大蒜素對胃癌細(xì)胞化療增敏機(jī)制研究

王浩冉,潘元明,張 玲

王浩冉,內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院中心臨床學(xué)院消化內(nèi)科 內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市 014040

潘元明,中國人民解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心消化內(nèi)科 北京市100700

張玲,內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市中心醫(yī)院消化內(nèi)科 內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市014040

核心提要： 目前大量研究發(fā)現(xiàn)大蒜素(diallyl trisulfide,DATS)對胃癌細(xì)胞(gastric cancer cells,GCC)的增殖、分化有一定的抑制作用,但具體作用機(jī)制尚不清楚.本研究使用胃癌BGC823細(xì)胞系,采用流式細(xì)胞術(shù)、Western blotting等方法發(fā)現(xiàn)DATS對GCC的多西紫杉醇化療有增敏作用且與細(xì)胞周期蛋白B1的表達(dá)有關(guān).

0 引言

胃癌(gastric cancer,GC)是最常見的惡性腫瘤之一,根據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),我國的GC發(fā)病和死亡例數(shù)均約占世界的50%[1,2],一般到典型臨床癥狀出現(xiàn)的時(shí)候,疾病已經(jīng)發(fā)展到進(jìn)展期[3],因此GC嚴(yán)重威脅著我國人民群眾的健康.對于進(jìn)展期GC的綜合治療中化療仍是重要的方式,其中多西紫杉醇(docetaxel,DOC)是應(yīng)用最廣泛的紫杉烷類化療藥物,主要作用在細(xì)胞微管系統(tǒng),與微管的β-tubinlin 結(jié)合,抑制微管解聚[4-6],并可特異性作用于細(xì)胞周期的M期,通過阻斷細(xì)胞周期中的M期,使細(xì)胞不能分化,從而發(fā)揮其抗腫瘤作用[7],但DOC的毒性比紫杉醇大,而且經(jīng)常與其他化療藥物一起使用,化療藥物的毒副作用和耐藥性一直是進(jìn)展期腫瘤治療領(lǐng)域中的熱點(diǎn)、難點(diǎn)問題[8],如何利用天然化合物來增加化療藥物的敏感性及降低毒性作用是一種潛在的治療策略.既往研究提示大蒜素(diallyl trisulfide,DATS)具有抗癌和抑癌作用[9,10],DATS是大蒜中主要的生物活性物質(zhì),1944年,曾有人首次在實(shí)驗(yàn)室中分離并研究了蒜氨酸[11],蒜氨酸是由蒜氨酸上的蒜氨酸酶(S-烯丙基-半胱氨酸亞砜)形成的,蒜氨酸具有手性,僅作為外消旋酶存在,當(dāng)大蒜粉碎時(shí),蒜素與蒜氨酸酶相互作用,形成大蒜素,它是大蒜中存在的一種含硫化合物的特有成分,是多種含硫化合物的復(fù)合體,有大量研究發(fā)現(xiàn)DATS能夠抑制包括乳腺癌、肺癌、前列腺癌、肝癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤細(xì)胞的增殖[12,13],近年來部分研究提示DATS可以抑制胃癌細(xì)胞(gastric cancer cells,GCC)的增殖,本課題組的前期試驗(yàn)證實(shí)DATS可以阻止細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂期,發(fā)生G2/M期阻滯,因此可以起到抑制細(xì)胞增殖的作用.

