茵芪肝復(fù)顆粒對(duì)膽汁淤積性肝炎大鼠的改善作用及對(duì)相關(guān)細(xì)胞和炎癥因子的影響

王艷嬌,趙云青

王艷嬌,麗水市人民醫(yī)院 浙江省麗水市 323000

趙云青,浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院下沙院區(qū)消化科 浙江省杭州市 310000

核心提要： 茵芪肝復(fù)顆粒可提升膽汁淤積性肝炎大鼠機(jī)體抗氧化能力,降低炎癥反應(yīng)程度,改善大鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)和肝功能.

0 引言

膽汁淤積性肝炎(cholestasis hepatitis,CP)是由肝膽管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能受損造成膽汁形成、分泌、排泄異常引起的肝臟疾病[1].國(guó)外相關(guān)調(diào)查指出,住院慢性肝病患者中約11%伴有膽汁淤積,可導(dǎo)致肝硬化及終末期肝病,危害患者生命安全[2,3].目前西醫(yī)治療CP多采用糖皮質(zhì)激素、S-腺苷-L-蛋氨酸等,但療效欠佳[4].中醫(yī)學(xué)治療慢性疾病具有安全性高與整體調(diào)理優(yōu)勢(shì),近年來(lái)受到臨床重視.茵芪肝復(fù)顆粒是采用黃芪、茵陳、黨參、大黃、焦梔子等制成,具有疏肝補(bǔ)脾、清熱解毒利濕功效,但其對(duì)肝功能影響及作用機(jī)制尚不明確.本研究以α-異硫氰酸萘酯(α-naphthyl isothiocyanate,ANIT)灌胃法復(fù)制CP大鼠模型,探討茵芪肝復(fù)顆粒對(duì)CP大鼠的改善作用及對(duì)白介素(interleukin,IL)-17、相關(guān)細(xì)胞因子的影響,為疾病良好治療提供理論支持,報(bào)道如下.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物： 27只雄性Wistar大鼠均為無(wú)特定病原體(specific pathogen free,SPF)級(jí),體質(zhì)量180-210 kg,平均198.14 kg±5.90 kg,購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物合格證號(hào)4400580000540,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(粵)2013-0034,適應(yīng)性飼養(yǎng)1 wk,自由飲用純凈水,相對(duì)濕度為60%,環(huán)境溫度22-25 ℃,進(jìn)食高壓消毒滅菌不含致敏原飼料,每周更換墊料2-3次,每12 h交替光照.實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合《中華人民共和國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》.

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器、試劑、藥物： 低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司3k30)； 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)賽默飛公司Applied Biosystems)； 蛋白質(zhì)核酸電泳分析儀(美國(guó)Bio-Rad)； ANIT(美國(guó)Sigma公司,貨號(hào)Sigma-N4525)； 酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)； 顯微鏡、顯微攝像及圖像分析系統(tǒng)(日本Olympus公司)； 兔抗鼠IL-17、IL-4、干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)抗體； IL-17、IL-4、IFN-γ、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒； RNA提取試劑盒； 免疫組織化學(xué)二抗試劑盒； 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)試劑盒； cDNA第一鏈合成試劑盒；引物； 茵芪肝復(fù)顆粒(太極集團(tuán)四川南充制藥有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字Z19980017).試劑均購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司.

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物造模： 27只雄性Wistar大鼠以記號(hào)筆分別標(biāo)記為1-9.對(duì)照組為健康大鼠,不予任何處理； 模型組以100 mg/kg ANIT經(jīng)口灌胃復(fù)制CP大鼠模型,灌胃前后12 h自由飲水,禁食,12 h后恢復(fù)正常飲食,每周灌胃1次,共灌胃3次,第3次灌胃后48 h,予以0.5 mL/100 g 20%烏拉坦腹腔注射麻醉,無(wú)菌條件下留取腹主動(dòng)脈血與肝組織標(biāo)本；茵芪肝復(fù)顆粒組以模型組相同方法復(fù)制CP大鼠模型,并于造模結(jié)束后給予3.18 g/kg、3次/d,共持續(xù)3 wk茵芪肝復(fù)顆粒,溶解于飲用水后經(jīng)口灌胃,總給藥體積為10 mL,標(biāo)本留取方法同模型組.

