黑龍江東部大豆疫霉生理小種及毒性結(jié)構(gòu)時空動態(tài)分析

賈夢瑱，張 斌，田 苗,2，揭 巖，趙鈺琦，高新穎，顧 鑫，丁俊杰，陳宇飛，文景芝

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院 農(nóng)畜產(chǎn)品綜合利用研究所，黑龍江佳木斯 154007；3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 佳木斯分院，黑龍江 佳木斯 154007)

由大豆疫霉(PhytophthorasojaeKaufmann & Gerdemann)侵染引起的大豆疫霉根腐病(Phytophthoraroot and stem rot，PRR)在世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生，近年來在黑龍江省發(fā)生普遍，個別年份發(fā)生嚴重[1]。

大豆疫霉是典型的土傳病原菌，以卵孢子在土壤中越冬。翌年春，卵孢子在適宜條件下萌發(fā)產(chǎn)生游動孢子侵染大豆[2]。自然條件下，大豆是大豆疫霉的唯一栽培寄主，二者的關(guān)系符合基因?qū)驅(qū)W說。目前，已鑒定出28個抗大豆疫霉基因(Rps gene)，分別是Rps1a、Rps1b、Rps1c、Rps1d、Rps1k、Rps2、Rps3a、Rps3b、Rps3c、Rps4、Rps5、Rps6、Rps7、Rps8、Rps9、Rps10、Rps11、RpsYD25、RpsYu25、RpsYD29、RpsUN1、RpsJS、RpsSN10、RpsYB30、RpsZS18、RpsAH、RpsUN2和一個未命名基因[3-4]。利用8個含單個不同Rps基因的大豆近等基因系作為鑒別寄主可以對大豆疫霉進行生理小種鑒定[5]。自1957年在美國鑒定出1號生理小種以來，陸續(xù)在美國、加拿大、澳大利亞、阿根廷和巴西等地鑒定出新生理小種[6]，截至2014年，國際上已報道至少59個生理小種和許多新致病型(NewPhytophthorasojae, NPs)[7]。中國至少鑒定出34個生理小種[8-9]，其中黑龍江32個[10]，分別是0～5，8～11，13～15，17，21，23～26，29，33，34，38～40，42～45，48，49，54號[11-14]。1號生理小種在以前被認為是黑龍江省優(yōu)勢小種，其分離頻率高達60%[11]，但在2015年降至1.52%[14]。近年來雖然黑龍江省大豆疫霉生理小種報道很多，但缺乏長期定位調(diào)查結(jié)果。多年普查結(jié)果表明，黑龍江省PRR在東部發(fā)生嚴重。為鑒定黑龍江主要發(fā)病區(qū)大豆疫霉生理小種及致病型并揭示其隨時間和空間而變化的規(guī)律，本試驗連續(xù)4 a定點定期調(diào)查分析黑龍江東部發(fā)病較重的2塊大豆試驗田和2塊大豆生產(chǎn)田中大豆疫霉生理小種及其毒性結(jié)構(gòu)，為利用品種抗性防治黑龍江省PRR提供重要依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 土壤樣品采集

從發(fā)病嚴重的2塊大豆試驗田和2塊大豆生產(chǎn)田采集土壤樣品，分別為黑龍江省農(nóng)科院佳木斯分院大豆品種試驗田和佳木斯農(nóng)墾科學(xué)院大豆品種試驗田，佳木斯土龍山鎮(zhèn)大豆生產(chǎn)田和佳木斯曙光一隊大豆生產(chǎn)田。于2014-2017年7月病害發(fā)生盛期，在4個地塊隨機選取發(fā)病植株根際土，若當(dāng)年某地塊未發(fā)病，則在低洼處取長勢弱的健康植株根際土。從每個地塊至少隨機取10份土樣混合(每份約200 g)帶回室內(nèi)自然陰干，去除雜草石塊等雜質(zhì)，裝入自封袋中密封保存。