真核細(xì)胞的細(xì)胞周期分為G0/G1期、S期和G2/M期,質(zhì)量控制檢查點(diǎn)的失敗或調(diào)控分子的失衡,包括周期蛋白、周期蛋白依賴性激酶(cyclin dependent kinases,CDKs)和CDK抑制劑,在癌癥的發(fā)展中起著重要作用[14,15].細(xì)胞周期蛋白B1(cyclinB1,CCNB1)是一種重要的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白,特別是CCNB1和CDK2是有絲分裂促進(jìn)因子的組成部分,是G2-M轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵角色[16-19].CDK2的表達(dá)水平在整個(gè)細(xì)胞周期中通常是恒定的,而CCNB1的表達(dá)是循環(huán)的,并在G2-M轉(zhuǎn)變時(shí)達(dá)到峰值[16,20].另外有研究發(fā)現(xiàn)半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(cysteine aspartic acid specific protease,Caspase-3)在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用,與真核細(xì)胞的凋亡密切相關(guān),在細(xì)胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)過程中,Caspase-3是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行蛋白,參與多種因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,是級聯(lián)反應(yīng)中最關(guān)鍵的效應(yīng)蛋白酶,在凋亡的病理過程中發(fā)揮重要作用[21].因此本研究通過體外培養(yǎng)人BGC823細(xì)胞并給予DATS+DOC聯(lián)合作用,觀察DATS對BGC823細(xì)胞對DOC化療敏感性的作用,并初步探討了CCNB1是否參與了DATS對GCC的化療敏感性的作用,為臨床上進(jìn)展期GC的化療提供理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料 細(xì)胞株人胃腺癌細(xì)胞株BGC-823細(xì)胞(購自上海圖赫實(shí)業(yè)公司),BGC823細(xì)胞培養(yǎng)于1640細(xì)胞培養(yǎng)基(美國Gibco公司)； 多西紫杉醇(杭州賽諾菲制藥公司,批號： J20150083)； 大蒜素注射液(購自上海禾豐制藥公司,批號： H31022371),兔抗人FHIT單克隆抗體(Abcam公司),辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG抗體(北京中杉金橋公司)； 兔抗caspase-3單克隆抗體(北京百奧萊博科技公司)； 4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI溶液)(DAKE公司),PBS緩沖液(美國Gibco公司)； 碘化丙啶(propidium iodide,PI)(北京百奧萊博科技公司)； 諾考達(dá)唑(武漢欣欣佳麗生物科技公司)； β-actin單克隆抗體(Cell Signaling Technology公司)； SDS-PAGE試劑(Sigma公司)； RIPA蛋白裂解液(Beyo time公司)； Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染試劑盒(碧波公司)； 蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物公司)； ECL超敏發(fā)光液(北京普利萊公司)； Cell Analyzer CA-Ⅱ型流式細(xì)胞儀(德國Partec公司)； Multicycle 流式細(xì)胞儀細(xì)胞(美國Phoenix Flow Systems公司)； BX43型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)； ChemDoc XRS型化學(xué)發(fā)光成像儀(美國Bio-red公司)； 5804R型高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)； Odyssey凝膠成像系統(tǒng)(美國Li-COR公司).

1.2 方法

1.2.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測BGC823細(xì)胞周期分析： 取對數(shù)生長期的BGC823細(xì)胞,按1×106cells/mL以1 mL加至24孔板,再加入1 mL/孔的0 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L濃度的DATS,每組分別作用0 h、12 h、24 h、48 h、72 h,37 ℃培養(yǎng)后收獲,用PBS緩沖液(0.01 mol/L,pH7.4)洗滌,離心棄上清,沉淀的細(xì)胞在不斷振蕩下逐滴加入1 mL無水乙醇進(jìn)行固定,置4 ℃保存待測.然后用將固定的細(xì)胞離心,棄乙醇,用PBS洗滌,將細(xì)胞懸浮于1 mL預(yù)處理液(2.1%檸檬酸,0.5% Tween 20)中,37 ℃水浴輕搖10 min,然后加入DAPI染液,4 ℃避光孵育30 min以上,并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測.檢測結(jié)果用專用分析軟件進(jìn)行細(xì)胞周期分析.

1.2.2 DATS與DOC單獨(dú)及聯(lián)合作用對BGC823細(xì)胞凋亡的影響： 各組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化,4 ℃離心5 min收集細(xì)胞,用預(yù)冷的PBS洗滌溶液洗滌2次后,制備濃度約1×105的單細(xì)胞混懸液,加入100 μL緩沖液,再加入5 μL A nnexin V-FITC和5 μL PI混勻,避光室溫孵育10 min后,分別加入400 μL緩沖液并混勻后1 h內(nèi)通過流式細(xì)胞儀檢測并分析細(xì)胞凋亡情況.