1.2.2 標(biāo)本檢測(cè)： (1)腹主動(dòng)脈血標(biāo)本： 腹主動(dòng)脈血6 mL置于真空干燥采血管中,室溫靜置0.5 h,離心處理(3000 r/min,10 min),上清液分裝后保存于-20 ℃待測(cè).以全自動(dòng)生化儀檢測(cè)大鼠血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、總膽紅素(total bilirubin,TB)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(glutamyltranspeptidase,GGT)水平,以酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清IL-17、IL-4、IFN-γ水平,以比色法檢測(cè)血清SOD、MDA水平； (2)肝組織標(biāo)本： 一份采用10%中性福爾馬林溶液固定,脫水、石蠟包埋,以免疫組化技術(shù)、蘇木素-伊紅(hematoxylineosin,HE)染色,觀察肝組織病理變化； 一份置于液氮中迅速冷凍,保存于-80 ℃下,應(yīng)用試劑盒提取標(biāo)本總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,設(shè)計(jì)合成引物,IL-17上下游引物分別為5′-GGGAAGTTGGACCACCACA-3′、5′-CCCACCAGCATCTTCTCCA-3′； IL-4上下游引物分別為5′-TGCACCGAGATGTTTGTACCA GA-3′、5′-TTGCGAAGCACCCTGGAAG-3′； IFN-γ上下游引物分別為5′-CATCAGCAACAACATAAGTGTCATC-3′、5′-CATTGACAGCTTTGTGCTGGA-3′； SOD上下游引物分別為5-′GGTACCTTATGGCGACGAGCG′-3、5-′GCTCTAGAGCGATCCCAATTA′-3； FXR上下游引物分別為5′-GCAACTGCGTGA TGGATATG-3′、5′-TTCTCCCTCGCATAGCTTGGT-3′,內(nèi)參β-actin上游引物5′-GTACTAGTCGTAGCAGTAGT-3′,下游引物5′-GCTAGTCAGTCAGCTAGCTAT-3′,建立PCR反應(yīng)體系,實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)IL-17、IL-4、IFN-γ、SOD、法尼酯X受體(farnesyl X receptor,FXR)mRNA水平.

1.2.3 觀察指標(biāo)： (1)比較3組肝組織病理變化； (2)比較3組肝功能指標(biāo)水平： AST、ALT、ALP、TB、GGT； (3)比較3組血清相關(guān)指標(biāo)： IL-17、IL-4、IFN-γ、SOD、MDA； (4)比較3組肝組織IL-17、IL-4、IFN-γ、SOD、MDA、FXR mRNA水平； (5)采用LOGISTIC多元回歸方程分析影響肝功能因素.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù),計(jì)量資料以mean±SD表示,多組間比較以單因素方差進(jìn)行分析,兩兩比較以LSD-t檢驗(yàn),采用LOGISTIC多元回歸方程行多因素分析.P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 肝組織病理變化 對(duì)照組： 肝臟細(xì)胞無(wú)變性壞死,小葉結(jié)構(gòu)完整清晰,無(wú)纖維組織和膽管增生,肝細(xì)胞形態(tài)正常,以中央靜脈為中心向四周呈放射狀排列,無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)； 模型組： 肝細(xì)胞點(diǎn)狀、灶狀壞死,小葉分界不清,膽管增生,周圍纖維組織增生,肝細(xì)胞腫大,肝索排列紊亂；茵芪肝復(fù)顆粒組： 肝臟小葉結(jié)構(gòu)完整清晰,肝細(xì)胞腫脹,肝索呈放射狀(圖1).

2.2 肝功能 茵芪肝復(fù)顆粒組、模型組、對(duì)照組AST、ALT、ALP、TB、GGT比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)； 茵芪肝復(fù)顆粒組AST、ALT、ALP、TB、GGT低于模型組,高于對(duì)照組(P＜0.05)(圖2).

2.3 血清相關(guān)指標(biāo) 茵芪肝復(fù)顆粒組、模型組、對(duì)照組IL-17、IL-4、IFN-γ、SOD、MDA比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)； 模型組IL-17、IFN-γ、MDA高于對(duì)照組,IL-4、SOD低于對(duì)照組(P＜0.05)； 茵芪肝復(fù)顆粒組IL-17、IFN-γ、MDA低于模型組,IL-4、SOD高于模型組(P＜0.05)； 茵芪肝復(fù)顆粒組IL-17、IFN-γ、MDA高于對(duì)照組,SOD低于對(duì)照組(P＜0.05)； 茵芪肝復(fù)顆粒組IL-4與對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(圖3).