1.2 大豆疫霉分離及致病性鑒定

參考文景芝等[8]的方法從土壤中分離大豆疫霉，并對菌株進行DNA分子鑒定。接種不含任何抗疫霉根腐病基因(rps)的感病品種Sloan做致病性鑒定[14]，將確認為大豆疫霉的菌株移到CA斜面培養(yǎng)基上，在15 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 大豆疫霉生理小種鑒定

采用下胚軸傷口接種法進行大豆疫霉生理小種鑒定[14]。鑒別寄主為國際通用的含有8個不同單基因(Rps1a、Rps1b、Rps1c、Rps1d、Rps1k、Rps3a、Rps6、Rps7)的大豆近等基因系[15]，以不含任何Rps基因的大豆品種Sloan(rps)為感病對照。鑒別寄主種子由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)邢邯教授提供?？剐栽u價參考Yang等[16]方法，≥70%植株死亡記為感病(S)，≤30%植株死亡記為抗病(R)，30%～70% 植株死亡記為中間類型(IRT)。參考朱振東等[17]方法，列出感病互作中的Rps基因即為該菌株致病型(Pathotype)，對照Russell[18]生理小種鑒定表確定生理小種號。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Office 2016中的Excel軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑龍江東部大豆疫霉群體結(jié)構(gòu)分析

2.1.1 生理小種多樣性 2014-2017年，從試驗地塊共分離鑒定出497株大豆疫霉，屬于135種致病型其中的139個菌株被鑒定為29個已知生理小種，其余的357個菌株被鑒定為105個新致病型，1個菌株為IRT。29個已知生理小種的分離頻率為0.2%～3.2%，優(yōu)勢度不明顯，其中13號生理小種分離頻率最高，為3.2%。新致病型優(yōu)勢度不明顯，1a,3a致病型分離頻率達到2.8%，其余新致病型分離頻率為0.2%～2.6%。IRT型、2，18，22，42號生理小種以及12個新致病型僅占1株，分離頻率為0.2%(表1)。

表1 2014-2017年黑龍江東部大豆疫霉生理小種、IRT和新致病型及其分離頻率Tab.1 Races, IRT,new pathotypes and their percentages of Phytophthora sojae in Eastern Heilongjiang from 2014 to 2017

2.1.2 對單個Rps基因及Rps基因組合的致病頻率 2014-2017年從4個地塊分離到的497株大豆疫霉對8個Rps基因的致病頻率為27.8%～53.1%，53.1%的菌株對Rps7有毒性，27.8%的菌株對Rps1k有毒性，對其他6個Rps基因的致病頻率在31.6%～43.3%，說明在黑龍江東部種植含Rps1k、Rps3a、Rps1c和Rps6基因的大豆品種相對不易感病，含Rps7基因的大豆品種相對風(fēng)險較高。該地區(qū)大豆疫霉群體可克服1～6個Rps基因，能克服1～3個Rps基因的菌株數(shù)占68.7%，能克服4～6個Rps基因的菌株數(shù)占31.2%，說明黑龍江東部大豆疫霉群體致病力偏弱(表2)。

2.2 黑龍江東部大豆疫霉群體結(jié)構(gòu)時間動態(tài)

2.2.1 生理小種時間動態(tài) 2014-2015年從4個地塊分離到253株大豆疫霉，其中的82株被鑒定為15個已知生理小種，其余的171個菌株被鑒定為40個新致病型。15個生理小種的分離頻率為0.8%～5.9%，優(yōu)勢度不明顯，其中13號生理小種分離頻率最高，為5.9%，8號和53號生理小種分離頻率最低，為0.8%，其余生理小種分離頻率為1.2%～5.1%；新致病型優(yōu)勢度不明顯，1a,3a致病型分離頻率達到5.1%,其余新致病型分離頻率為0.4%～4.7%。2016-2017年，從相同地塊分離到244株大豆疫霉，其中的57株被鑒定為25個已知生理小種，其余的186株被鑒定為87個新致病型，1株為中間類型(IRT)。25個生理小種的分離頻率為0.4%～2.1%，優(yōu)勢度不明顯，其中1號生理小種分離頻率最高，為2.1%，2，13，17，18，22，29，42，45號生理小種分離頻率最低，為0.4%，其余生理小種分離頻率為0.8%～1.6%。新致病型分離頻率為0.4%～3.3%，優(yōu)勢度不明顯，致病型1a,1b,1c分離頻率最高為3.3%，其余新致病型分離頻率為0.4%～2.5%(表1)。

