáng)度不斷下降。此外，通過(guò)透射電鏡（TEM）和紫外?可見(jiàn)（UV?Vis）吸收光譜發(fā)現(xiàn)，Au@Ag NCs從邊緣不斷被氧化刻蝕，逐漸變成球形， 最終變成類(lèi)球形。以Au@Ag NCs作為探針檢測(cè)I2，利用DFM檢測(cè)I2的線性范圍為0.1～50 μmol/L，檢出限為17 nmol/L，并將本方法應(yīng)用于鼠腦透析液中I2的加標(biāo)檢測(cè)，探究了Au@Ag NCs與I/I2之間的氧化還原反應(yīng)過(guò)程。本研究為鼠腦透析液中I2的加標(biāo)回收提供了一種新的高靈敏方法。

關(guān)鍵詞?金銀納米立方塊; 暗場(chǎng)顯微鏡; 散射強(qiáng)度; 碘

1?引 言

碘（I）是人體必須的微量元素之一，70%～80%的碘存在于甲狀腺中，是甲狀腺激素的重要組成部分。碘對(duì)大腦和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育非常重要，在人體所需的營(yíng)養(yǎng)中，對(duì)智力影響最為顯著的是碘元素，缺碘可能會(huì)造成小兒大腦發(fā)育異常，甚至不可恢復(fù)的智力殘疾。近年，化學(xué)催化、分析測(cè)定等領(lǐng)域與碘相關(guān)的研究報(bào)道較多[1～3]。有研究者發(fā)現(xiàn)，碘對(duì)金屬納米顆粒的形貌和形態(tài)控制有重要影響[4]，碘會(huì)通過(guò)吸附在納米顆粒的表面，降低納米顆粒的表面電勢(shì)， 誘導(dǎo)納米顆粒聚集[5～8]; 碘對(duì)納米顆粒的合成也有很好的調(diào)控作用， 如可誘導(dǎo)合成金三角 [9，10]; 有研究者利用碘對(duì)金納米顆粒腐蝕后仍然具有很好的生物相容性的性質(zhì)，在金納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞之前先用碘腐蝕，可避免信號(hào)的干擾，并且還可達(dá)到對(duì)生物組織無(wú)傷害的效果[11]。盡管之前對(duì)碘的研究已經(jīng)有很多，但主要碘元素與金納米顆?；蜚y納米顆粒的相互作用[12～16]， 對(duì)于碘與金銀納米方塊的研究很少，對(duì)活體腦中碘的檢測(cè)研究尚少。

近年來(lái)，貴金屬納米顆粒由于其小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)及其所具有的高度活躍的外層電子，具備獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)， 局域表面等離子體共振（LSPR），受到廣泛關(guān)注。因?yàn)樗鼈冇泻軓?qiáng)的散射光，現(xiàn)已經(jīng)被廣泛用于生物傳感和生物成像[17，18]、催化[19]、癌癥治療[20，21]和表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）等領(lǐng)域。當(dāng)被特定頻率的入射輻射光激發(fā)時(shí)，金屬納米粒表面的自由電子發(fā)生集體振蕩，這導(dǎo)致其獨(dú)特的散射和吸收光學(xué)現(xiàn)象[22～25]。LSPR特征強(qiáng)烈依賴于納米粒子的材料、 形狀、 大小、 周?chē)慕殡姯h(huán)境及粒子間的耦合作用[26～29]。與單金屬納米顆粒相比，核殼結(jié)構(gòu)的雙金屬因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)的獨(dú)特性和尺寸易控性，近年備受關(guān)注。通過(guò)將不同貴金屬材料復(fù)合，可體現(xiàn)多種貴金屬材料的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)也可通過(guò)金屬納米粒子之間的電磁耦合，調(diào)節(jié)納米粒子的局域表面等離子體共振特性。

