聚酰胺純化紅樹莓籽黃酮及其結(jié)合膽酸鹽能力評(píng)價(jià)

蘆 宇 呂長鑫* 焦天慧 常 俏 紀(jì)秀鳳 孫 彤 王維民 王貴虹 勵(lì)建榮

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州 121013

2 大連中超食品有限公司 遼寧大連 116400

3 遼寧新大地實(shí)業(yè)發(fā)展集團(tuán)有限公司 遼寧沈陽 110168）

紅樹莓又稱覆盆子、托盤等，果實(shí)營養(yǎng)豐富，有“生命之果”的美譽(yù)[1-2]。隨著紅樹莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展，紅樹莓果汁、果酒、酸奶等系列產(chǎn)品相繼問世，然而，在加工過程中產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物--紅樹莓籽常被丟棄，未得到有效的開發(fā)利用。紅樹莓籽中含有大量的黃酮類化合物、鞣花酸、花色苷等[3]。其中黃酮類化合物具有降血壓，抗氧化，抗癌，抗腫瘤等功效[4-5]。采用聚酰胺樹脂純化黃酮類化合物，二者通過結(jié)合形成氫鍵，從而使黃酮與不能形成氫鍵的組分分離，達(dá)到提純的目的[6-7]。此方法不僅成本低，效率高，穩(wěn)定性好，而且樹脂可再生，適于工業(yè)化制備[8-10]。

隨著人們生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的變化，我國高血脂的發(fā)病率逐年升高。高血脂癥是引發(fā)心腦血管疾病的主要原因之一[11]。目前常見的降血脂藥物多為化學(xué)合成，不僅價(jià)格昂貴而且會(huì)引發(fā)一系列毒副作用，因此開發(fā)天然降血脂藥物將成為研究熱點(diǎn)。膽固醇降解會(huì)產(chǎn)生膽汁酸鹽，黃酮類化合物能夠與膽酸鹽結(jié)合，降低膽汁酸的重吸收率，促進(jìn)肝臟或血液中的膽固醇降解，生成更多膽酸鹽，從而降低血液中膽固醇含量[12-14]。本研究以紅樹莓籽為原料，采用大孔樹脂-聚酰胺聯(lián)用法純化紅樹莓籽黃酮，研究其純化工藝以及降血脂能力，以期得到高純度的紅樹莓籽黃酮，為開發(fā)天然降血脂藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

紅樹莓籽，紅樹莓果渣中分離。

AB-8大孔樹脂，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；聚酰胺（30～60 目），勤實(shí)科技；?；悄懰徕c、甘氨膽酸鈉、膽酸鈉，美國Sigma公司；亞硝酸鈉、檸檬酸、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇、硫酸均為分析純級(jí)，天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

1.2 設(shè)備與儀器

ALPHA1-2 LD plus冷凍干燥機(jī)，北京奧創(chuàng)興業(yè)有限公司；UV2700紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；PL303電子天平、FE20 pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；XZ-1水循環(huán)真空泵，上海西利嘉真空設(shè)備制造有限公司。

1.3 預(yù)處理

1.3.1 紅樹莓籽粉制備 將紅樹莓籽經(jīng)真空冷凍干燥24 h，在1 200 r/min條件下研磨 2 min，過60目篩制得紅樹莓籽粉，待用。

1.3.2 樹脂預(yù)處理與再生 參照馮愛娟等[15]的研究方法處理大孔樹脂，45℃烘干備用，樹脂再生方法同預(yù)處理。將聚酰胺置于95%乙醇中浸泡24 h，充分溶脹后用去離子水沖洗至流出液不再呈白色渾濁，再經(jīng)10%醋酸浸泡12 h，蒸餾水洗至中性，再經(jīng)5 mg/mL氫氧化鈉溶液浸泡12 h，蒸餾水洗至中性，45℃烘干，置于干燥器中備用[16]。