表2 黑龍江東部大豆疫霉群體對單個Rps基因及Rps基因組合的致病頻率Tab.2 Virulence frequencies of Phytophthora sojaepopulation to single Rps gene and Rps gene combination in the East of Heilongjiang

2016-2017年與2014-2015年共同出現(xiàn)的生理小種有11個，分別是1，5，10，11，13，14，17，29，44，45，53號，重復(fù)率37.9%，除53號生理小種分離頻率保持不變外，其他生理小種分離頻率均隨時間推移而降低，13號小種降低5.5百分點，10，11，44號小種降低0.4百分點，其余小種降低0.7～2.0百分點。2年共同出現(xiàn)的新致病型有22個，重復(fù)率20.3%，14個新致病型分離頻率增加0.9～7.4百分點，8個新致病型分離頻率降低0.9～12.1百分點。2016-2017年新增14個生理小種，分別是2，9，15，16，18，21，22，24，25，28，34，35，42，54號，占48.3%；新增65個新致病型，占63.0%。比2014-2015年減少4個生理小種，分別是3，8，23，31號小種，占13.8%，減少18個新致病型，占16.7%?？梢婋S時間推移，共同出現(xiàn)的生理小種分離頻率降低，但生理小種分化迅速，出現(xiàn)更多生理小種和新致病型，表明黑龍江東部大豆疫霉群體毒性組成更加復(fù)雜化、多樣化。

2.2.2 對單個Rps基因致病頻率時間動態(tài) 2014-2015年的253株大豆疫霉對8個Rps基因致病頻率為21.7%～57.7%，<30%的菌株對Rps1k(21.7%)、Rps3a(23.3%)和Rps1c(29.6%)有毒性，>50%的菌株對Rps7(57.7%)有毒性，對其余4個Rps基因致病頻率為30.8%～41.1%。從病原菌致病頻率看，抗病基因?qū)υ摬≡挠行杂筛叩降鸵来螢椋篟ps1k>Rps3a>Rps1c>Rps1b>Rps1d=Rps6>Rps1a>Rps7；2016-2017年的244株大豆疫霉對8個Rps基因致病頻率為29.5%～49.6%，<30%的菌株對Rps6(29.5%)有毒性，49.6%的菌株對Rps1b有毒性，對其余6個Rps基因致病頻率為34.0%～48.8%，從病原菌致病頻率看，抗病基因?qū)υ摬≡挠行杂筛叩降鸵来螢椋篟ps6>Rps1k>Rps1c>Rps1d>Rps3a>Rps1a>Rps7>Rps1b(表2)。

與2014-2015年相比，2016-2017年的群體對Rps6和Rps7有毒性的菌株分別減少8.0，8.9百分點，對其余6個Rps基因有毒性的菌株增加4.4～18.8百分點。2014-2015年對致病頻率低于和接近30%的4個Rps基因(Rps1k、Rps3a、Rps1c和Rps1b)的致病頻率分別增加12.3，16.9，7.3，18.8百分點，增幅排在前4位，說明這4個曾經(jīng)有效的Rps基因正在逐漸失去其有效性。而對原來致病頻率較高的Rps基因，隨著時間推移致病頻率或者稍有提高(如Rps1a和Rps1d)，或者下降(如Rps7和Rps6)?？傮w來說，隨著時間推移，黑龍江東部大豆疫霉群體對絕大多數(shù)Rps基因的致病頻率增加，預(yù)示著絕大多數(shù)Rps基因的有效性在下降(表2)。