本研究采用兩步法獲得金種子，用種子生長(zhǎng)法合成金銀納米立方塊（Au@Ag NCs）。由于等離子體在Au和Ag表面的良好耦合，Au@Ag NCs具有更好的散射效率和吸收波長(zhǎng)范圍; 合成的Au@Ag NCs有利于改善Ag NCs較差的水溶性，同時(shí)還能保持Ag NCs的高靈敏度[30，31]。利用暗場(chǎng)顯微鏡（DFM）成像技術(shù)對(duì)Au@Ag NCs的LSPR信號(hào)變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)，觀測(cè)了I2腐蝕Au@Ag NCs的過(guò)程，如圖1所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著碘的加入，探針散射光的強(qiáng)度不斷下降，同時(shí)散射光的顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S綠色。 紫外?可見(jiàn)吸收技術(shù)以及TEM等表征結(jié)果證明， Au@Ag NCs與I/I2之間的反應(yīng)是從頂點(diǎn)被蝕刻并逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榍蛐危罱K變?yōu)轭?lèi)球形。由于Au@Ag NCs的形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，導(dǎo)致了其LSPR性質(zhì)的變化。最后以Au@Ag NCs為探針，利用DMF可在0.1～50 μmol/L線性檢測(cè)I2，并成功用于鼠腦透析液中加標(biāo)檢測(cè)I2。本研究為I2的檢測(cè)提供了一種新技術(shù)，有望在相關(guān)生物檢測(cè)研究中得到應(yīng)用。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

UV?2550紫外?可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）。 JEM?2100F透射電子顯微鏡（日本捷歐路公司）。 尼康 80i光學(xué)顯微鏡（日本尼康公司），油浸暗場(chǎng)聚光器（數(shù)值孔徑1.20～1.43），60× Plan Fluor物鏡，TGBS（每毫米70個(gè)槽，Edmund Optics）組成，一臺(tái)CoolSNAP HQ2 CCD相機(jī)（最佳光譜響應(yīng)窗口為470～630 nm，量子效率為460%，Roper Scientific）和一臺(tái)Olympus DP72彩色CCD相機(jī)。

十六烷基三甲基溴化銨（CTAB，>98.0%）、十六烷基三甲基氯化銨（CTAC，>98.0%）、氯金酸（HAuCl4·3H2O）、 L?抗壞血酸（BioUltra，≥99.5%）、AgNO3（>99%）和 NaBH4（99%）購(gòu)自Sigma?Aldrich公司。KI、 I2、NaOH、檸檬酸鈉和其它化學(xué)品購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。所有試劑均未經(jīng)過(guò)純化，直接使用。實(shí)驗(yàn)用水為Milli?Q系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）生產(chǎn)的超純水（18.2 MΩ·cm）。以王水清洗所有玻璃器皿，用水徹底沖洗，并在使用前干燥。

2.2?Au@Ag核殼納米立方塊制備

2.2.1?金種子溶液的制備?采用兩步法制備Au@Ag核殼納米立方體[32]。首先向含有HAuCl4（0.25 mmol/L）和CTAB（100 mmol/L）的10 mL溶液中加入0.6 mL冰冷的NaBH4溶液（10 mmol/L），溶液顏色變?yōu)楹稚苽渲睆綖? nm 的金納米種子溶液。將種子溶液在27°C孵育3 h，以確保NaBH4完全分解并留在溶液中。

2.2.2?CTAC封端的金種子的制備?將6 mL HAuCl4溶液（0.5 mmol/L）、6 mL CTAC溶液（200 mmol/L）和4.5 mL AA溶液（100 mmol/L）混合，然后加入0.3 mL 3 nm金種子溶液。最終混合物在1 min內(nèi)從無(wú)色變?yōu)榧t色，表明形成較大的金納米晶體。靜置1 h， 14500 r/min離心 30 min，收集產(chǎn)物，用水洗滌1次，記錄UV光譜。將納米晶體分散在4 mL去離子水中，使得種子溶液中金的濃度約為0.146 g/L。

2.2.3?Au@Ag納米立方塊的制備?將0.5 mL CTAC 封端的金種子溶液和4.5 mL CTAC （20 mmol/L）溶液混合在20 mL燒瓶中。將混合物在磁力攪拌下60℃加熱20 min，同時(shí)注入特定體積的AgNO3溶液（2 mmol/L）、 AA溶液（50 mmol/L）和CTAC（40 mmol/L）， 注射泵的速度為0.2 mL/min。加入反應(yīng)溶液中的AA（50 mmol/L）體積保持與AgNO3相同，均為0.5 mL。注射后，最終溶液中AgNO3的濃度為0.17 mmol/L。在注射期間，反應(yīng)混合物從紅色變?yōu)樽攸S色。繼續(xù)反應(yīng)4 h后，所得到的材料用冰浴淬滅， 14500 r/min離心15 min， 收集產(chǎn)物，然后用水洗滌1次。

