山東省玉米穗腐病病原菌的分離鑒定及優(yōu)勢(shì)種的系統(tǒng)發(fā)育分析

丁夢(mèng)軍，楊 揚(yáng)，孫 華，馬紅霞，劉樹森，石 潔

(1.河北省農(nóng)林科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，農(nóng)業(yè)部華北北部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心，河北 保定 071000；2.山東省農(nóng)藥檢定所，山東 濟(jì)南 250100)

玉米在我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要的地位，2016年我國(guó)玉米種植面積達(dá)4 805.7萬(wàn)hm2，是我國(guó)第一大農(nóng)作物。玉米穗腐病(Maizeearrot)，是世界玉米產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生的一類真菌病害，在生產(chǎn)上造成較為嚴(yán)重的產(chǎn)量損失，玉米的品質(zhì)也受到嚴(yán)重影響[1]。玉米穗腐病的發(fā)病率一般為5%～10%，重發(fā)年份發(fā)病率為30%～40%，嚴(yán)重地塊產(chǎn)量損失高達(dá)30%～40%[2]。玉米穗腐病由多種復(fù)雜的病原菌組成，如今已經(jīng)有40多種致病菌種被鑒定出，該病的發(fā)生是由這些致病菌單獨(dú)或復(fù)合侵染引起的[3-4]。目前，已報(bào)道的玉米穗腐病病原菌類群主要包括鐮孢菌(Fusariumspp.)、青霉菌(Penicilliumspp.)、木霉菌(Trichodermaspp.)、蠕孢菌(Helminthosporiumspp.)和曲霉菌(Aspergillusspp.)等，其中鐮孢菌為主要致病菌[5-6]。

不同國(guó)家和地區(qū)所報(bào)道的優(yōu)勢(shì)病原差異較大，G?rtz等[7]通過(guò)分離2006，2007年所采集德國(guó)玉米穗腐病樣品，發(fā)現(xiàn)不同年度間同一地區(qū)病原菌種類及優(yōu)勢(shì)病原菌存在差異，2006年分離到13種鐮孢菌種，其中以擬輪枝鐮孢菌(F.verticillioides)為優(yōu)勢(shì)種；2007年共有10種鐮孢菌，以禾谷鐮孢復(fù)合種(F.graminearumspecies complex)為優(yōu)勢(shì)種。在我國(guó)許多地區(qū)擬輪枝鐮孢菌及禾谷鐮孢復(fù)合種都為當(dāng)?shù)氐膬?yōu)勢(shì)致病菌，其中禾谷鐮孢復(fù)合種則主要分布于山西、陜西、甘肅、云南、貴州等地，東北與黃淮也有較多分布，擬輪枝鐮孢菌主要分布在黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、北京、河北、河南、山東、安徽、四川、湖南、湖北等地[8]。

山東省(34°22′N～38°23′N，114°19′E～122°43′E)地處東部沿海，黃河下游，東部面臨黃海、渤海，西部深入內(nèi)陸，總面積為15.78萬(wàn)km2，其中南部為山地和丘陵，西部和北部是平原，東部為和緩的丘陵。氣候?qū)儆跍貛Т箨懶约撅L(fēng)氣候，春冬季降水少，易形成旱災(zāi)，夏季降水多，易發(fā)生澇災(zāi)[9]。山東省的自然條件適宜玉米生長(zhǎng)，屬黃淮海平原夏玉米區(qū)，位于中國(guó)玉米帶的中心位置，其種植面積和總產(chǎn)均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)[10]。目前，我國(guó)主要從全國(guó)范圍或玉米種植區(qū)研究玉米穗腐病，而關(guān)于山東省玉米穗腐病的單獨(dú)報(bào)道尚未可見，為掌握山東省玉米穗腐病的優(yōu)勢(shì)病原，河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所玉米綜防課題組對(duì)近3 a山東省不同地區(qū)的玉米穗腐病進(jìn)行采樣，對(duì)玉米穗腐病病樣采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方式進(jìn)行分離鑒定，以明確其優(yōu)勢(shì)病原菌及年度間差異，為明確山東省擬輪枝鐮孢菌在3個(gè)年份間的遺傳關(guān)系及與外界的基因交流情況，以EF-1α基因序列為基礎(chǔ)對(duì)3個(gè)年份間及與河北省間的擬輪枝鐮孢菌DNA核苷酸進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，旨在為山東省深入開展對(duì)該病害的抗病育種、發(fā)生發(fā)展規(guī)律以及綜合防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