1.3.3 紅樹莓籽粗黃酮粉制備 稱取一定量1.3.1節(jié)中紅樹莓籽粉以料液比1∶10 g/mL加入石油醚，在40℃下浸泡4 h，抽濾后取粉，按1∶30 g/mL加入80%乙醇，在50℃下水浴提取2 h，所得提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至膏狀，并置于真空冷凍干燥機(jī)中干燥24 h，制得紅樹莓籽粗黃酮粉，備用。

1.3.4 紅樹莓籽黃酮濃度測定方法 以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用硝酸鋁法測定樣品黃酮濃度。配制0.1 mg/mL 標(biāo)液，分別吸取 0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL置于25 mL容量瓶中，分別加入0.75 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5 mg/mL的亞硝酸鈉溶液，混勻靜置6 min后，加入0.75 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10 mg/mL硝酸鋁溶液，混勻靜置6 min再向其中加入10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)4 mg/mL氫氧化鈉溶液，定容混勻后靜置15 min[17]。用紫外分光光度計(jì)在波長510 nm處測定吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。根據(jù)回歸方程計(jì)算黃酮濃度。

1.4 AB-8大孔樹脂初純化紅樹莓籽黃酮

取20 g的AB-8樹脂濕法上柱，將1.3.3節(jié)中粗黃酮粉溶解成12 mg/mL黃酮水溶液100 mL，調(diào)節(jié)pH值至4.5，以1.5 mL/min流速上樣，樹脂吸附飽和后用蒸餾水洗至流出液呈無色，用150 mL的60%乙醇以1.5 mL/min流速洗脫，將洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至膏狀，置于真空冷凍干燥機(jī)中干燥24 h，取粉備用。

1.5 聚酰胺樹脂二次純化紅樹莓籽黃酮

1.5.1 泄漏曲線繪制 取1.3.2節(jié)中10 g聚酰胺樹脂濕法上柱，稱取1.4節(jié)中黃酮干粉用水溶解制成5.5 mg/mL的樣液150 mL，調(diào)節(jié)pH值為4.5，上樣流速為1.5 mL/min，在此條件下上樣，流出液每10 mL收集1管，測定黃酮濃度，當(dāng)流出液濃度為初始的1/10時(shí)視作泄漏[18]，繪制泄漏曲線。

1.5.2 紅樹莓籽黃酮吸附條件確定 取100 mL黃酮質(zhì)量濃度為5.5 mg/mL樣液上樣，樣液pH值分別為3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，流速分別為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL/min上樣，收集流出液并棄去前10 mL液體，測定流出液中黃酮濃度，計(jì)算吸附率。按公式（1）計(jì)算吸附率[19]。

式中，C0——上樣液中黃酮質(zhì)量濃度（mg/mL）；V0——上樣液體積（mL）；C1——流出液中黃酮質(zhì)量濃度（mg/mL）；V1——流出液體積（mL）。

1.5.3 洗脫曲線繪制 以1.5.2節(jié)中最佳條件上樣，樹脂吸附飽和后，用蒸餾水洗至流出液呈無色，再取160 mL的60%乙醇，以1.5 mL/min的條件洗脫，流出液每10 mL收集1管，測定黃酮濃度，以收集液體積為橫坐標(biāo)，黃酮濃度為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線。

1.5.4 紅樹莓籽黃酮洗脫條件確定 以1.5.2節(jié)中最佳條件上樣，樹脂吸附完全后，用去離子水洗至流出液無色，用150 mL乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為50%，60%，70%，80%，90%，以 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL/min的流速洗脫，收集流出液，前10 mL棄去，測定黃酮濃度，計(jì)算解吸率。按公式（2）計(jì)算解吸率[19]。

式中，C0——提取液中黃酮質(zhì)量濃度（mg/mL）；C1——吸附后提取液中黃酮質(zhì)量濃度（mg/mL）；C2——解吸后提取液內(nèi)黃酮質(zhì)量濃度（mg/mL）；V1——上樣液體積（mL）；V2——洗脫液體積（mL）。

