血清糖蛋白2作為預測急性胰腺炎嚴重程度標識物的研究

馬柏強,王理富,吳文元,邢永俊

馬柏強,王理富,吳文元,邢永俊,麗水市人民醫(yī)院創(chuàng)傷/急腹癥、疝外科 浙江省麗水市 323000

核心提要： GP2在AP患者血清中明顯升高,且與AP的嚴重程度呈正相關.血清GP2的敏感性、特異性或預后準確性高于其他常用指標,包括C反應蛋白、全身炎癥綜合征評分、紅細胞壓積和急性胰腺炎嚴重程度床邊指數(shù)評分.

0 引言

急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是胰腺的突發(fā)炎癥導致胰腺自身消化的過程,通常涉及胰周組織及周圍器官,是胃腸道疾病導致入院的最常見原因之一[1,2].該疾病的嚴重程度變化很大,包括輕度胰腺炎、局限性胰腺炎到可能導致多器官衰竭和死亡的重癥胰腺炎[3,4].

AP的嚴重程度早期預測成為AP治療中的一個關鍵問題[5].當預測準確時,可以對患者進行適當?shù)幕颊叻旨?對患者預后具有重要理意義[6].當患有嚴重AP風險時,可通過血液動力學支持及密切監(jiān)測,對識別胰腺炎及可能需要的特定治療方法進行評估[7].但目前準確地識別疾病早期AP的方法仍在探究之中.目前,對于AP嚴重程度的預測主要是基于多因素的得分,包括Ranson、APACHE-Ⅱ、全身炎癥綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)評分急性胰腺炎床旁嚴重指數(shù)(bedside index of severity in acute pancreatits,BISAP)等[8-10].然而,其中的一些預測方式的計算復雜(APACHE-II,Ranson),更重要的是,這些評分系統(tǒng)對死亡率或持續(xù)器官衰竭(＞48 h)的敏感性有限[11].此外,一些報告表明,這些評分系統(tǒng)并不優(yōu)于易于確定的生物標志物,如血尿素氮,C反應蛋白(C-reactive protein,CRP),血細胞壓積(hematocrit,HCT)或肌酐(creatinine,Cr)[12-14].因此,需要一種新的血液生物標志物來對AP的嚴重程度作出較準確的預測,以對AP的早期管理提供指導.

有研究[15]表明,酶原顆粒的糖蛋白(glycoprotein 2,GP2)在AP動物模型的血清中有較明顯的差異性,可作為動物AP模型中的生物標識物.而在患者的血清中,AP患者的GP2水平較對照組有明顯的升高[16].在發(fā)病1 d以上的患者血清中,GP2的水平與AP的血清學檢測有一定的聯(lián)系[14].而GP2水平的上升也可以在慢性胰腺炎及胰腺癌患者血清中觀察到[17],因此,GP2作為AP嚴重程度的生物標志物尚待進一步研究.

本研究擬利用酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)對患者血清GP2進行檢測,且對AP患者的嚴重程度及預后進行分析,以此來確定GP2在預測AP嚴重程度中的意義.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病例納入： 納入發(fā)病24 h內(nèi)急性胰腺炎患者(＞18歲)進行前瞻性研究.根據(jù)亞特蘭大分型對急性胰腺炎患者進行嚴重程度分類.患者需符合以下三個條件中的任何兩種及以上： (1)持續(xù)性腹痛； (2)血清淀粉酶活性是正常值的3倍以上； (3)CT增強掃描、MRI掃描或超聲掃描明確AP.排除標準： 復發(fā)性胰腺炎； 慢性胰腺炎； 胰腺腫大性胰腺炎； 孕期患者； 從發(fā)病至入院超過24 h.研究已經(jīng)過倫理委員會批準,患者已簽署知情同意.

1.1.2 收集患者一般資料： 收集患者入院及住院期間血清學檢測資料.SIRS依據(jù)患者癥狀及血清學檢測明確.患者的結(jié)局變量依據(jù)亞特蘭大分型進行分類.

1.2 方法

1.2.1 血清GP2 ELISA檢測： 抽取患者5 mL肘靜脈血,常規(guī)分離血清,采用人酶原顆粒GP2 ELISA檢測試劑盒(LMAI Bio,中國)檢測血清GP2.抗GP2單抗包被于酶標板上,標準品與樣品中GP2單抗結(jié)合,加入生物素化GP2抗體,形成免疫復合物,辣根過氧化物酶與生物素結(jié)合,加入酶底物TMB,出現(xiàn)藍色,在450 nm處測OD值,制作標準曲線.待標準曲線作出后,將血清樣品100 μL加入孔中,37 ℃靜置120 min,洗板4-6次,每孔中加入第一抗體工作液50 μL,混勻后靜置60 min,洗板后每孔加酶標工作液100 μL,反37 ℃靜置60 min,洗板后加入底物反液壓液100 μL,暗處靜置5 min,最后加入50 μL終止液混勻,在450 nm處測吸光值,根據(jù)標準曲線計算血清GP2濃度.