2.4 肝組織mRNA水平 茵芪肝復(fù)顆粒組、模型組、對(duì)照組IL-17、IL-4、IFN-γ、SOD、FXR mRNA水平比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)； 模型組IL-17、IFN-γ mRNA高于對(duì)照組,IL-4、SOD、FXR mRNA低于對(duì)照組(P＜0.05)；茵芪肝復(fù)顆粒組IL-17、IFN-γ mRNA低于模型組,IL-4、SOD、FXR mRNA高于模型組(P＜0.05)； 茵芪肝復(fù)顆粒組IL-17、IFN-γ mRNA高于對(duì)照組,SOD、FXR mRNA低于對(duì)照組(P＜0.05)； 茵芪肝復(fù)顆粒組IL-4 mRNA與對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(圖4).

2.5 相關(guān)性分析LOGISTIC多元回歸發(fā)現(xiàn),IL-17、IFN-γ、MDA與CP呈正相關(guān),SOD、FXR與CP呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)； IL-4與CP無(wú)相關(guān)性(P＞0.05)(表1).

3 討論

目前制備CP主要有兩種方法： 一類是對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)施膽總管結(jié)扎,引起肝外膽汁淤積實(shí)現(xiàn)造模,是外科領(lǐng)域常用方法； 一類是應(yīng)用ANIT處理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,該方法簡(jiǎn)單易行,造模方便,且成模率高,其保留膽總管,造成肝臟病變與人肝內(nèi)膽汁淤積性肝病相似,因此本研究選取ANIT制備模型.李華等[5]報(bào)道以ANIT處理健康雄性大鼠制備CP模型,發(fā)現(xiàn)大鼠AST、ALT等明顯升高.AST、ALT、ALP、TB、GGT是臨床評(píng)價(jià)肝功能常用指標(biāo),其中AST主要存在于肝細(xì)胞線粒體中,當(dāng)肝臟受到損傷時(shí),其水平可表現(xiàn)出升高,故能反應(yīng)肝細(xì)胞受損程度； ALT主要分布于肝細(xì)胞中,正常情況下血清中含量微小,當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí),其在血清中水平可明顯升高,根據(jù)Williams等[6]研究,1%肝細(xì)胞壞死可使ALT血中表達(dá)水平成倍增高,故是診斷肝細(xì)胞損傷敏感性指標(biāo)； ALP、GGT主要存在于肝細(xì)胞微粒體、毛細(xì)膽管膜、毛細(xì)膽管微絨膜中,可作為評(píng)價(jià)膽道阻塞與膽汁淤積指標(biāo)[7]； TB來(lái)源于血液中衰老紅細(xì)胞,主要代謝場(chǎng)所為肝臟,故能反應(yīng)肝臟膽汁淤積.茵芪肝復(fù)顆粒內(nèi)柴胡可利膽、疏肝、理氣,菌陳配伍大黃可活血退黃、清利濕熱,黃芪配伍黨參可健脾扶正、益氣升陽(yáng),當(dāng)歸養(yǎng)血柔肝,焦梔子可除煩解郁、清利三焦?jié)駸?豬苓利水滲濕,白花蛇舌草可涼血解毒、清熱利濕,炙甘草益氣和中,調(diào)和上述諸藥,全方共起扶正祛邪、清熱解毒、健脾益氣柔肝及利濕退黃功效。本研究對(duì)比發(fā)現(xiàn),3組肝組織病理差異明顯,與對(duì)照組相比,模型組肝臟細(xì)胞、結(jié)構(gòu)存在明顯異常,而經(jīng)茵芪肝復(fù)顆粒處理后存在肝細(xì)胞腫脹,但肝臟小葉結(jié)構(gòu)完整清晰,肝索呈放射狀,提示茵芪肝復(fù)顆粒能直接改善CP大鼠肝臟細(xì)胞與結(jié)構(gòu)形態(tài).從肝功能角度分析,茵芪肝復(fù)顆粒組AST、ALT、ALP、TB、GGT低于模型組(P＜0.05),說(shuō)明茵芪肝復(fù)顆粒能明顯改善CP大鼠肝功能.