1.2.3 Western blotting法檢測CCNB1蛋白的表達(dá)水平： 收集各組細(xì)胞,加入RIPA蛋白裂解液,4 ℃ 12000 g離心20 min,取上清,BCA蛋白定量試劑盒檢測各組細(xì)胞總蛋白濃度,蛋白樣品與5×上樣緩沖液按4：1比例渦旋均勻,煮沸10 min,冷卻至室溫后,-20 ℃保存?zhèn)溆?等量蛋白SDS-PAGE電泳分離蛋白,80 V恒壓電泳30 min,換電壓為120 V,繼續(xù)電泳150 min左右,依據(jù)蛋白分子大小而定.將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,5%脫脂奶粉的TBST液(Tris-緩沖鹽溶液)封閉1 h,洗膜后加入按照1：1000稀釋的兔抗人FHIT多克隆抗體,4 ℃孵育搖床過夜.TBST充分洗膜,10 min/次,洗3次.洗膜后,用1：3000的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體、caspase-3(1：1000)一抗溶液,室溫條件下孵育1 h,TBST充分洗膜,10 min/次,洗3次,使用ECL顯色,按照說明書進(jìn)行顯色、曝光、顯影、定影,同樣方法,以β-actn(1：56000稀釋)作為內(nèi)參照.通過Odyssey凝膠成像系統(tǒng)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行拍照記錄,并進(jìn)行蛋白條帶灰度分析.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理均運(yùn)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料以mean±SD表示,組間均數(shù)兩兩比較采用t檢驗(yàn),統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析或雙因素方差分析及重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 DATS對BGC823細(xì)胞的細(xì)胞周期各時(shí)相的影響B(tài)GC823細(xì)胞的細(xì)胞周期經(jīng)DATS處理后均發(fā)生了明顯的變化,與空白對照組相比主要表現(xiàn)為G1期細(xì)胞減少,G2/M期細(xì)胞增多,表明BGC823細(xì)胞經(jīng)DATS處理后細(xì)胞周期阻滯于G2/M期,且大蒜素濃度為25 μmol/L、作用時(shí)間為12 h時(shí)對BGC823細(xì)胞的抑制作用最明顯(圖1).在實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步運(yùn)用免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)對DATS作用后的BGC823細(xì)胞進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)DATS作用于BGC823細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)CCNB1的累積現(xiàn)象,對BGC823細(xì)胞進(jìn)行同步化處理后再次使用25 μmol/L DATS作用于BGC823細(xì)胞結(jié)果DATS組的CCNB1的蛋白表達(dá)水平升高(圖2,3).同時(shí)也證實(shí)DATS處理后引起了細(xì)胞中期阻滯和凋亡的增加.

2.2 DATS與DOC單獨(dú)及聯(lián)合作用對BGC823細(xì)胞凋亡的影響 DATS組、DOC組和聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率均顯著高于空白對照組(P＜0.05),且DATS+DOC聯(lián)合組顯著高于DOC組(P＜0.05)(圖4).

2.3 DATS與DOC單獨(dú)及聯(lián)合作用對BGC823細(xì)胞周期的影響 DATS組、DOC組和聯(lián)合組BGC823細(xì)胞周期G2/M期比例顯著高于空白對照組(P＜0.05)； DOC組和聯(lián)合組BGC823細(xì)胞周期G1期比例顯著低于空白對照組(P＜0.05)； 聯(lián)合組胃癌BGC823細(xì)胞周期G1期比例顯著低于DATS組和DOC組(P＜0.05)； G2/M期比例顯著高于DATS組和DOC組(P＜0.05)(圖5).

2.4 DATS與DOC單獨(dú)及聯(lián)合作用CCNB1表達(dá)情況Western blotting結(jié)果顯示各組分別給藥后胃癌BGC823細(xì)胞中CCNB1表達(dá)在聯(lián)合給藥后表達(dá)顯著增加,活化型caspase-3表達(dá)增加(圖6).

3 討論

GC是消化道惡性腫瘤中最常見的腫瘤之一,可在任何年齡段發(fā)病,40-60歲之間居多,GC的病因不明,可能與飲食、生活方式、環(huán)境因素、遺傳、心理因素和幽門螺桿菌感染等許多因素有關(guān)[22,23].目前早期GC的治療多通過手術(shù)方式進(jìn)行治療,而進(jìn)展期GC,除手術(shù)治療外還需要更多的綜合治療,目前進(jìn)展期GC的一線化療大多是多種細(xì)胞毒性藥物[24],且單一化療的效果有限,需要研究新的更為有效的化療藥物或化療方案.本課題研究了DATS對BGC823細(xì)胞的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用效果,并探討了DATS對GCC化療藥物DOC的增敏作用及其作用機(jī)制.