玉米病樣：在山東省各個(gè)地區(qū)分別對(duì)2015年(27)，2016年(26)，2017年(85)3 a玉米穗腐病樣本進(jìn)行采集工作，采集樣本均為自然發(fā)病，總共138份，樣品均用透氣的紙袋包裝后，在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原菌的分離鑒定。

根據(jù)地理位置，將山東省大致分為5個(gè)區(qū)域，分別為魯東(青島、煙臺(tái))、魯中(濰坊、萊蕪、泰安)、魯西北(東營(yíng)、濱州、德州、聊城)、魯西南(菏澤、濟(jì)寧)、魯中南(棗莊、臨沂)。

馬鈴薯培養(yǎng)基(Potato dextrose agar，PDA)：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

試劑：真菌基因組DNA提取試劑盒，北京艾德萊生物科技有限公司； 引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；2×Es Taq MasterMix(含染料)，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；Biowest Agarose G-10，南京生興生物技術(shù)有限公司。

儀器：東勝龍ETC-811 PCR儀，北京中科星宇科技發(fā)展有限公司； GelDoc XR+凝膠成像分析系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司；DYY-11型電泳儀，北京六一儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌的分離鑒定 從每份采集樣品中剝?nèi)〔〗〗唤缣?～5粒玉米籽粒，將籽粒放入15 mL離心管中，向離心管中加入75%的酒精處理3 min，在1.5%的NaClO中浸泡表面消毒3 min，再用無(wú)菌水仔細(xì)沖洗3次，消毒完成后用無(wú)菌濾紙將籽粒表面多余的水分吸干，將籽粒置于馬鈴薯培養(yǎng)基上，放入25 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)光照培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)出后及時(shí)挑取菌絲，進(jìn)行純化培養(yǎng)。觀察菌落顏色、形態(tài)等性狀，根據(jù)其在馬鈴薯培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)、孢子的有無(wú)、大小、形態(tài)等特征，參考魏景超[11]和方中達(dá)[12]的方法對(duì)其進(jìn)行初步鑒定，并提取純化培養(yǎng)菌落的DNA，進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，所用引物信息見表1。

PCR反應(yīng)體系為：DNA模板1 μL、10 μmol/L的上下游引物各0.5 μL、Taq Mix 12.5 μL，再加入ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性1 min,56 ℃退火30 s，不同引物退火溫度如表1所示,72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min，4 ℃保存擴(kuò)增產(chǎn)物。產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，將擴(kuò)增出條帶的PCR產(chǎn)物交由北京生物工程有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行Blast比對(duì)。

根據(jù)分子鑒定結(jié)果對(duì)玉米穗腐病病原菌的分離頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，病原菌分離頻率=不同病原菌菌株數(shù)/總菌株數(shù)×100%。

表1 本研究所用引物Tab.1 The primers used in this study

1.2.2 擬輪枝鐮孢菌系統(tǒng)發(fā)育分析 將2015-2017年已鑒定為擬輪枝鐮孢菌的84個(gè)菌株和2017年河北省的5個(gè)擬輪枝鐮孢菌菌株基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，得到了EF-1α大小為700 bp左右的目的片段，利用MEGA 5.2軟件采用最大簡(jiǎn)約法(Maximum parsimony)構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹，聚類樹中節(jié)點(diǎn)處的置信度用1 000次自舉法(Bootstrap)來(lái)完成[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 山東省玉米穗腐病病原菌種類及分離頻率

2015-2017年從山東省采集的138份玉米穗腐病樣本中共分離到7個(gè)屬的18種真菌，其中有10種真菌有文獻(xiàn)報(bào)道能夠侵染玉米籽粒，引起穗腐病，而另外8種真菌，包括產(chǎn)紫青霉(P.purpurogenum)、微紫青霉(P.janthinellum)、嗜松青霉(P.pinophilum)、變紅鐮孢菌(F.incarnatum)、厚垣鐮孢菌(F.chlamydosporum)、繩狀青霉(P.funiculosum)、玉蜀黍帚枝菌(Sarocladiumzeae)和枝狀枝孢霉(C.cladosporioides)是否為玉米穗腐病的致病菌有待進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證，因其分離頻率較低，在此歸為其他，在下文中不做進(jìn)一步討論。