2.2.3 群體致病力時間動態(tài) 2016-2017年，黑龍江東部大豆疫霉群體能克服1～6個Rps基因，與2014-2015年相同，能克服1～3個Rps基因的菌株占62.4百分點，比2014-2015年降低12.6百分點，能克服4～6個Rps基因的菌株占37.7%，比2014-2015年增加12.9百分比。說明隨時間推移，黑龍江東部大豆疫霉群體致病力增強，單株大豆疫霉即可克服更多Rps基因(表2)。

2.3 黑龍江東部大豆疫霉群體結(jié)構(gòu)空間動態(tài)

2.3.1 生理小種空間動態(tài) 大豆疫霉生理小種在不同類型地塊的種類和數(shù)量也不同。試驗田分離到246株大豆疫霉，其中的69株被鑒定為18個已知生理小種，其余176株被鑒定為64個新致病型，1個菌株為IRT。18個生理小種的分離頻率為0.4%～5.3%，優(yōu)勢度不明顯，其中3號生理小種分離頻率最高，為5.3%，2，18，22號生理小種和IRT分離頻率最低，為0.4%，其余生理小種分離頻率為0.8%～3.3%；新致病型優(yōu)勢度不明顯，分離頻率為0.4%～3.7%，1c,1d分離頻率達到3.7%，其余新致病型分離頻率為0.4%～2.9%。生產(chǎn)田分離到251株大豆疫霉，其中的70株被鑒定為21個已知生理小種，其余181株被鑒定為65個新致病型。21個生理小種的分離頻率為0.4%～4.0%，優(yōu)勢度不明顯，其中13號生理小種分離頻率最高，為4.0%，11，24，35，42，44號生理小種分離頻率最低，為0.4%，其余生理小種分離頻率為0.8%～3.2%，新致病型分離頻率為0.5%～4.0%，優(yōu)勢度不明顯，其中致病型1a,3a分離頻率最高，為4.0%，其余新致病型分離頻率為0.4%～3.6%。

試驗田與生產(chǎn)田有10個共同生理小種，分別是1，5，10，11，13，15，24，28，35，44號，重疊率34.5%，試驗田有8個小種單獨存在，分別是2，3，18，21，22，25，29，45號，生產(chǎn)田有11個小種單獨存在，分別是8，9，14，16，17，23，31，34，53，54號。與生產(chǎn)田相比，試驗田1，13號生理小種分離頻率降低1.6百分點，5號生理小種分離頻率上升最高，為2.1百分點，10，24，35號生理小種分離頻率上升0.4百分點，11，44號生理小種分離頻率上升2.0百分點，28號小種分離頻率沒有變化；2個地塊共同出現(xiàn)的新致病型有24個，重復(fù)率為22.2%，與生產(chǎn)田相比，試驗田14個新致病型分離頻率增加0.9～10.2百分點，10個新致病型分離頻率降低0.9～11.1百分點。試驗田中3號生理小種分離頻率最高，為5.3%，生產(chǎn)田中13號生理小種分離頻率最高，為4.0%，試驗田比生產(chǎn)田減少41個新致病型，占39.8%。從試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生產(chǎn)田和試驗田生理小種和新致病型種類有所區(qū)別，而數(shù)量差別不大(表3)。

表3 不同地塊生理小種及其分離頻率Tab.3 The races and their isolation frequencies of Phytophthora sojae in different fields

2.3.2 對單個Rps基因致病頻率空間動態(tài) 試驗田246株大豆疫霉對8個Rps基因致病頻率為30.5%～57.3%，>50%的菌株對Rps7(57.3%)有毒性，對其余7個Rps基因致病頻率為30.5%～45.1%。從病原菌致病頻率看，試驗田抗病基因?qū)Σ≡挠行杂筛叩降鸵来螢椋篟ps1k>Rps3a>Rps6>Rps1d=Rps1c>Rps1b>Rps1a>Rps7；生產(chǎn)田251株大豆疫霉對8個Rps基因致病頻率為25.1%～49.0%，<30%的菌株對Rps1k(25.1%)有毒性，對其余7個Rps基因致病頻率為30.3%～49.0%。從病原菌致病頻率看，生產(chǎn)田抗病基因?qū)Σ≡挠行杂筛叩降鸵来螢椋篟ps1k>Rps1c>Rps3a>Rps6>Rps1d>Rps1a>Rps1b>Rps7(表4)。