CP發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜,目前已證實(shí)氧化系統(tǒng)、炎癥因子等共同參與了發(fā)病過(guò)程[8].IL-17是來(lái)源于T細(xì)胞的細(xì)胞因子,可促進(jìn)T細(xì)胞激活,刺激內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞等分泌巨噬細(xì)胞刺激因子、IL-6、IL-8等多種細(xì)胞因子,介導(dǎo)炎癥的產(chǎn)生.國(guó)外相關(guān)研究指出,其是T細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)早期啟動(dòng)因子[9].動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)表明,Th17細(xì)胞能通過(guò)分泌IL-17參與急性肝損傷和肝內(nèi)炎癥過(guò)程[10].劉桂玲等[11]報(bào)道顯示,肝炎患者肝組織細(xì)胞中IL-17表達(dá)量明顯高于健康人群.IFN-γ可由T細(xì)胞、Th1細(xì)胞等產(chǎn)生,結(jié)合受體后可激活中性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等,促進(jìn)炎癥發(fā)生.研究指出,IFN-γ可導(dǎo)致肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞壞死,誘發(fā)肝臟炎癥反應(yīng)[12].IL-4在大鼠中由Th2細(xì)胞產(chǎn)生,具有免疫調(diào)節(jié)作用,可增強(qiáng)B細(xì)胞提呈抗原能力,抑制IFN-γ轉(zhuǎn)錄[13].黃傳鐘等[14]研究指出,乙肝病毒感染及肝癌患者IL-4表達(dá)被抑制,IL-17表達(dá)量增加.MDA來(lái)源于脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程,可反映細(xì)胞受活性氧、自由基攻擊程度.SOD與MDA具有相反生理功能,可滅活機(jī)體內(nèi)氧自由基,具有較強(qiáng)抗氧化作用[15].動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)表明,慢性肝損傷大鼠肝組織細(xì)胞中MDA表達(dá)量較高,SOD呈低表達(dá)狀態(tài)[16].本研究結(jié)果顯示,茵芪肝復(fù)顆粒組血清及肝組織細(xì)胞IL-17、IFN-γ、MDA表達(dá)低于模型組,IL-4、SOD表達(dá)高于模型組(P＜0.05),說(shuō)明茵芪肝復(fù)顆?？筛纳蒲装Y反應(yīng),提高抗氧化能力,這可能是其改善肝功能作用機(jī)制之一.

此外FXR系核受體超級(jí)家族孤核受體,在肝臟膽汁酸、脂質(zhì)代謝、肝臟炎癥和腫瘤的發(fā)展過(guò)程中起著重要調(diào)控作用,是近年來(lái)研究熱點(diǎn).國(guó)外動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)表明,FXR能通過(guò)作用于替代途徑限速酶CYP27A及膽汁酸合成經(jīng)典途徑限速酶CYP7A1抑制膽汁酸合成[17].丁艷等[18]研究指出,FXR表達(dá)的降低為急性淤膽型肝炎發(fā)病始動(dòng)環(huán)節(jié),可導(dǎo)致膽汁酸合成增加,解毒及轉(zhuǎn)運(yùn)功能減弱.國(guó)內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),激活FXR治療CP具有保肝利膽作用[19].目前FXR被認(rèn)為是治療膽汁淤積類疾病最有前景靶點(diǎn),但相關(guān)藥物仍處于研發(fā)階段,需大量可靠基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)與臨床實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證.本研究結(jié)果顯示,模型組FXR mRNA低于對(duì)照組(P＜0.05),提示CP大鼠FXR表達(dá)水平較低,而茵芪肝復(fù)顆粒組FXR mRNA高于模型組(P＜0.05),說(shuō)明茵芪肝復(fù)顆?？稍黾覨XR的表達(dá),這可能是其發(fā)揮療效另一機(jī)制.另本研究在以上研究基礎(chǔ)上進(jìn)行了深入分析發(fā)現(xiàn),IL-17、IFN-γ、MDA與CP呈正相關(guān),SOD、FXR與CP呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05),IL-17、IFN-γ、MDA是CP發(fā)生危險(xiǎn)因素,SOD、FXR為保護(hù)因素.值得注意的是,茵芪肝復(fù)顆粒組肝功能指標(biāo)等細(xì)胞因子表達(dá)與對(duì)照組仍存在明顯差異(P＜0.05),提示治療CP時(shí)單一依賴茵芪肝復(fù)顆粒,不能完全糾正肝功能異常、炎癥反應(yīng)等情況,這可為臨床治療CP提供參考,聯(lián)合相關(guān)藥物可能有助于提高療效,但關(guān)于藥物聯(lián)合治療的療效及最佳配伍方案,有待后續(xù)大樣本量、深入探討.