統(tǒng)計學處理連續(xù)性變量采用中位數(shù)(M)及四分位間距(IQR)來表示,比較患者的基線水平特征.連續(xù)型變量采用方差分析,非參數(shù)變量Mann-WhitneyU檢驗和χ2檢測分類變量.二元多變量邏輯回歸評估GP2水平與急性胰腺炎嚴重程度關系.采用Cochran-Mantel-Haenszel檢驗來揭示GP2及其它指標水平與患者血清學結(jié)局指標的影響.所有數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS 17.0版統(tǒng)計軟件.P＜0.05被認為有統(tǒng)計學意義.

2 結(jié)果

2.1 患者的人口統(tǒng)計學、臨床和生化特征 根據(jù)修訂后的亞特蘭大分類,59名患者和9名健康受試者進入該研究,30例患者有輕度AP,16例患有中度AP,13例患有重度AP.患者的基礎臨床特征以及根據(jù)嚴重程度的分類結(jié)果(表1)表明,膽結(jié)石是主要的病因,其次是酒精濫用和內(nèi)鏡逆行胰膽管造影術(shù)(endoscopic retrograde cholangiopancreatography,ERCP).8例嚴重AP患者死亡(其中5例感染胰腺壞死).患者年齡,性別或身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)＞30 kg/m2均無顯著差異.

2.2 血清GP2水平 治療前所有AP患者血清GP2水平均高于健康受試者(均P＜0.05)； 且隨著AP嚴重程度的增加,血清GP2水平升高,且差異具有統(tǒng)計學意義(均P＜0.05)(表2).以AP患者治療后的臨床結(jié)局分為痊愈/好轉(zhuǎn)出院或死亡,根據(jù)臨床結(jié)局前最后一次血清GP2水平結(jié)果統(tǒng)計,治療后痊愈/好轉(zhuǎn)出院的AP患者血清GP2水平均顯著低于治療前(均P＜0.05)； 而治療后死亡的重度AP患者血清GP2水平顯著高于治療前重度AP患者血清GP2水平(P＜0.05)(表2).

2.3 GP2和其他預測因子的預后準確性 對于中度至重度AP的預測,GP2,BISAP評分和CRP的受試者工作曲線(receiver operating characteristic,ROC)如圖1.GP2水平的ROC、ROC曲線下面積(area under curve,AUC)高于BISAP評分和CRP(表3).以2.3 ng/mL為截止點,入院時血清GP2可輕易地預測為中度或重度AP,敏感性為96.6%,特異性為90.0%,陽性預測值(positive predictive value,PPV)為90.3%,陰性預測值(negative predictive value,NPV)為96.4%.GP2的敏感性和NPV高于其他常用預測因子(表4).

GP2是嚴重疾病的預測因子,與BISAP評分和CRP相比,AUC更高(表3,圖1).使用5.1 nmol/L作為臨界值,血清GP2的預測重度AP的敏感性,特異性,PPV值和NPV值均為100%.該準確度高于本研究中評估的任何其他預測因子(表5).

3 討論

準確地評估AP的嚴重程度,對患者的治療及預后均有重要意義[18].因此,目前,研究者們一直在尋找敏感性及特異性較高的AP的血清學標識物.AP主要是由于多種因素的共同作用導致的胰腺的壞死及及腫脹,導致炎癥因子及其它細胞因子釋放,這些因子為尋找AP的生物標識物提供了思路,但多數(shù)適用于動物模型的生物標識物在應用于患者時則無意義[19].因此急需尋找一種適用于人的特異性及敏感性較高的生物標識物.

GP2作為一種可自身聚集及非消化性自身抗原,可伴隨消化酶原一起分泌[20].GP2在分泌過程中不起主要作用,但是分泌后的抗菌及免疫調(diào)節(jié)方面起著重要作用,包括腺泡的內(nèi)吞及酶原顆粒功能的調(diào)節(jié)[21].AP的自身消化會致使腺泡的損害并導致消化酶及包括GP2和其它酶原顆粒的釋放[22].在本研究中,GP2在AP患者血清中明顯升高,且與不同嚴重程度AP呈正相關,表明GP2對診斷AP及預測AP有一定的臨床意義.