1.5.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 以上述試驗(yàn)中得到最佳條件純化紅樹莓籽黃酮，測定其吸附率和解吸率，并將純化的黃酮液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至膏狀，并置于真空冷凍干燥機(jī)中干燥24 h，取一定量純化干粉和1.3.3節(jié)中粗黃酮粉分別用無水乙醇溶解測定黃酮濃度，比較二者黃酮純度[20]。按公式（3）計(jì)算純度。

式中，C——測定液黃酮質(zhì)量濃度（mg/mL）；V——測定液體積（mL）；m——黃酮干粉質(zhì)量（mg）。

1.6 紅樹莓籽黃酮體外結(jié)合膽酸鹽效果評(píng)價(jià)

1.6.1 不同提取方式對(duì)紅樹莓籽黃酮體外結(jié)合膽酸鹽效果的影響 分別取一定量1.3.3節(jié)中醇提黃酮干粉，1.4節(jié)中AB-8純化黃酮干粉和1.5.5節(jié)中聚酰胺純化黃酮干粉溶于乙醇，配制成5 mg/mL樣液，取1 mL于具塞試管中，加入4 mL膽酸鹽溶液（0.3 mmol/L、pH 6.3的膽酸鈉、甘氨膽酸鈉和?；悄懰徕c溶液），在37℃恒溫振蕩1 h后6 000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL加入7.5 mL 60%硫酸溶液，置于70℃水浴20 min，取出冰浴5 min，在波長387 nm處測定吸光度，以無水乙醇替代樣液作為空白組，以磷酸鹽緩沖液替代膽酸鹽作為空白對(duì)照組，計(jì)算樣品對(duì)膽酸鹽的結(jié)合率[21]，按公式（4）計(jì)算。

式中，A0——空白組；A1——樣品組；A2——空白對(duì)照組。

1.6.2 不同紅樹莓籽黃酮質(zhì)量濃度對(duì)體外結(jié)合膽酸鹽效果影響 將1.5.5節(jié)中聚酰胺純化所得黃酮干粉溶于乙醇，分別配制成 1，3，5，7，9 mg/mL的樣液，分別取不同質(zhì)量濃度樣液各1 mL于具塞試管中，余下操作同1.6.1節(jié)的方法，計(jì)算膽酸鹽結(jié)合率，考察不同質(zhì)量濃度紅樹莓籽黃酮對(duì)膽酸鹽結(jié)合效果的影響程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

以蘆丁的質(zhì)量濃度為x軸，該質(zhì)量濃度下的吸光值為y軸，繪制的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品在0.004～0.020 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=7.75x+0.047，R2=0.9996，可用于紅樹莓籽黃酮質(zhì)量濃度測定。

2.2 聚酰胺純化紅樹莓籽黃酮最佳工藝條件

2.2.1 上樣量對(duì)紅樹莓籽黃酮吸附效果影響 上樣量對(duì)紅樹莓籽黃酮吸附效果影響如圖2所示，隨著收集流份的增加，紅樹莓籽黃酮質(zhì)量濃度逐漸增大，當(dāng)收集到第9管時(shí)黃酮質(zhì)量濃度達(dá)到初始的十分之一，樹脂達(dá)到了泄漏點(diǎn)，超過9管后黃酮質(zhì)量濃度繼續(xù)增大，可能是樹脂已吸附飽和，再繼續(xù)上樣吸附效果減弱，會(huì)發(fā)生泄漏，為避免黃酮樣液浪費(fèi)，上樣液體積確定為100 mL。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of rutin