3?結(jié)果討論

3.1?金銀納米顆粒合成過(guò)程的形貌和吸收光譜表征

采用種子生長(zhǎng)法獲得Au@Ag NCs。利用NaBH4還原HAuCl4合成金納米晶[32]，TEM圖像如圖2A所示。球形金納米晶約為3 nm; 在HAuCl4、AA和CTAC存在下，3 nm的金納米晶生長(zhǎng)成11 nm的金納米晶（圖2B）。圖2C為Au@Ag NCs的TEM圖像，顆粒大小約為（46.7±2.3） nm，其中粒徑在40.0～47.5 nm之間的Au@Ag NCs約占90%（圖2C插圖），這與～50 nm顆粒具有優(yōu)異的LSPR效應(yīng)是一致的[33]。圖2 D為3 nm金納米晶（曲線1）、11 nm金納米晶（曲線2）和Au@Ag NCs（曲線3）的紫外?可見(jiàn)吸收光譜，3 nm金納米晶體的吸收峰為293 nm，與文獻(xiàn)[32]結(jié)果相符。吸收峰相對(duì)較窄，說(shuō)明其粒徑相對(duì)均勻，TEM結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。此外，合成的11 nm金納米晶的吸收峰為512 nm。Au@Ag NCs的吸收峰值在451 nm處，這與Ag殼層的形成有關(guān)，Ag殼屏蔽效應(yīng)導(dǎo)致峰值位置發(fā)生藍(lán)移。以上結(jié)果初步證實(shí)本實(shí)驗(yàn)成功制備了Au@Ag NCs。

3.2?Au@Ag NCs的HRTEM形貌表征

對(duì)制備的材料進(jìn)行了高分辨透射電鏡表征。在Au@Ag NCs高分辨透射電鏡圖（圖3A）中可見(jiàn)到明顯的核殼結(jié)構(gòu)。用X射線能譜元素像分析技術(shù)（EDS?mapping）表征了Au@Ag NCs表面的元素組成，用藍(lán)色標(biāo)記Au存在的區(qū)域 （圖3B），用紅色標(biāo)記Ag存在的區(qū)域 （圖3C）。從圖3D可見(jiàn)，合成的Au@Ag NCs有明顯的核殼結(jié)構(gòu)， 并且表面存在的金元素和銀元素分布均勻。從圖3E可清楚地觀察到所合成納米顆粒表面銀的晶格，晶格對(duì)應(yīng)為面心立方Ag （200） 晶面，表示成功制備了金銀核殼納米立方結(jié)構(gòu)。同時(shí)，對(duì)Au@Ag NCs的X射線能譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析（圖3F）。 結(jié)合前面的分析可知，本研究成功制備了Au@Ag NCs。

3.3?Au@Ag NCs與不同濃度I/I2的相互作用的暗場(chǎng)光散射成像

Au@Ag NCs與I/I2反應(yīng)后，LSPR散射光發(fā)生變化，導(dǎo)致暗場(chǎng)顏色發(fā)生變化。Au@Ag NCs與不同濃度的I/I2反應(yīng)后， 暗場(chǎng)顏色的變化如圖4所示，有大面積暗場(chǎng)散射，合成的Au@Ag NCs為藍(lán)色，因?yàn)锳g殼層較厚，阻擋了Au的光散射信號(hào)。由于納米粒子散射光的顏色與納米粒子的大小有關(guān)，因此這進(jìn)一步表明合成的納米粒子大小均勻。圖4B～4F為添加不同濃度I/I2后Au@Ag NCs大面積暗場(chǎng)散射圖像（0、0.1、0.5、1、10和50 μmol/L）。 加入I/I2溶液后，Au@Ag NCs在暗場(chǎng)中的散射光先變?yōu)榱咙S色，然后逐漸變暗，說(shuō)明I2與Ag殼層發(fā)生反應(yīng)。AgI改變了探針表面的物理化學(xué)性質(zhì)，所以散射光的顏色發(fā)生了變化。但隨著I/I2濃度的進(jìn)一步增加，Au@Ag NCs進(jìn)一步被腐蝕，AgI不斷沉積在Au@Ag NCs表面，導(dǎo)致散射光強(qiáng)度減弱，散射光顏色也不斷發(fā)生變化。這為探索Au@Ag NCs與I/I2的反應(yīng)過(guò)程提供了一種更直觀、更快、更簡(jiǎn)單的新方法。