為了探究GP2的敏感性與其它常用的的AP預測因子的優(yōu)越性,本研究對GP2與AP進行了關聯(lián)性分析.結(jié)果表明,GP2對中度及重度胰腺炎的預測準確性較CRP及BISAP評分高.有研究[23]報道,GP2對AP預測的準確性較淀粉酶高.這一結(jié)果與本研究相同,表明GP2可作為AP的新型預測因子.

表1 患者的一般資料

表2 健康受試者和不同嚴重程度AP患者治療前后的血清GP2水平

圖1 GP2,CRP和BISAP預測中度及重度胰腺炎的ROC曲線.A: 各指標預測中度胰腺炎的ROC曲線； B: 各指標預測重度胰腺炎的ROC曲線.GP2: 糖蛋白2； CRP: C反應蛋白； BISAP: 急性胰腺炎床旁嚴重指數(shù)； Specificity: 特異性； Sensitivity: 敏感性.

表3 不同指標預測胰腺炎嚴重程度的AUC的比較

表4 GP2與其它指標對中度及重度胰腺炎的預測效果比較

表5 GP2及其它指標對重度胰腺炎及死亡的預測準確性的比較

本研究中,以2.3 ng/mL為截止點[24],GP2預測AP的敏感性為0.97,特異性為0.9,明顯高于包括持續(xù)性的炎癥反應綜合率發(fā)生率、CRP指標、BISAP評分等.以5.1 ng/mL為截止點[25],GP2對于重度AP的敏感性及特異性為100%.進一步證明了GP2對AP的嚴重程度的預測有重要的指導意義.

與其它的生物標識物的研究類似,本研究也有方法和技術(shù)的限制,首先,本研究,59例AP患者中只有13例重度AP,16例中度.雖然本研究的統(tǒng)計結(jié)果可以區(qū)分這三個亞組,但仍需更多的患者來支持這一結(jié)論.但無論如何,GP2的敏感性及特異性均高于其它因子,包括CRP及BISAP評分.其次,其他標識物有采用氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用的方法,其可能比ELISA方法有更高的準確性,但ELISA較色相色譜/質(zhì)譜法有其明顯的優(yōu)越性,包括應用快速簡潔等.為了能在臨床運用過程中能將較大量的樣本進行檢測,ELISA是較好的選擇.

本研究中雖然取得了較好的結(jié)果,但仍需多中心,多樣本的隊列研究支持GP2這一生物標識物在AP嚴重程度的預測中的準確性.

文章亮點

實驗背景

急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)發(fā)病機制復雜,并發(fā)癥較多,且AP的嚴重程度變化較大,其治療方案往往相差甚遠.而早期AP嚴重程度的準確預測對于治療方案的設定和預后均有重大意義,且在AP動物模型中血清酶原顆粒的糖蛋白(glycoprotein 2,GP2)水平特異性上調(diào).

實驗動機

本研究的主題為找到一種敏感性與特異性的血清學標識物用來預測AP的嚴重程度.并與其它經(jīng)典的血清學標志物及評分標準進行比較.

實驗目的

研究GP2是否能夠作AP嚴重程度的早期生物標識物.并且對其敏感性與特異性進行分析.

實驗方法

納入麗水市人民醫(yī)院普外科收入的AP患者,收集其血漿樣品,并納入一定數(shù)量的健康受試者.采用酶聯(lián)免疫吸附實驗方法檢測患者血清中GP2水平,并將GP2水平與AP患者嚴重程度進行關聯(lián)分析.

實驗結(jié)果

血清GP2水平在AP患者中明顯升高,且與AP嚴重程度呈現(xiàn)正相關.另外,GP2對于中度和重度AP的敏感性、特異性或預后的準確性較急性胰腺炎床旁嚴重指數(shù)評分、全身炎癥綜合征評分、C反應蛋白和紅細胞壓積T優(yōu)越.

實驗結(jié)論

血清GP2具有作為預測AP嚴重程度和預后的生物標識物的潛力.因此,在AP的臨床診斷與預測過程中,可對其血清GP2濃度進行檢測,以早期診斷其嚴重程度,利于合理化的治療.

展望前景

血清GP2有望作為預測AP嚴重程度和預后的生物標識物.但,本研究中納入患者和健康受試者的樣本量偏少,仍需大數(shù)據(jù)的結(jié)果來支持GP2這一生物標識物在AP嚴重程度的預測中的準確性.