DATS是大蒜粉碎后加水蒸餾而得到的大蒜揮發(fā)油,其主要成分為二烯丙三硫[25,26],具有天然性和低毒性的特點(diǎn),已有研究發(fā)現(xiàn),較低濃度的DATS即可抑制腫瘤細(xì)胞遷移,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[27,28].目前有大量研究表明DATS對多種腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、分化有一定的抑制作用[13,29-31],本實(shí)驗(yàn)已證實(shí)不同濃度的DATS作用于BGC823細(xì)胞后,細(xì)胞凋亡率測定結(jié)果顯示,DATS濃度為25 μmol/L、作用時(shí)間為12 h時(shí)腫瘤細(xì)胞中期阻滯和凋亡增加,DATS作用于培養(yǎng)細(xì)胞后,流式細(xì)胞儀檢測及光鏡下的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示,細(xì)胞周期大多被阻滯于M期,同時(shí)可以促進(jìn)CCNB1的累積.

在臨床上DATS作為治療惡性腫瘤的輔助用藥已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用,Gao等[32]研究證明聯(lián)合應(yīng)用DATS后可以增強(qiáng)化療藥物環(huán)磷酰胺的藥物作用,明顯降低腫瘤的生長.謝軍等[33]研究也發(fā)現(xiàn),DATS聯(lián)合環(huán)磷酰胺對腫瘤細(xì)胞增值抑制作用明顯高于單一環(huán)磷酰胺用藥組.另外,有研究發(fā)現(xiàn)DATS具有增強(qiáng)化療藥物5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性[10].因此,聯(lián)合應(yīng)用DATS對化療藥物的增敏作用在少許實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí),本實(shí)驗(yàn)通過DATS與DOC單獨(dú)或聯(lián)合作用檢測對BGC823細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的結(jié)果顯示： 與單用DOC組比較,聯(lián)合組能夠更加顯著的將胃癌BGC823細(xì)胞周期阻滯于G2/M期,抑制細(xì)胞有絲分裂,顯著提高BGC823細(xì)胞凋亡率,提示DATS能夠增強(qiáng)胃癌BGC823細(xì)胞對DOC化療敏感性,即DATS對BGC823有化療增敏作用.進(jìn)一步我們應(yīng)用Western blotting檢測DATS作用前后CCNB1表達(dá)的變化,結(jié)果顯示,空白對照組、DATS組、DOC組中CCNB1表達(dá)量少,DATS+DOC組的CCNB1表達(dá)較前3組明顯表達(dá)增多,表明DATS都能夠促進(jìn)GCC的調(diào)亡,且兩者具有協(xié)同作用,這種促凋亡作用可能與CCNB1過表達(dá)相關(guān),其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步闡明.

綜上所述,DATS可增強(qiáng)BGC823細(xì)胞對DOC化療敏感性,可能與誘導(dǎo)CCNB1的蛋白的表達(dá)增加有關(guān),具體機(jī)制需進(jìn)一步研究.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

胃癌(gastric cancer,GC)是全球常見的惡性腫瘤,晚期患者預(yù)后相對較差,而進(jìn)展期GC的治療多通過手術(shù)或聯(lián)合輔助化療進(jìn)行治療,目前臨床中GC的化療藥物多種多樣,其中多西紫杉醇(docetaxel,DOC)是最常見的化療藥物之一.DOC為新一代紫杉醇類衍生物,可特異性作用于細(xì)胞周期的M期,通過阻斷細(xì)胞周期中的M期,使細(xì)胞不能分化,從而發(fā)揮其抗腫瘤作用,近年來部分研究提示大蒜素(diallyl trisulfide,DATS)可以抑制胃癌細(xì)胞(gastric cancer cells,GCC)的增殖,發(fā)生G2/M期阻滯,因此可以起到抑制細(xì)胞增殖的作用.目前DOC的臨床應(yīng)用受耐藥性的限制,尋找耐藥輔助增敏的研究倍受關(guān)注,因此擬通過本課題研究探討DATS對GCC化療增敏的分子生物學(xué)機(jī)制.

圖1 DATS促進(jìn)胃癌細(xì)胞BGC823發(fā)生中期阻滯.A: 25 μmol/L DATS處理BGC823胃癌細(xì)胞不同時(shí)間段,觀察細(xì)胞周期的變化； B: 以不同DATS濃度分別處理BGC823 12 h.DATS: 大蒜素.

圖2 DATS誘導(dǎo)cyclinB1表達(dá)增加.A: 用DATS、陽性對照諾考達(dá)唑中期阻滯藥及生理鹽水分別處理BGC823細(xì)胞,CCNB1免疫熒光染色情況,DAPI染色顯示細(xì)胞核(藍(lán)色)； B: 用DATS、陽性對照諾考達(dá)唑中期阻滯藥及生理鹽水分別處理BGC823細(xì)胞后,流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期結(jié)果表示細(xì)胞在G2/M期階段的百分比.cyclinB1: 細(xì)胞周期蛋白B1； DATS: 大蒜素.