光學(xué)成像技術(shù)已被廣泛運(yùn)用于多個(gè)領(lǐng)域，如在細(xì)胞或組織水平上可視化和確定生物結(jié)構(gòu)[17]。目前，研究者已提出了幾種描述各向異性納米粒子的光學(xué)性質(zhì)的數(shù)值方法，包括離散偶極子近似法，時(shí)域有限差分法、有限元法和多重多極法[34～39]。使用這些數(shù)值方法模擬各向異性納米顆粒的光學(xué)響應(yīng)通常非常復(fù)雜和耗時(shí)。即使對(duì)于簡(jiǎn)單的各向異性納米結(jié)構(gòu)，如橢球狀納米棒，也不能直接揭示光學(xué)性質(zhì)對(duì)其形狀的依賴性。所以，本研究采用顏色比例法分析Au@Ag NCs納米顆粒的光學(xué)響應(yīng)信號(hào)，B表示藍(lán)色，G表示綠色， Y表示黃色。如圖4G所示，隨著I/I2濃度增加，藍(lán)色占比逐漸下降，黃色占比逐漸上升，綠色變化比較平緩。進(jìn)一步分析得到黃光顏色占比I/I2濃度之間的關(guān)系（圖4I），其線性關(guān)系如圖4J所示，得到檢測(cè)范圍為0.1～50.0 μmol/L，線性方程為y=4.47x+42.56 （R2=0.972）， 檢出限達(dá)到17 nmol/L。上述結(jié)果進(jìn)一步證明Au@Ag NCs被刻蝕的程度與I/I2濃度有關(guān)。

在對(duì)顏色進(jìn)行分析的同時(shí)，本研究還對(duì)光信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行了分析。 隨機(jī)選取3張I/I2濃度的暗場(chǎng)原圖片，在每張圖中隨機(jī)選取約100個(gè)粒子，利用Image J提取其散射光強(qiáng)度信息，再分別計(jì)算，統(tǒng)計(jì)出其散射光強(qiáng)度的變化值。如圖4H所示，隨著I/I2濃度增加，其散射光強(qiáng)度先增加后逐漸降低，原因可能是先加入少量的I/I2， Au@Ag NCs的大小未發(fā)生明顯變化，而表面被氧化形成AgI外殼，顆粒折射率發(fā)生變化，所以散射光強(qiáng)度先增加;然而，隨著I/I2的濃度逐漸增大，Au@Ag NCs逐漸被氧化刻蝕，粒徑減小，散射光強(qiáng)度逐漸降低。當(dāng)加入I/I2濃度超過(guò)10 μmol/L時(shí)，散射光強(qiáng)度幾乎不再發(fā)生變化。這可能是因?yàn)锳g殼表面的活性位點(diǎn)有限，導(dǎo)致反應(yīng)無(wú)法進(jìn)一步進(jìn)行。

3.4?Au@Ag NCs納米顆粒與I/I2的反應(yīng)前后TEM表征研究了Au@Ag NCs與I/I2相互作用的暗場(chǎng)成像特性。為進(jìn)一步探討Au@Ag NCs與I/I2之間的相互作用，采用TEM對(duì)合成的納米粒子進(jìn)行表征。如圖5所示，在添加I/I2前，Ag殼相對(duì)較厚，Au核相對(duì)較小，因此，在上述暗場(chǎng)成像中，Au@Ag NCs的散射光呈藍(lán)色。加入I/I2后，Au@Ag NCs的散射光由藍(lán)色逐漸變?yōu)辄S綠色，與納米粒子的形貌變化相對(duì)應(yīng)。Au@Ag NCs的形貌變化從立方體的各個(gè)角逐漸圓滑，最終變成球形，再進(jìn)一步與I/I2反應(yīng)，形貌最終變成類(lèi)球形。從圖5A～5C可見(jiàn)，隨著I/I2對(duì)銀殼層的不斷腐蝕，Au@Ag NCs的尺寸略有增加，這是因?yàn)镮2被還原成AgI沉淀，并沉積在納米顆粒上。此外，隨著I/I2濃度增加，在不斷被刻蝕的過(guò)程中，Au@Ag NCs形狀不斷變化，最終形成類(lèi)球形，這可能由于I2與Ag殼層過(guò)度反應(yīng)形成AgI，從而導(dǎo)致其與Au核分離[40]。

