擬南芥LBD15互作蛋白的篩選和鑒定

郭兆來(lái)，孫旭東，楊永平，徐慧妮

(1.昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500;2.中國(guó)科學(xué)院 昆明植物研究所，云南 昆明 650201)

LBD(Lateral organ boundaries domain)是一類植物所特有的轉(zhuǎn)錄因子，具有保守的LOB(Lateral organ boundary)結(jié)構(gòu)域。LOB結(jié)構(gòu)域的特征是有具DNA結(jié)合活性的CX2CX6CX3C鋅指結(jié)構(gòu)域和Gly-Ala-Ser(GAS)域及具蛋白結(jié)合活性的LX6LX3LX6L亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域組成[1]。LBD蛋白家族可以分為2個(gè)亞家族：Class Ⅰ和Class Ⅱ[2-3]。Class Ⅰ主要參與了植物側(cè)生器官的發(fā)育和生長(zhǎng)素信號(hào)的級(jí)聯(lián)傳遞[4-6]。而Class Ⅱ主要參與了花青素的合成和氮代謝[7]。

AtLBD15是擬南芥LBD家族的一個(gè)成員，在擬南芥葉柄細(xì)胞脫分化研究中發(fā)現(xiàn)，AtLBD15可能參與了擬南芥葉柄細(xì)胞的脫分化過(guò)程，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)AtLBD15表達(dá)可能受細(xì)胞分裂素的調(diào)控[12]。并且LBD15參與調(diào)控維管組織分化的調(diào)控[13]。Mangeon等[14]研究發(fā)現(xiàn)，LBD基因家族功能具有多樣性，其多樣性可能與啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控域和編碼區(qū)功能域的不同相關(guān)，調(diào)控區(qū)域和功能域的多樣性能夠?qū)е轮貜?fù)基因的亞功能化或者新功能[15-16]。本研究通過(guò)酵母雙雜技術(shù)篩選到一批與LBD15互作的調(diào)控蛋白，為進(jìn)一步解析擬南芥LBD15的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用擬南芥為哥倫比亞(Columbia Col-0)，種植于云南省昆明市中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所，酵母菌株Y2HGold、Y187，大腸桿菌(Escherichiacoli)都是云南省昆明市中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所種質(zhì)庫(kù)保藏的；酵母雙雜交載體的質(zhì)粒為pDEST-GADT7(pGADT7，AD)、pDEST-GBKT7(pGBKT7，BD)，質(zhì)粒購(gòu)置自ABRC。

1.2 擬南芥RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

利用EastepTM Universal RNA Extraction Kit (Promega，中國(guó)上海)試劑盒提取擬南芥總RNA，用ND-1000分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度和質(zhì)量。利用GoScriptTM?Reverse Transcription System試劑盒以提取的總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板用LBD15基因特異引物(ENTR-L15F：caccATGTCAAGAGAAAGGGAGAG；ENTR-L15R：ACCGAAGTAGTTGTTCTCAC)擴(kuò)增得到LBD15的基因序列。利用Gateway技術(shù)將LBD15重組到質(zhì)粒pGADT7、pGBKT7，PCR檢測(cè)陽(yáng)性克隆，陽(yáng)性克隆送碩擎測(cè)序驗(yàn)證。

1.3 酵母轉(zhuǎn)化、重組質(zhì)粒細(xì)胞毒性和自激活檢測(cè)

將構(gòu)建好的BD-LBD15重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到用LiAC法制備的Y2HGold酵母菌株的感受態(tài)細(xì)胞中，用SD/-T選擇性平板進(jìn)行篩選，將篩選到的單菌落在SD/-T液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并且用作酵母雜交的種子液。

1.4 通過(guò)酵母cDNA文庫(kù)篩選結(jié)合蛋白

將上述轉(zhuǎn)化到酵母Y2HGold菌株中的重組質(zhì)粒BD-LBD15，通過(guò)選擇性平板(SD/-T)篩選后，在28 ℃搖床中培養(yǎng)到OD260=0.8，然后將其與含有cDNA文庫(kù)的酵母Y187菌株混合培養(yǎng)24 h，將混合培養(yǎng)后的酵母細(xì)胞離心，棄多余的上清，剩下100 μL重懸沉淀后，涂到TDO(SD/-Trp/-Leu/-Ade)的平板上，放入28 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)2～3 d取出，在超凈臺(tái)里用滅過(guò)菌的槍頭將平板上的菌落轉(zhuǎn)移到QDO(SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His)平板上，菌落的編號(hào)不變， 28 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，挑選QDO平板上的菌落，28 ℃搖床上進(jìn)行培養(yǎng)，用酵母質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑選單菌落按編號(hào)送到公司測(cè)序，對(duì)測(cè)序后的結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 含LBD15基因的pGBKT7載體的重組