圖2 泄漏曲線Fig.2 The curve of adsorption leakage

2.2.2 上樣pH值對(duì)紅樹莓籽黃酮吸附率影響 上樣pH值對(duì)紅樹莓籽黃酮吸附率如圖3所示。隨著pH值的升高紅樹莓籽黃酮的吸附率逐漸增加，當(dāng)pH值達(dá)到4.5時(shí)，吸附率達(dá)到最大67.26%，而后吸附率開始緩慢降低，這可能是因?yàn)辄S酮類化合物為多羥基酚類，呈弱酸性，酚羥基與聚酰胺以氫鍵的形式結(jié)合，在弱酸性或酸性條件下吸附效果較好，堿性增強(qiáng)，酚羥基上的氫解離形成酸根離子，與樹脂結(jié)合力減弱，吸附率降低[22]。因此選擇pH 4.5為最佳上樣pH值。

2.2.3 上樣流速對(duì)紅樹莓籽黃酮吸附率影響 上樣流速影響溶質(zhì)向樹脂內(nèi)表面擴(kuò)散，決定吸附效果。流速過大，黃酮樣液與樹脂接觸不充分，提早泄露，吸附率降低；流速過小，吸附時(shí)間延長，生產(chǎn)效率低[23]。由圖4可知，隨著上樣流速的增加吸附率逐漸降低，流速為1.5 mL/min與2.0 mL/min的吸附率無顯著差異，考慮提高試驗(yàn)效率，選擇2.0 mL/min為最佳上樣流速。

圖3 上樣pH值對(duì)紅樹莓籽黃酮吸附率影響Fig.3 Effect of sample pH on the adsorption of flavonoids

2.2.4 洗脫劑用量對(duì)紅樹莓籽黃酮洗脫效果影響 聚酰胺純化紅樹莓籽黃酮洗脫曲線如圖5，隨著洗脫劑用量的增加，黃酮質(zhì)量濃度顯著升高，當(dāng)洗脫體積為60 mL時(shí)，黃酮質(zhì)量濃度達(dá)到最大值，而后黃酮質(zhì)量濃度逐漸降低，當(dāng)洗脫劑用量為150 mL時(shí)，黃酮質(zhì)量濃度幾乎為0，因而選取150 mL為最佳洗脫劑用量。

圖5 洗脫曲線Fig.5 Desorption curve

圖6 洗脫流速對(duì)紅樹莓籽黃酮解吸率影響Fig.6 Effect of ethanol flow rate on the desorption rate

圖4 上樣流速對(duì)紅樹莓籽黃酮吸附率影響Fig.4 Effect of flow rate on the adsorption of flavonoids

2.2.5 洗脫流速對(duì)紅樹莓籽黃酮解吸率影響 由圖6可知，當(dāng)流速在0.5～1.0 mL/min范圍內(nèi)解吸率迅速降低，而后隨著洗脫流速的增加，解吸率緩慢降低。洗脫流速過快，洗脫不完全，流速過慢則洗脫過程耗時(shí)較長，效率降低，不適于工業(yè)化生產(chǎn)[24-25]，洗脫流速為1.5mL/min時(shí)解吸率為51.92%，綜合考慮試驗(yàn)效率和解吸率，選擇1.5 mL/min為最佳洗脫流速。

2.2.6 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紅樹莓籽黃酮解吸率影響 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)紅樹莓籽黃酮解吸率影響如圖7所示。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大解吸率顯著上升，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)解吸率達(dá)到最高而后解吸率迅速降低，乙醇是極性溶劑，體積分?jǐn)?shù)越大極性越小，極性小容易將雜質(zhì)洗脫下來與黃酮競爭同種溶劑，從而解吸率降低[26]。因此確定70%乙醇為最佳洗脫濃度。

圖7 乙醇濃度對(duì)紅樹莓籽黃酮解吸率影響Fig.7 Effect of ethanol concentration on the desorption rate

2.2.7 紅樹莓籽黃酮聚酰胺純化工藝驗(yàn)證 根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，采用最佳吸附條件和解吸條件重復(fù)3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到聚酰胺純化紅樹莓籽黃酮的吸附率為68.7%，解吸率為76.3%，將所得洗脫液濃縮、凍干后，得到純化的黃酮粉末，純度由醇提的25.07%提高至59.20%，產(chǎn)品純度提高了2.36倍，說明該試驗(yàn)條件穩(wěn)定可行，可有效純化紅樹莓籽黃酮。