圖3 DATS對中期同步化與非同步化的胃癌細(xì)胞凋亡比例的影響.A: 對照組細(xì)胞的凋亡比例僅為4.8%(平均)； B: 加入DATS 12 h后,凋亡比例為17.2%(平均)； C: 當(dāng)通過中期同步化技術(shù),細(xì)胞的凋亡比例為7%(平均)； D: 通過在同步化的基礎(chǔ)上,加入DATS處理12 h,凋亡細(xì)胞的比例為24.5%(平均),提示DATS處理后引起細(xì)胞中期阻滯和凋亡增加.DATS: 大蒜素.

圖4 各組胃癌BGC823細(xì)胞凋亡情況.A: 用DATS和/或DOC處理BGC823細(xì)胞后,細(xì)胞凋亡的代表性分析； B: 定量,數(shù)據(jù)以mean±SD表示,aP＜0.05,bP＜0.01,與對照組比較有顯著性差異.DATS: 大蒜素； DOC: 多西紫杉醇.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

本研究擬通過實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證DATS是否可以增加GCC對于化療藥物DOC的敏感性,明確細(xì)胞周期蛋白B1(cyclinB1,CCNB1)是否參與DATS抑制GCC增殖的作用,為臨床腫瘤化療提供新的思路.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

明確DATS抑制GCC增殖的作用機(jī)制.明確DATS是否對DOC對GCC的化療作用有增敏作用.明確CCNB1是否參與了DATS 對GCC的化療敏感作用.

實(shí)驗(yàn)方法

從胃癌系中篩選出CCNB1表達(dá)陽性的BGC823 GCC,然后細(xì)胞培養(yǎng),選擇對數(shù)生長的細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶隨機(jī)分成對照組和實(shí)驗(yàn)組,利用流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期分析等,檢測細(xì)胞周期分布比例變化.設(shè)立空白對照組、加入DATS組、加入DOC組及加入DATS+DOC組,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法檢測DATS單獨(dú)或聯(lián)合DOC后BGC-823的增殖及細(xì)胞凋亡情況.應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法檢測上述各實(shí)驗(yàn)組分別給藥后CCNB1的表達(dá)情況,并應(yīng)用免疫熒光與流式細(xì)胞術(shù)對比中期阻滯藥諾考達(dá)唑處理后的BGC823細(xì)胞與富集大蒜素(DATS)誘導(dǎo)后的中期BGC823細(xì)胞中CCNB1的表達(dá).

圖5 各組胃癌BGC823細(xì)胞周期的比例分布情況.A: 用DATS和/或DOC處理BGC823細(xì)胞后,細(xì)胞周期分布的代表性分析； B: 定量,數(shù)據(jù)以mean±SD表示,aP＜0.05,bP＜0.01,與對照組比較有顯著性差異.DATS: 大蒜素； DOC: 多西紫杉醇.

圖6 各組胃癌BGC823細(xì)胞中CCNB1表達(dá)情況.Western blotting結(jié)果提示大蒜素和多西紫杉醇單一或者聯(lián)合給藥后CCNB1和a-caspase-3表達(dá)水平.DATS: 大蒜素； DOC: 多西紫杉醇； CCNB1: 細(xì)胞周期蛋白B1； a-caspase-3: 活化型半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

DATS可增強(qiáng)DOC對BGC823細(xì)胞的化療敏感性,且與誘導(dǎo)CCNB1的蛋白的表達(dá)增加有關(guān),為DATS在抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用及抗癌機(jī)制提供理論依據(jù),且初步驗(yàn)證CCNB1參與DATS抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

我們研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),DATS可以明顯抑制GCC增殖,增加DOC的化療敏感性,其機(jī)制與誘導(dǎo)CCNB1的蛋白表達(dá)增加有關(guān).

展望前景

本研究首次通過實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證DATS可以增加GCC療藥物DOC的敏感性,初步證實(shí)DATS對化療藥物DOC的增敏作用與CCNB1的過表達(dá)有關(guān),后期將繼續(xù)進(jìn)一步探討CCNB1表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制,為臨床表觀遺傳學(xué)干預(yù)治療提供新的理論基礎(chǔ).