RT-PCR克隆LBD15基因獲得大小為675 bp的片段(圖1-A),與預(yù)期條帶相符；用Gateway技術(shù)將LBD15重組到質(zhì)粒pGBKT7后轉(zhuǎn)化大腸桿菌。挑選單菌落進(jìn)行PCR鑒定有帶，提取PCR鑒定有帶的重組表達(dá)載體的質(zhì)粒然后進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證(圖1-B)，陽(yáng)性克隆的菌送到碩擎測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

2.2 重組質(zhì)粒pGBKT7-LBD15的自激活檢測(cè)

將構(gòu)建得到的BD-LBD15和AD質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到酵母Y2HGold菌株中，在選擇性的二缺平板(SD/-Leu/-Trp)上進(jìn)行篩選，并且將長(zhǎng)出來(lái)的酵母菌落點(diǎn)滴到四缺板上(SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His)，同時(shí)共轉(zhuǎn)pGADT7(AD)和BD到Y(jié)2HGold菌株中，作為負(fù)對(duì)照，放入28 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)2～3 d后觀察結(jié)果，試驗(yàn)組和負(fù)對(duì)照沒有菌落長(zhǎng)出，說(shuō)明重組質(zhì)粒BD-LBD15沒有自激活現(xiàn)象，即LBD15蛋白在酵母菌株Y2H中沒有自激活的現(xiàn)象，適合用作互作蛋白文庫(kù)的篩選(圖2)。

A.LBD15基因PCR擴(kuò)增；B.酵母表達(dá)載體pGBKT7-LBD15雙酶切鑒定；M1.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)500～2 000 bp; M2.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)500～2 000 bp。

A.PCR amplification ofLBD15gene; B.Identification of yeast expression vector pGKT7-LBD15by double enzyme digestion; M1. DNA Marker DL2000; M2.DNA Marker DL2000.

圖1 含LBD15基因的酵母表達(dá)載體構(gòu)建
Fig.1 Construction of yeast expression vectorcontainingLBD15gene

圖2 pGBKT7-LBD15自激活檢測(cè)Fig.2 Identification of pGBKT7-LBD15 for auto-activation

2.3 互作蛋白的篩選與分離

將共轉(zhuǎn)化酵母菌株Y2H感受態(tài)細(xì)胞中的BD-LBD15質(zhì)粒和擬南芥cDNA文庫(kù)均勻的涂布于DDO/X/A的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)；挑選陽(yáng)性的單克隆進(jìn)一步接種到QDO/X/A固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。將候選的陽(yáng)性單克隆轉(zhuǎn)接到DDO/X固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，然后篩選分離出藍(lán)色陽(yáng)性單克隆(圖3)。

圖3 候選蛋白在DDO/X固體培養(yǎng)基中的篩選Fig.3 Screening of candidate proteins in DDO/X solid medium

2.4 LBD15 cDNA文庫(kù)的篩選結(jié)果

把在TDO板上得到的酵母菌落，在轉(zhuǎn)移到新的TDO平板上保存并給予唯一編號(hào)，然后挑選單菌落，搖菌提質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌，37 ℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)，挑選單菌落，搖菌后送到公司進(jìn)行測(cè)序。

在本次篩庫(kù)試驗(yàn)中，146個(gè)樣送測(cè)序有107個(gè)測(cè)出序列，通過(guò)NCBI Blast分析，其中有96個(gè)獲得了基因號(hào)，占總數(shù)的87.9%。根據(jù)基因號(hào)進(jìn)行分類，得到了48個(gè)蛋白。然后把基因號(hào)通過(guò)網(wǎng)站TAIR(www.arabidopsis.org/index.jsp)查找其蛋白序列，通過(guò)http://cello.life.nctu.edu.tw/分析其亞細(xì)胞定位。每個(gè)蛋白在篩選文庫(kù)中重復(fù)的次數(shù)以及功能的描述如表1所示。在篩選到的這48個(gè)蛋白中有59%的蛋白都有重復(fù)。

表1 LBD15結(jié)合蛋白及功能分析Tab.1 The functional analysis of LBD15 binding proteins

利用Blast2GO對(duì)候選的48個(gè)基因進(jìn)行了Gene Ontology(GO)注釋(圖4)，結(jié)果表明，AtLBD15候選互作蛋白參與了14個(gè)生物過(guò)程，包括細(xì)胞過(guò)程、代謝過(guò)程、刺激響應(yīng)、生物過(guò)程的調(diào)控、單組織和多組織過(guò)程及發(fā)育進(jìn)程調(diào)控等。

圖4 AtLBD15候選互作蛋白Go Ontology注釋Fig.4 Go Ontology annotation of AtLBD15 candidate interaction proteins