表1 影響肝功能因素

圖1 各組大鼠肝組織病理形態(tài).A: 對(duì)照組； B: 模型組； C: 茵芪肝復(fù)顆粒組.

圖2 3組肝功能指標(biāo)比較(mean±SD).aP＜0.05,與對(duì)照組相比； bP＜0.05,與模型組相比.AST: 谷草轉(zhuǎn)氨酶； ALT: 谷丙轉(zhuǎn)氨酶； ALP: 堿性磷酸酶； TB: 總膽紅素； GGT: 谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶.

綜上所述,茵芪肝復(fù)顆粒能明顯改善CP大鼠肝功能、肝臟細(xì)胞與結(jié)構(gòu)形態(tài),其機(jī)制與調(diào)控IL-17、IFN-γ、MDA等細(xì)胞因子緩解炎癥反應(yīng)、提高抗氧化能力等有關(guān).

圖3 3組血清指標(biāo)比較(mean±SD).aP＜0.05,與對(duì)照組相比； bP＜0.05,與模型組相比.IL-17: 白介素-17； IL-4: 白介素-4； IFN-γ: 干擾素-γ；SOD: 超氧化物歧化酶； MDA: 丙二醛.

圖4 3組肝組織mRNA水平比較(mean±SD).aP＜0.05,與對(duì)照組相比； bP＜0.05,與模型組相比.IL-17: 白介素-17； IL-4: 白介素-4； IFN-γ: 干擾素-γ； SOD: 超氧化物歧化酶； FXR: 法尼酯X受體.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

膽汁淤積性肝炎(cholestatic hepatitis,CP)為不同因素所造成肝細(xì)胞壞死導(dǎo)致膽汁排泌障礙,膽汁不能經(jīng)膽小管至膽囊,造成膽汁在肝內(nèi)淤積,可引起功能紊亂、代謝失調(diào)、臟器損傷等,嚴(yán)重者可導(dǎo)致肝硬化及終末期肝病,危害患者生命安全.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

采用α-異硫氰酸萘酯(α-naphthyl isothiocyanate,ANIT)灌胃法制備CP大鼠模型,分析茵芪肝復(fù)顆粒對(duì)CP大鼠肝功能、血清氧化應(yīng)激等指標(biāo)的影響.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

通過(guò)分析茵芪肝復(fù)顆粒對(duì)大鼠肝臟細(xì)胞與結(jié)構(gòu)形態(tài)、肝功能的影響,以了解茵芪肝復(fù)顆粒治療CP的相關(guān)作用機(jī)制.

實(shí)驗(yàn)方法

比較各組大鼠肝組織病理變化、肝功能指標(biāo)、血清炎癥因子、氧化應(yīng)激指標(biāo),及肝組織白介素(interleukin,IL)-17、IL-4、干擾素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、法尼酯X受體(farnesyl X receptor,FXR)mRNA水平,LOGISTIC多元回歸方程分析影響肝功能因素.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

茵芪肝復(fù)顆粒組大鼠肝功能指標(biāo)均低于模型組,血清IL-17、IFN-γ、MDA低于模型組,IL-17、IFN-γ、MDA與CP呈正相關(guān),SOD、FXR與CP呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05).

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

茵芪肝復(fù)顆粒能夠提升CP大鼠抗氧化能力,降低血清內(nèi)炎癥因子含量,改善大鼠肝功能.

展望前景

由于人力和時(shí)間等因素限制,本研究中部分?jǐn)?shù)據(jù)難免存在偏頗,下一步將繼續(xù)學(xué)習(xí)有關(guān)理論知識(shí)和臨床實(shí)踐,進(jìn)行更大樣本量,更多觀察指標(biāo)的研究.