2.3 紅樹莓籽黃酮體外結(jié)合膽酸鹽能力評(píng)價(jià)

2.3.1 不同提取方式對(duì)紅樹莓籽黃酮體外結(jié)合膽酸鹽能力影響 由圖8可知，不同提取方式對(duì)膽酸鹽結(jié)合能力差異顯著，聚酰胺純化黃酮對(duì)膽酸鈉結(jié)合能力最強(qiáng)達(dá)48.8%，大孔樹脂純化黃酮對(duì)甘氨膽酸鈉的結(jié)合能力最強(qiáng)達(dá)44.8%，3種黃酮對(duì)?；悄懰徕c的結(jié)合能力均較低，其中，聚酰胺純化黃酮對(duì)其結(jié)合能力最高達(dá)24.46%。聚酰胺純化黃酮對(duì)3種膽酸鹽結(jié)合能力均較高，其次是大孔純化黃酮，最后是醇提黃酮。

2.3.2 不同紅樹莓籽黃酮質(zhì)量濃度對(duì)體外降血脂影響分析 不同質(zhì)量濃度紅樹莓籽黃酮與膽酸鹽結(jié)合能力如圖9所示，隨著黃酮質(zhì)量濃度升高結(jié)合率也逐漸上升。紅樹莓籽黃酮對(duì)甘氨膽酸鈉的結(jié)合率始終高于牛磺膽酸鈉，當(dāng)黃酮質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，對(duì)膽酸鹽結(jié)合率由大到小依次為膽酸鈉、甘氨膽酸鈉、?；悄懰徕c。黃酮質(zhì)量濃度為9 mg/mL時(shí)，對(duì)甘氨膽酸鈉的結(jié)合率最高為86.27%，膽酸鈉與?；悄懰徕c結(jié)合率相近為75.37%和75.47%。從整體來看，紅樹莓籽黃酮對(duì)甘氨膽酸鈉結(jié)合效果最好，其次為膽酸鈉和?；悄懰徕c。紅樹莓籽黃酮質(zhì)量濃度在1～9 mg/mL范圍內(nèi)，對(duì)甘氨膽酸鈉、?；悄懰徕c和膽酸鈉的結(jié)合能力呈線性關(guān)系，R2分別為0.9721，0.8926和0.9852，線性關(guān)系較好，達(dá)到相應(yīng)膽酸鹽半數(shù)抑制率（Half maximal inhibitory concentration，IC50）的紅樹莓籽黃酮質(zhì)量濃度依次為2.911，3.779，3.257 mg/mL，說明紅樹莓籽黃酮對(duì)膽酸鹽結(jié)合能力較強(qiáng)，具有一定降血脂功效。

圖8 不同提取方式紅樹莓籽黃酮對(duì)膽酸鹽結(jié)合率影響Fig.8 Effects of red raspberry seed flavonoids extraction methods on ability of bile salt-binding

3 結(jié)論

聚酰胺純化紅樹莓籽黃酮最佳條件為：上樣質(zhì)量濃度5.5 mg/mL、上樣量100 mL、上樣pH 4.5、上樣流速2.0 mL/min、洗脫體積分?jǐn)?shù)70%乙醇、洗脫劑用量150 mL、洗脫流速1.5 mL/min，此條件下紅樹莓籽黃酮純度由醇提的25.07%提高到59.20%，提高了2.36倍。經(jīng)聚酰胺純化后紅樹莓籽黃酮對(duì)甘氨膽酸鈉、?；悄懰徕c和膽酸鈉的IC50依次為2.911，3.779，3.257 mg/mL，說明紅樹莓籽黃酮對(duì)膽酸鹽有較好結(jié)合能力，可為開發(fā)天然降血脂藥物提供理論依據(jù)。