試驗田大豆疫霉群體對5個Rps基因(Rps1a、Rps1c、Rps1k、Rps6和Rps7)的致病頻率高于生產(chǎn)田，對其余3個Rps基因的致病頻率低于生產(chǎn)田，說明Rps1a、Rps1c、Rps1k、Rps6和Rps7在試驗田中有效性比在生產(chǎn)田低。試驗田中較有效的Rps基因為Rps1k和Rps3a，生產(chǎn)田中較有效的Rps基因為Rps1c和Rps1k，Rps7在試驗田和生產(chǎn)田中的有效性均最低。

表4 不同地塊大豆疫霉群體對單個Rps基因及Rps基因組合致病頻率Tab.4 Virulence frequencies of Phytophthora sojae population to single Rps gene and Rps gene combination in different fields

2.3.3 群體致病力空間動態(tài) 黑龍江東部試驗田菌株能克服1～6個Rps基因，與生產(chǎn)田相同，能克服1～3個Rps基因的菌株占64.7%，比生產(chǎn)田降低8.3百分點；能克服4～6個Rps基因的菌株占35.3%，比生產(chǎn)田增高8.4百分點。表明黑龍江省東部試驗田大豆疫霉群體致病力較強，單株大豆疫霉可克服更多的Rps基因(表4)。

3 結(jié)論與討論

大豆根腐病由多種病原菌侵染引起，包括多種鐮孢菌(Fusariumspp.)、腐霉菌(Pythiumspp.)、立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniKuhn)和大豆疫霉(Phytophthorasojae)[8]。與其他根腐病原菌相比，大豆疫霉是一種難分離的病原菌。此外，土壤中和病組織上還有大量腐生細菌和真菌也會干擾分離效果。大豆疫霉分離通常有病組織分離法、土壤誘捕分離法。有研究僅從病組織上分離大豆疫霉[19]，也有研究從病組織和土壤中共同分離大豆疫霉[20]，但土壤分離法得到的菌株更具代表性[21]。由于當(dāng)年種植的寄主品種只對土壤中的部分大豆疫霉具有選擇性，一旦更換不同基因型品種，選擇性就會改變，因此，只從病組織上分離獲得的大豆疫霉菌株不能完全代表土壤中大豆疫霉群體。本試驗采用土壤分離法，避免因大豆品種基因型對土壤中大豆疫霉基因型的選擇性而導(dǎo)致的試驗偏差，得到的大豆疫霉群體更具代表性，數(shù)據(jù)更準確。本試驗參考文景芝等[8]的葉碟誘捕法加以改進：處理土壤時即加入五氯硝基苯和匹馬霉素抑制真菌，加入利福平、硫酸鏈霉素和萬古霉素抑制細菌，加入惡霉靈抑制腐霉菌，并在選擇性培養(yǎng)基中加入萬古霉素和匹馬霉素，大大提高了分離效率。此外，采用形態(tài)學(xué)和DNA分子鑒定相結(jié)合的方法，再加上接種不含任何抗疫霉根腐病基因的大豆品種Sloan鑒定致病性，確保菌株為大豆疫霉。