2.5 互作蛋白的分離和回復(fù)驗(yàn)證

將BD-LBD15誘餌質(zhì)粒和篩選出的互作蛋白的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞，在SD/-Trp/-Leu營(yíng)養(yǎng)缺陷型平板上培養(yǎng)，挑選單菌落于1 mL YPDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，吸取1 μL培養(yǎng)渾濁的菌液點(diǎn)至SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His營(yíng)養(yǎng)缺陷型平板上培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AP19蛋白及其他一些蛋白的菌落能夠在營(yíng)養(yǎng)缺陷型的平板上正常生長(zhǎng)(圖5)，初步證實(shí)，AP19等候選蛋白與LBD15蛋白在酵母細(xì)胞中互作。

圖5 酵母雙雜交回復(fù)驗(yàn)證Fig.5 Confirmation of positive interaction by yeast two-hybrid

3 討論

LBD是植物特有的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族，在植物生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程中起著重要的作用。擬南芥基因組中存在42個(gè)LBD基因，分為2個(gè)亞家族，亞家族Ⅰ比亞家族Ⅱ多了一個(gè)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，這一結(jié)構(gòu)可能在蛋白互作中起作用[2]。LBD調(diào)控了大量的生長(zhǎng)發(fā)育和代謝進(jìn)程，像葉片發(fā)育、花發(fā)育、胚形成、側(cè)根形成及氮和花青素代謝[17-18]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，LBD還參與調(diào)控了花粉發(fā)育、植物再生、感病性、光形態(tài)建成、次生生長(zhǎng)及葉柄發(fā)育[1, 19]。由植物激素誘導(dǎo)植物再生過(guò)程的第一步便是愈傷組織的形成, 該過(guò)程與側(cè)根發(fā)育過(guò)程極其相似[20]。

前期工作發(fā)現(xiàn)，LBD15參與了植物再生、莖頂端分生組織調(diào)控及次生細(xì)胞壁的形成[12, 21-22]。最近又有研究組發(fā)現(xiàn)，LBD15能夠直接結(jié)合到VND7啟動(dòng)子上激活其表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)導(dǎo)管的形成[23]。利用LBD5篩選酵母文庫(kù)，獲得了48個(gè)互作的蛋白，這些蛋白參與了多個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，涉及多個(gè)方面的功能，如細(xì)胞過(guò)程、代謝過(guò)程、刺激響應(yīng)、生物過(guò)程的調(diào)控和發(fā)育過(guò)程等，證實(shí)了LBD功能多樣性的作用機(jī)制。在篩選的48個(gè)互作蛋白種有1個(gè)Expansin-LikeA1(EXPLA)蛋白，但是AtLBD15和EXPLA作用機(jī)理還不了解。LBD18通過(guò)結(jié)合到EXP14和EXP17啟動(dòng)子上激活其表達(dá)，進(jìn)而參與到生長(zhǎng)素調(diào)控的側(cè)根原基起始過(guò)程中[9]。而LBD15與EXPLA發(fā)生互作可能與莖頂端分生細(xì)胞伸展生長(zhǎng)有關(guān)。二者之間的互作關(guān)系的機(jī)理研究對(duì)LBD15調(diào)控莖頂端分生組織發(fā)育的調(diào)控具有一定的意義。維管形成層細(xì)胞的表面受體是PXY(Phloem intercalated withxylem), 其通過(guò)與亮氨酸的結(jié)合作用來(lái)介導(dǎo)維管組織的形成。近期有文章研究發(fā)現(xiàn), PXY同WOX14、LBD4及TMO6(Target of monopteros 6)形成了一個(gè)復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò), 協(xié)同調(diào)控維管組織的形成過(guò)程[24-25]。

近年來(lái)，泛素化過(guò)程受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注，其是植物蛋白最常見的修飾方式之一，在細(xì)胞生命活動(dòng)的許多進(jìn)程中發(fā)揮著重要的作用。泛素化的蛋白質(zhì)會(huì)被蛋白酶體(Proteasome)識(shí)別進(jìn)而被降解。3種泛素酶即：活化酶E1(Ubiquitin activating enzyme)、結(jié)合酶E2(Ubiquitin conjugating enzyme)和連接酶E3(Ubiquuitin-protein ligase)共同介導(dǎo)了泛素化這一過(guò)程。本試驗(yàn)篩到1個(gè)與AtLBD15互作的泛素結(jié)合酶E2-UBC6。推測(cè)AtLBD15和UBC6互作可能參與了刺激響應(yīng)及免疫反應(yīng)等。

LBD 家族蛋白在高等植物中分布廣泛，在高等植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著十分重要的作用，然而其功能的分子機(jī)制并不清楚。后續(xù)工作將主要獲得擬南芥LBD15互作蛋白的遺傳材料，利用遺傳學(xué)和分子生物學(xué)深入研究LBD15蛋白的功能，以期更好地闡明其工作機(jī)理。