在分離到的病原菌中擬輪枝鐮孢菌(F.verticillioides)分離頻率最高，為67.39%，是山東省玉米穗腐病優(yōu)勢(shì)病原菌；其次為層出鐮孢菌(F.proliferatum)，分離頻率為10.87%；禾谷鐮孢復(fù)合種(F.graminearumspecies complex)、尖孢鐮孢菌(F.oxysporium)和木賊鐮孢菌分別(F.equiseti)為7.97%，0.72%，5.80%；哈茨木霉(T.harzianum)分離頻率為7.91%；草酸青霉分離頻率為6.52%(P.oxalicum)；黃曲霉(A.flavus)和黑曲霉(A.niger)的分離頻率分別為2.17%，5.07%(表2)。

2.2 山東省2015-2017年玉米穗腐病病原菌

由表2可知，擬輪枝鐮孢菌連續(xù)3 a病原菌的分離頻率均居于首位，2015-2017年擬輪枝鐮孢菌的分離頻率分別為48.15%，61.54%，75.29%，其分離頻率隨時(shí)間有所上升；層出鐮孢菌2015年未分離到， 2017年分離頻率為15.29%，高于2016年的7.69%；禾谷鐮孢復(fù)合種2015年的分離頻率為22.22%，遠(yuǎn)高于2016年和2017年的7.69%和3.53%；木賊鐮孢菌2015年為22.22%，2016年未分離到，2017年為0.23%，存在較大差異；尖孢鐮孢菌只在2017年分離到，分離頻率為1.18%；哈茨木霉3 a的分離頻率依次為3.70%， 7.69%，9.41%；草酸青霉和黃曲霉僅在2017年分離到，分離頻率分別為10.59%和3.53%；黑曲霉在2016年和2017年的分離頻率分別為3.85%和7.06%。

對(duì)于已經(jīng)報(bào)道為玉米穗腐病病原菌的真菌，在2015年僅分離到4種，分別為擬輪枝鐮孢菌、禾谷鐮孢復(fù)合種、木賊鐮孢菌和哈茨木霉；2016年分離到5種，分別為擬輪枝鐮孢菌、層出鐮孢菌、禾谷鐮孢復(fù)合種、哈茨木霉和黑曲霉；2017年分離到9種，分別為擬輪枝鐮孢菌、層出鐮孢菌、禾谷鐮孢復(fù)合種、尖孢鐮孢菌、木賊鐮孢菌、哈茨木霉、草酸青霉、黃曲霉和黑曲霉，在山東省引起玉米穗腐病病原菌的種類呈逐年上升趨勢(shì)。

表2 山東省玉米穗腐病病原菌分離頻率Tab.2 Isolation frequency of Maize ear rot pathogen in Shandong Province %

2.3 山東省玉米鐮孢穗腐病病原菌的分布

由圖1可知，在山東省5個(gè)區(qū)域中的優(yōu)勢(shì)病原菌均為擬輪枝鐮孢菌，魯西北、魯西南、魯東、魯中和魯中南的分離頻率依次降低，分別為76.67%，73.08%，65.22%，61.29%，60.71%，西部地區(qū)分離頻率高于中東部地區(qū)，這可能與天氣因素有關(guān)；層出鐮孢菌在魯中、魯東、魯中南和魯西北的分離頻率依次為19.35%，13.04%，10.71%，10.00%；魯西南地區(qū)禾谷鐮孢復(fù)合種的分離頻率高于其他地區(qū)，為15.38%；尖孢鐮孢菌只在魯東沿海地區(qū)分離到，分離頻率為4.35%，木賊鐮孢菌在魯西北地區(qū)未分離到。

圖1 山東省玉米穗腐鐮孢菌的分離頻率Fig.1 Isolation frequency of Fusarium in Shandong Province

2.4 不同年度擬輪枝鐮孢菌DNA核苷酸系統(tǒng)發(fā)育分析

如圖2所示，各菌株最前方字母A、B和C分別代表2015，2016，2017年采集的12，13，59個(gè)菌株，D代表2017年河北省擬輪枝鐮孢菌的5個(gè)菌株。將分離鑒定的89個(gè)菌株分為2個(gè)群，Ⅰ群和Ⅱ群間的遺傳距離為0.002～0.016。Ⅰ群包含53個(gè)菌株，分別為7個(gè)2015年菌株、5個(gè)2016年菌株、37個(gè)2017年的菌株和4個(gè)2017年河北菌株，其菌株間遺傳距離為0.000～0.007。Ⅱ群包含36個(gè)菌株，分別為5個(gè)2015年菌株、8個(gè)2016年菌株、22個(gè)2017年的菌株和1個(gè)2017年河北菌株，其菌株間遺傳距離為0.000～0.007。

圖2 基于EF-1α基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of constructed based on EF-1α gene sequences

在Ⅰ群中2017年4個(gè)河北菌株DYM50-2、DYM21-3、DYM16-2和DYM16-1與2017年49個(gè)山東菌株聚集在一個(gè)分支上，在Ⅱ群中1個(gè)河北菌株DYM50-1與2017年除CYM49外的34個(gè)山東菌株聚集在一個(gè)分支上，表明2017年河北和山東省菌株遺傳距離較小，親緣關(guān)系較近，2個(gè)省份間存在頻繁的基因交流。

如表3所示，2015和2016年年度間的遺傳距離為0.003 6，2016和2017年為0.003 7，其遺傳距離有所增高，但漲幅較低，年度間菌株遺傳距離小，相似性較高。

表3 擬輪枝鐮孢菌年度間的遺傳距離Tab.3 The annual genetic distance of the Fusarium verticillioides

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)對(duì)山東省2015-2017年的玉米穗腐病病原菌進(jìn)行了分離鑒定，結(jié)果顯示，擬輪枝鐮孢菌在3 a的分離頻率均最高，為山東省玉米穗腐病的優(yōu)勢(shì)病原菌，這與孫華等[18]在2013,2015年山東省分離的優(yōu)勢(shì)病原菌一致。秦子惠[19]2009-2013年分離了18個(gè)省的穗腐樣本，山東省的優(yōu)勢(shì)病原菌為擬輪枝鐮孢菌。該菌同時(shí)也是甘肅、重慶、遼寧和河北省等地區(qū)的優(yōu)勢(shì)病原菌[20-23]，而有些區(qū)域內(nèi)鐮孢菌種群結(jié)構(gòu)及分布存在較大差異，如安徽鳳陽(yáng)的優(yōu)勢(shì)病原菌為禾谷鐮孢菌[24]，東北地區(qū)則為半裸鐮孢菌[25]，這可能與不同地區(qū)間的氣候條件、玉米種植品種以及自然環(huán)境等因素有關(guān)，因此，明確不同生態(tài)區(qū)玉米穗腐病的優(yōu)勢(shì)致病菌，對(duì)于有針對(duì)性地開展防控相關(guān)研究具有重要的指導(dǎo)意義。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示2015-2017年擬輪枝鐮孢復(fù)合種和層出鐮孢菌分離頻率逐年上升，禾谷鐮孢菌分離頻率逐年下降，分析原因可能與天氣有關(guān)，9月份是玉米灌漿至成熟期，玉米生殖器官生長(zhǎng)較為旺盛，若此期間遭遇低溫陰雨寡照天氣，極易導(dǎo)致玉米被霉菌感染，造成穗腐病的發(fā)生[26]，而禾谷鐮孢復(fù)合種在溫?zé)岢睗竦臍夂驐l件下容易發(fā)生，擬輪枝鐮孢菌和層出鐮孢菌更喜歡干熱的環(huán)境[27-28]，山東減災(zāi)網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，2017年山東省9月降雨量較往年偏少54.0%，而 2015年山東省8月底到9月初連續(xù)降雨[29-30]，2 a的氣溫較往年都有所偏高，適宜的外部環(huán)境有可能導(dǎo)致擬輪枝、層出和禾谷鐮孢復(fù)合種的發(fā)生。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2015年木賊鐮孢菌的分離頻率較高，我國(guó)對(duì)木賊鐮孢菌研究相對(duì)較少，具體原因有待進(jìn)一步研究。其他菌株不同年份具有不同的病原菌分離頻率，這可能是因?yàn)椴煌攴蓍g的氣候狀況，如溫度、降雨量等是影響病原菌發(fā)生的主要因素。另外，該省不同地區(qū)鐮孢菌的群落結(jié)構(gòu)也存在一定的差異，擬輪枝鐮孢菌廣泛分布于山東省各個(gè)玉米生產(chǎn)區(qū)，而層出鐮孢菌主要分布于魯東和魯中地區(qū)，禾谷鐮孢復(fù)合種主要分布在魯西南地區(qū)，這可能與各個(gè)不同地區(qū)的栽培制度、氣候環(huán)境條件及栽培品種等各種不可控因素有關(guān)。

由系統(tǒng)發(fā)育分析可知，Ⅰ群和Ⅱ群間的遺傳距離為0.002～0.016，菌株間的遺傳距離較小，隨著時(shí)間的推移各個(gè)菌株間遺傳距離有所變化但分化程度較低。Chulze等[31]對(duì)輪枝鐮孢玉米分離群體的研究表明其同質(zhì)化趨勢(shì)較高，分析認(rèn)為這可能與其試驗(yàn)中所獲得的分離物來(lái)自單一玉米品種(Pioneer 32K61)有關(guān)[32]。以2017年為例，農(nóng)業(yè)部全國(guó)農(nóng)技推廣中心統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2017年山東省種植面積超過(guò)13萬(wàn)hm2的品種有6個(gè)，其中“類958”品種(登海605、先玉335)共67萬(wàn)hm2，“類335”品種(鄭單958、浚單20、偉科702、隆平206)共117萬(wàn)hm2，目前，“類958”和“類335”品種的選育和推廣造成主栽品種同質(zhì)化嚴(yán)重，遺傳基礎(chǔ)狹窄，使病原菌保持了一定遺傳上的穩(wěn)定性，這是引起輪枝鐮孢遺傳距離較小的主要原因。另一方面，本試驗(yàn)將2017年分離的5個(gè)河北省擬輪枝鐮孢菌株與山東省2015-2017年的菌株進(jìn)行了分析比較，發(fā)現(xiàn)雖然河北省的5個(gè)菌株與山東省菌株遺傳距離較小，但仍可以獲得不同的遺傳組群，同一地區(qū)分離物不能完全聚為一群，而不同地區(qū)的一些分離物又具有極高遺傳相似性，這是由于擬輪枝鐮孢具有多種傳播途徑，其中一種傳播方式是通過(guò)種子攜帶，隨玉米材料在不同育種地域以及從制種基地向生產(chǎn)區(qū)域的傳播，使得擬輪枝鐮孢在不同地域間得到了廣泛的種群和基因交流。同時(shí)可以以風(fēng)為媒介傳播，從地理位置上分析，河北和山東省接壤，臨近渤海和黃海，且我國(guó)處在東亞季風(fēng)氣候區(qū)，夏季由東南向西北刮東南風(fēng)，而冬季由西北向東南刮西北風(fēng)，這有利于擬輪枝鐮孢菌的孢子隨著季風(fēng)進(jìn)行雙向傳遞交流，導(dǎo)致了兩省份間存在較頻繁的基因交流，使不同地理來(lái)源的菌株基因趨于一致，并繼而在不同基因類型和不同生態(tài)區(qū)玉米品種的選擇下繼續(xù)病菌基因的選擇變異。

通過(guò)對(duì)山東省玉米穗腐病的研究，明確了擬輪枝鐮孢菌為山東省的優(yōu)勢(shì)病原菌，并且在山東省3 a間穩(wěn)定存在，且山東省和河北省擬輪枝鐮孢菌存在基因交流，此后山東省應(yīng)加強(qiáng)種子檢疫工作，積極培育抗病品種，減少病原菌的人為傳播，玉米穗腐病的防治重點(diǎn)應(yīng)以擬輪枝鐮孢菌為主，研究其對(duì)玉米穗腐病的循環(huán)侵染規(guī)律，為穗腐病的病害防治提供理論依據(jù)。