3.5?Au@Ag NCs納米顆粒與I/I2作用后TEM表征對(duì)刻蝕后的Au@Ag NCs進(jìn)行了高分辨透射元素表征和EDS?mapping表征（圖6）。本研究用綠色標(biāo)記Ag元素存在的區(qū)域 （圖6B），用黃色標(biāo)記Au元素存在的區(qū)域 （圖6C），用紅色標(biāo)記I元素存在的區(qū)域 （圖6D）。從圖6E可見(jiàn)，合成的納米顆粒保留有明顯的核殼結(jié)構(gòu)，并可很清楚地看到I元素覆蓋在Ag殼表面， 表明合成的Au@Ag NCs顆粒被I/I2氧化刻蝕。由圖6F可知反應(yīng)后Au、Ag的含量。結(jié)合前面的分析，可得出Au@Ag NCs顆粒逐漸被I/I2氧化刻蝕，從TEM圖可清楚地看出氧化刻蝕位置是從Au@Ag NCs顆粒的頂點(diǎn)開(kāi)始氧化，逐漸刻蝕為球形，對(duì)應(yīng)在暗場(chǎng)的表現(xiàn)為散射光強(qiáng)度逐漸降低，散射顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S綠色。

3.6?Au@Ag NCs與I/I2的相互作用紫外光譜分析

圖7是Au@Ag NCs與不同濃度的I/I2反應(yīng)的紫外可見(jiàn)光譜和照片。隨著I/I2濃度增加，顏色由亮黃色變?yōu)榛疑?，說(shuō)明I/I2與探針材料發(fā)生了反應(yīng)。此外，峰位由450 nm逐漸紅移至600 nm。眾所周知，藍(lán)光的吸收波長(zhǎng)約為450～435 nm，綠光的吸收波長(zhǎng)范圍約為577～ 492 nm，黃光的吸收波長(zhǎng)范圍約為597～577 nm。紫外?可見(jiàn)光譜顯示，Au@Ag NCs與I/I2反應(yīng)后，散射光由藍(lán)色逐漸變?yōu)辄S綠色，與上述暗場(chǎng)數(shù)據(jù)完全吻合。紅移的原因可能是Au@Ag NCs在加入I/I2后發(fā)生團(tuán)聚。

3.7?實(shí)際樣品中碘濃度的檢測(cè)

為了考察Au@Ag NCs檢測(cè)實(shí)際腦透析液中I2的可行性，在鼠腦透析液中添加I2進(jìn)行測(cè)試。在鼠腦透析液中加入Au@Ag NCs，其紫外?可見(jiàn)吸收光譜未發(fā)生紅移，說(shuō)明鼠腦透析液中未檢出I2。在鼠腦透析液中加入不同濃度的I/I2（0.5、1、2、5和10 μmol/L），結(jié)合UV?Vis確定I/I2在鼠腦透析液中的回收率（表1）。本研究設(shè)計(jì)的Au@Ag NCs探針靈敏度高，可用于鼠腦透析液中I2的加標(biāo)檢測(cè)。

4?結(jié) 論

采用局域表面等離子體共振（LSPR）技術(shù)研究了Au@Ag NCs與I/I2的反應(yīng)過(guò)程。探針與不同濃度I/I2作用后，顆粒散射光的顏色和強(qiáng)度發(fā)生了變化，可得到相應(yīng)的I2檢測(cè)定量信息，檢出限為17 nmol/L。DFM和TEM結(jié)果證實(shí)了散射光與Au@Ag NCs形貌之間的關(guān)系，證實(shí)了等離子體共振散射峰移動(dòng)與Au@Ag NCs形貌變化之間的關(guān)系。結(jié)合反應(yīng)前后Au@Ag NCs的形貌、紫外?可見(jiàn)光譜和表面元素分析，得到了Ag殼層與I/I2溶液反應(yīng)后形成了Ag@AgI納米粒子。本研究揭示了Au@Ag NCs與I/I2相互作用過(guò)程，有助于研究Au和Ag納米粒子的氧化腐蝕過(guò)程， 并將此氧化還原反應(yīng)成功應(yīng)用于鼠腦透析液中I2的加標(biāo)檢測(cè)。

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