目前，在中國已經(jīng)報道了34個大豆疫霉生理小種，除6，7號外，其余32個生理小種在黑龍江均有報道。本試驗鑒定出的29個生理小種中，16，18，22，28，35號為中國首次報道，而原有的4，33，38，39，43，48，49號沒有被分離到。原來在黑龍江一直占優(yōu)勢的1號生理小種的分離頻率從2008年的60%[10]，降到2015年的1.52%[14]和2016年的3.6%[8]，本試驗又繼續(xù)降低到2.4%，與分離頻率最高的3，13號生理小種(分離頻率2.6%和3.2%)基本持平。分析其原因，一方面是由于以往大豆疫霉菌株一般分離自病株，受到大豆品種基因型的選擇，菌株致病型多樣性較低；另一方面，1號生理小種只對Rps7有毒性，而3，13號生理小種除對Rps7有毒性外，還分別增加了對Rps1a和Rps6的毒性，可以看成是在1號生理小種基礎(chǔ)上分別聚合了對Rps1a和Rps6基因毒性演變而來的，本試驗中53.1%的菌株都是在1號生理小種基礎(chǔ)上聚合了對1～5個Rps基因的毒性演變而來，導(dǎo)致1號生理小種失去優(yōu)勢，同時增加了單個菌株的毒性。與2014-2015年相比，2016-2017年新增14個生理小種和65個新致病型，減少了4個生理小種和18個新致病型，表明隨時間推移，黑龍江東部大豆疫霉生理小種分化迅速，年度間即發(fā)生顯著變異，毒性結(jié)構(gòu)組成更加復(fù)雜化多樣，與文景芝等[8]的結(jié)論一致。黑龍江東部大豆疫霉群體致病力較弱，表現(xiàn)在能克服1～3個Rps基因的菌株占2/3，但也存在少量強毒性菌株，如17.3%的菌株能克服4個Rps基因，9.5%的菌株能克服5個Rps基因，3.8%的菌株能克服6個Rps基因。在2009年，黑龍江東部大豆疫霉100%的菌株對Rps7有毒性，50%的菌株對Rps1d和Rps6有毒性，25%的菌株對Rps1a和Rps1b有毒性，沒有菌株能克服Rps1c和Rps1[22]，但到2017年，對Rps7、Rps1d和Rps6有毒性的菌株有所減少，對Rps1a、Rps1b、Rps1c和Rps1k有毒性的菌株有所增加，說明隨時間推移，黑龍江東部大豆疫霉群體毒性結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變異，導(dǎo)致曾經(jīng)有效的Rps基因喪失抗病優(yōu)勢。

通過對生產(chǎn)田和試驗田數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，生理小種和新致病型數(shù)量差異不大，但種類差異較大，只有1/3的生理小種和1/4的新致病型是重復(fù)的，說明在沒有基因交流的2個地塊間，生理小種和新致病型發(fā)生顯著變異。與生產(chǎn)田相比，試驗田大豆疫霉群體對Rps1a、Rps1c、Rps1k、Rps6和Rps7有毒性的菌株有所增加，對Rps1b、Rps1d和Rps3a有毒性的菌株有所減少，說明Rps1a、Rps1c、Rps1k、Rps6和Rps7在試驗田中更危險，Rps1b、Rps1d和Rps3a更安全。試驗田能克服4～6個Rps基因的菌株比生產(chǎn)田增加8.3%，說明試驗田大豆疫霉群體致病力較強；試驗田比生產(chǎn)田少分離3個小種，新致病型減少41個，說明試驗田群體毒性結(jié)構(gòu)較簡單，與文景芝等[8]結(jié)論一致。試驗田大豆品種會每年更換，而生產(chǎn)田大豆品種較單一，依據(jù)寄主對病原菌的選擇性，推測試驗田大豆疫霉群體毒性結(jié)構(gòu)應(yīng)該更復(fù)雜些，但本試驗結(jié)果恰恰相反，原因可能是本試驗選取的試驗田種植的大豆品種具有相同的系譜關(guān)系，如黑龍江省農(nóng)科院佳木斯分院大豆品種試驗田種植的合豐60和合豐55等是以北豐11為母本經(jīng)過有性雜交、系譜法選育而成的[23]，2個品種親緣關(guān)系相近，遺傳背景相似，雖然輪換種植，但對土壤中大豆疫霉群體具有相同的定向選擇性，導(dǎo)致該地塊大豆疫霉群體毒性結(jié)構(gòu)多樣性降低；而生產(chǎn)田一旦更換大豆品種，很可能就是毫無親緣關(guān)系的，使生產(chǎn)田大豆疫霉群體毒性結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣。