山羊CPT1A基因的克隆表達(dá)及肌內(nèi)脂肪含量的相關(guān)性分析

梁計峻，林亞秋，俞雨陽，王 永,2，朱江江

(1.西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.青藏高原動物遺傳資源保護(hù)與利用四川省重點實驗室，四川 成都 610041；3.青藏高原動物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點實驗室，四川 成都 610041)

隨著人們生活水平的提高，羊肉因為口感極佳，低膽固醇且營養(yǎng)豐富，需求量越來越大，對質(zhì)量要求也逐漸升高。肌內(nèi)脂肪(Intramuscular fat,IMF)是山羊肉質(zhì)的重要影響因素，與肉的嫩度、風(fēng)味、多汁性等性狀緊密相關(guān)[1-3]。羊肉IMF的沉積受多種因素影響，其中研究基因調(diào)控機理是改善山羊肌內(nèi)脂肪沉積的重要途徑之一[4]。

肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶(Carnitine palmitoyltransferase, CPT) 有CPT1和CPT2之分。其中，CPT1是脂肪分解代謝的關(guān)鍵酶，它位于線粒體外膜，催化長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)移到肉毒堿上，繼而從胞漿進(jìn)到線粒體內(nèi)，并在線粒體內(nèi)膜上被CPT2催化進(jìn)行β氧化[5-9]，因此，CPT1也是脂肪酸β氧化過程中的限速酶。在哺乳動物中，CPT1一般存在3種亞型基因(CPT1A、CPT1B、CPT1C)，編碼于不同的染色體上[10]。在真核生物的脂肪酸代謝過程中，CPT1A是長鏈脂肪酸由胞漿轉(zhuǎn)移到線粒體氧化供能的關(guān)鍵限速酶。Robitaille等[11]發(fā)現(xiàn)CPT1與人體脂肪沉積有密切聯(lián)系。Morash等[12]發(fā)現(xiàn)CPT1影響虹鱒魚體內(nèi)肌肉和肝臟中的脂肪分布。Olpin等[13]發(fā)現(xiàn)CPT1表達(dá)水平與人體脂含量相關(guān)。除骨骼肌細(xì)胞和棕色脂肪細(xì)胞外，CPT1A在全身各組織中廣泛表達(dá)，且高表達(dá)于肝臟[14-15]，而肝臟是脂肪代謝的重要場所。這些研究說明，CPT1對機體脂質(zhì)代謝具有重要作用。CPT1A和CPT1B的基因序列具有高相似性，然而兩者在動力學(xué)上的差異決定了其功能與組織分布不同[16]。CPT1A比CPT1B對肉毒堿的親和力更高，且對CPT抑制劑丙二酰CoA的敏感性更低，這種特性受機體調(diào)節(jié)[10,17-18]。因此，CPT1A在更高水平上調(diào)節(jié)體內(nèi)脂肪酸的氧化，并對生命機體的正?；顒影l(fā)揮著重要的作用[19]。

目前，山羊CPT1A僅見于預(yù)測序列，于寶莉等[17]系統(tǒng)分析了山羊和綿羊CPT1A組織表達(dá)，但未揭示CPT1A基因與山羊IMF含量的關(guān)系。此外，目前還沒有對山羊CPT1A基因克隆表達(dá)模式的相關(guān)研究。因此，本研究以我國著名的肉用山羊新品種-簡州大耳羊為研究對象，克隆CPT1A基因CDS區(qū)序列，并對序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，闡明其在不同組織中的表達(dá)情況并構(gòu)建組織表達(dá)譜，同時檢測CPT1A在山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)模式，分析CPT1A背最長肌、股二頭肌、臂三頭肌中的表達(dá)水平與IMF沉積作用機理。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 主要試劑 I-5TM2×High-Fidelity Master Mix、pclone007 blunt simple載體購自MCLAB(美國)，DH5α感受態(tài)細(xì)胞、gDNAse購自天根生化科技有限公司(中國北京)，TRIzol、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自Thermo公司(美國)，Gel Extraction Kit購自QIAGEN公司(德國)，QuantiFastTMSYBR Green PCR Kit、LA Taq購自TaKaRa公司(中國大連)，質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen公司(美國)，乙醇、氯仿等試劑均為國產(chǎn)生化試劑。

1.1.2 試驗動物及取材 選取7只一周歲的健康簡州大耳羊。清晨空腹屠宰后，迅速采集心、肝、脾、肺、腎、背最長肌、股二頭肌、臂三頭肌、皮下脂肪和腹間脂肪組織樣品，DEPC水清洗后用錫箔紙包裹，迅速裝入冷凍管中置于液氮保存，利用TRIzol法提取組織總RNA，根據(jù)Thermo反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行cDNA合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 山羊CPT1A基因的克隆 根據(jù)GenBank上牛(NM_001304989.1)、山羊(XM_018043311.1)CPT1A基因的保守序列，利用Primer premier 5.0設(shè)計克隆引物(表1)。PCR反應(yīng)體系為：肝cDNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，I-5TM2×High-Fidelity Master Mix 12.5 μL，加水補至25 μL。PCR反應(yīng)條件：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，59 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 4 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，將25 μL擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，將目的片段切膠回收，用回收產(chǎn)物連接擎科pclone007載體后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性菌落經(jīng)菌液PCR鑒定，提取質(zhì)粒送成都擎科偉業(yè)梓熙公司測序。

1.2.2 測序分析 利用EXpASy在線工具對CPT1A蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進(jìn)行分析；利用SignalP 4.1 Server對氨基信號肽進(jìn)行分析；利用BioXM 2.6對山羊、綿羊(NM_001009414.1)、牛(NM_001304989.1)、人(NM_001031847.2)、小鼠(NM_013495.2)、豬(NM_001129805.1)氨基酸進(jìn)行同源性比較；利用TMHMM預(yù)測跨膜域結(jié)構(gòu)；利用GOR IV在線軟件預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)；并利用PHYRE2在線工具對氨基酸三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測比對；利用LocTree3在線工具對蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位；利用ScanProsite在線工具分析蛋白結(jié)構(gòu)域；利用STRING交互式數(shù)據(jù)庫分析蛋白互作；利用Mega 5.05軟件進(jìn)行CPT1A基因物種進(jìn)化樹分析。

1.2.3 山羊前體脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)以及RNA提取 選擇3只7日齡的羊羔作為試驗動物，根據(jù)李倩等[20]的方法進(jìn)行山羊前體脂肪細(xì)胞的提取以及培養(yǎng)，在F3細(xì)胞長至80%融合時，在培養(yǎng)基中加入100 μmol/L油酸誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行分化。分別收集分化0，1，2，3，4，5，6，9 d的細(xì)胞。利用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，用Thermo反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA。

1.2.4 實時定量PCR檢測組織和細(xì)胞分化時序表達(dá) 根據(jù)獲得的山羊CPT1A基因(MH345735)序列為模板，使用Primer premier 5.0軟件設(shè)計目的基因的熒光特異性引物。設(shè)計的定量引物先經(jīng)過PCR擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳驗證其特異性。利用實時熒光定量PCR儀測定mRNA表達(dá)水平。RT-qPCR反應(yīng)體系：上、下游引物各 1 μL，cDNA 1 μL，SYBR 10 μL，水 7 μL。定量程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，40個循環(huán)。溶解曲線95 ℃ 10 s,然后以0.5 ℃/5 s的速度從65 ℃ 升到95 ℃ 。每個品種設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)，每個待測樣本設(shè)3個技術(shù)重復(fù)。根據(jù)Bonnet等[21]、許晴等[22]的內(nèi)參基因篩選結(jié)果選擇泛表達(dá)轉(zhuǎn)錄子(UXT)作為試驗的內(nèi)參基因。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 試驗數(shù)據(jù)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。定量數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行歸一化處理。通過SPSS 22.0軟件中顯著性對各組織和前體脂肪細(xì)胞間的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行顯著性分析，利用Duncan法進(jìn)行多重比較。采用雙尾檢驗對IMF含量與CPT1A基因表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析，計算皮爾遜相關(guān)系數(shù)。

表1 基因引物序列Tab.1 Primer for cloning and quantitative Real-time PCR(qRCR)

注： F.正義鏈引物; R.反義鏈引物;UXT.泛表達(dá)轉(zhuǎn)錄子基因。

Note：F.Sense primer; R.Antisense primer;UXT.Ubiquitously-expressed transcript gene.

2 結(jié)果與分析

2.1 山羊CPT1A基因的克隆及序列分析

以簡州大耳羊肝組織cDNA為模板通過PCR得到的山羊CPT1A基因2 380 bp，其中CDS區(qū)全長2 319 bp，5′UTR 38 bp和3′UTR 23 bp序列，編碼氨基酸773個，獲得山羊基因登錄號為MH345735。

2.2 山羊CPT1A基因生物信息學(xué)分析

山羊CPT1A蛋白分子式為C3991H6153N1067O1125S35，分子質(zhì)量為88.204 33 ku，理論等電點為8.82。CPT1A蛋白含量最高的是亮氨酸和絲氨酸，不穩(wěn)定系數(shù)為34.97，為穩(wěn)定型蛋白。脂溶系數(shù)為81.50，總平均親水性-0.253，為親水性蛋白。山羊CPT1A蛋白具有2個跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域，為Trp62～Lle84、Val104～Leu126，沒有信號肽結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)功能域預(yù)測顯示，Leu171～Tyr186 和Arg451～Ala478存在2個保守性結(jié)構(gòu)域。CPT1A蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示， 氨基酸26.26%可能形成α-螺旋,26.13%可能形成 β-折疊，47.61%可能形成無規(guī)則卷曲(圖1)。為了研究山羊CPT1A基因的進(jìn)化過程，本試驗對山羊CPT1A基因與綿羊(NM_001009414.1)、牛(NM_001304989.2)、豬(NM_001129805.1)、狗(NM_001286860.1)、人(NM_001031847.2)、小鼠(NM_013495.2)7種動物進(jìn)行了核苷酸和氨基酸同源性分析。結(jié)果顯示，核苷酸同源性分別是99%，97%，81%，81%，81%，81%，均大于80%；氨基酸序列同源性分別為99.0%，98.0%，90.0%，90.0%，89.0%和86.0%(圖2)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果顯示，在第171-186位，451-478位氨基酸殘基處各有一段CPT家族保守區(qū)。利用亞細(xì)胞定位軟件分析發(fā)現(xiàn)CPT1A蛋白主要在線粒體外膜上發(fā)揮生物功能。運用STRING數(shù)據(jù)庫搜索CPT1A蛋白潛在互作蛋白，顯示該蛋白可能與長鏈脂酰輔酶A合成酶家族(ACSLs)、長鏈脂肪酸-輔酶A連接酶家族(ACSBGs)、CPT2以及線粒體肉毒堿/?；鈮A載體蛋白(SCL25A20)存在相互作用(圖3)。同時采用Mega 5.05軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖4，綿羊與山羊CPT1A基因親緣度最高，依次是牛、豬、人，而與小鼠的親緣關(guān)系最低。CPT1A蛋白在山羊、綿羊、牛、人、豬等物種間具有較高的相似度。

圖1 不同物種間CPT1A蛋白三級結(jié)構(gòu)對比Fig.1 Structure comparison of CPT1A protein among various species

ACSL1.長鏈脂酰輔酶A連接酶1；ACSL3.長鏈脂酰輔酶A連接酶3；ACSL4.長鏈脂酰輔酶A連接酶4；ACSL5.長鏈脂酰輔酶A連接酶5；ACSL6.長鏈脂酰輔酶A連接酶6；ACSBG1.長鏈脂肪酸-輔酶A合成酶1；ACSBG2.長鏈脂肪酸-輔酶A合成酶2；SLC25A20.線粒體肉毒堿/?；鈮A載體蛋白；CPT2.肉堿棕櫚酸轉(zhuǎn)移酶2；HSD17B4.過氧化物酶體多功能酶2型。

ACSL1.Long-chain-fatty-acid-CoA ligase 1；ACSL3.Long-chain-fatty-acid-CoA ligase 3；ACSL4.Long-chain-fatty-acid-CoA ligase 4；ACSL5.Long-chain-fatty-acid-CoA ligase 5；ACSL6.Long-chain-fatty-acid-CoA ligase 6；ACSBG1.Acyl-CoA synthetase bubblegum family member 1；ACSBG2.Acyl-CoA synthetase bubblegum family member 2；SLC25A20.Carnitine-acylcarnitine translocase；CPT2.Carnitine palmityl transferase 2；HSD17B4.Peroxisomal multifunctional enzyme type 2.

圖3 山羊CPT1A蛋白相作的蛋白預(yù)測
Fig.3 Prediction of proteins interactingwith goat CPT1A protein

圖4 CPT1A氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree constructed based on CPT1A amino acid

2.3 山羊CPT1A基因組織定量分析

以UXT為內(nèi)參對照，RT-qPCR檢測CPT1A在山羊不同組織中均有表達(dá)，mRNA表達(dá)水平具有顯著差異。CPT1A在肝臟中表達(dá)量最高，腎臟次之，兩者都極顯著高于其他組織(P<0.01)，而在其他組織中表達(dá)量差異不顯著(圖5)。

2.4 山羊CPT1A基因在肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞時序表達(dá)

以UXT為內(nèi)參，0 d的表達(dá)水平為對照，研究CPT1A基因在山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示(圖6)，CPT1A基因表達(dá)水平在誘導(dǎo)分化0～5 d逐漸升高并在第5天達(dá)到最高(P<0.01)，隨后相對表達(dá)量呈逐漸下降趨勢。

2.5 山羊CPT1A mRNA基因與IMF相關(guān)性

由俞雨陽等[23]測定的IMF數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，簡州大耳羊3種肌肉組織中IMF含量差異不顯著，背最長肌和股二頭肌的IMF含量略微高于臂三頭肌。CPT1A表達(dá)量與IMF含量相關(guān)性分析結(jié)果顯示，3種肌肉組織中CPT1A表達(dá)量都與IMF沉積呈正相關(guān)，股二頭肌中CPT1A表達(dá)量與IMF沉積呈顯著相關(guān)(P<0.05)，其中背最長肌和臂三頭肌中CPT1A表達(dá)量與IMF沉積呈極顯著相關(guān)(P<0.01)(表2)。

1.心；2.肝；3.脾；4.肺；5.腎；6.背最長肌；7.股二頭肌；8.臂三頭肌；9.皮下脂肪；10.腹間脂肪。不同大寫字母顯示表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖6同。

1. Heart; 2.Liver; 3.Spleen; 4.Lung; 5.Kidney; 6.Longissimus dorsi muscle; 7.Biceps femoris; 8.Triceps muscle of arm; 9.Subcutaneous fat; 10.Abdominal fat. Different capitals indicate extremely significant differences (P<0.01), different lowercases indicate significant differences (P<0.05). The same as Fig.6.

圖5 簡州大耳羊CPT1A基因在不同組織中的表達(dá)水平
Fig.5 Expression levels of goatCPT1Agene in different tissues

圖6 CPT1A基因在山羊前體脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)Fig.6 The expression levels of CPT1A gene during goat intramuscular preadipocyte differentiation

組織Tissue相關(guān)系數(shù)Correlation coefficientP值P value背最長肌 Longissimus dorsi muscle0.9340.002股二頭肌 Biceps femoris0.8130.049臂三頭肌 Triceps muscle of arm0.9350.006

3 結(jié)論與討論

IMF含量是影響肉質(zhì)的重要指標(biāo)，研究山羊脂質(zhì)代謝基因調(diào)控機理對IMF含量影響具有重要的現(xiàn)實意義。目前，已經(jīng)有很多關(guān)于脂代謝相關(guān)基因的研究報道[24]，然而關(guān)于山羊CPT1A基因調(diào)控IMF沉積的相關(guān)研究還未見報道，而基因序列的缺乏和組織表達(dá)信息的不完善阻礙了對其功能的進(jìn)一步研究。簡州大耳羊是我國第2個肉用山羊培訓(xùn)新品種，其肌內(nèi)脂肪含量顯著高于其他山羊品種[25]，然而關(guān)于IMF沉積具體調(diào)控機理尚不清楚。

為了確定簡州大耳羊CPT1A基因的組織表達(dá)譜，采用RT-qPCR對簡州大耳羊各組織進(jìn)行mRNA定量分析。在內(nèi)參選擇上，根據(jù)Bonnet等[21]的內(nèi)參篩選結(jié)果，UXT、EIF3K、RPLPO、TBP為穩(wěn)定的內(nèi)參基因，許晴等[22]的內(nèi)參基因篩選結(jié)果顯示，UXT、PPIB在前體脂肪細(xì)胞中表達(dá)穩(wěn)定，綜合考慮選用UXT作為本試驗的內(nèi)參基因。組織定量結(jié)果顯示，CPT1A廣泛存在于簡州大耳羊各組織中，且在肝臟和腎臟中其表達(dá)量顯著高于其他組織。楊家大[26]研究發(fā)現(xiàn)，在黔北麻羊腎臟中CPT1AmRNA水平表達(dá)量最高，而在貴州黑山羊和南江黃羊中肝臟表達(dá)量最高，這與試驗存在相似之處。于寶莉等[17]在絨山羊的試驗結(jié)果中，CPT1A在脾臟、肝臟表達(dá)量較高與本試驗研究結(jié)果存在相似之處，而肌肉組織表達(dá)量較高也存在著不同之處。余秀鋒等[27]的研究發(fā)現(xiàn)，CPT1基因在肉質(zhì)型金華豬背最長肌的表達(dá)量高于瘦肉型長白豬，長白豬皮下脂肪的CPT1AmRNA水平相對于金華豬在30 d的最高，隨著在日齡升高而降低。可見不同品種間CPT1A的表達(dá)水平差異較大，這可能是造成本試驗結(jié)果與絨山羊表達(dá)差異的原因。

本研究細(xì)胞誘導(dǎo)分化后的CPT1A表達(dá)量都比分化前高，其中從0～5 d呈上升趨勢并在第5天達(dá)到最高，隨后相對表達(dá)量開始下降，這與張艷芳[28]的研究結(jié)果一致。Bartelds等[29]也發(fā)現(xiàn)CPT1A基因表達(dá)在羔羊出生后短暫增加，這說明基因的表達(dá)可能與機體生長階段有關(guān)，本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究CPT1在分化過程中不同階段的功能研究提供了參考。

簡州大耳羊IMF沉積與CPT1A表達(dá)量的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)3種肌肉組織的IMF沉積量都與CPT1A表達(dá)量呈顯著正相關(guān)，其中背最長肌和臂三頭肌IMF含量與CPT1A表達(dá)量極顯著相關(guān)(P<0.01)，表明CPT1A可能是IMF沉積的候選基因。而Liu等[30]研究發(fā)現(xiàn)，在孵化時快速生長的雞中，IMF含量與CPT1A呈負(fù)相關(guān)。Qiu等[31]在雞中也發(fā)現(xiàn)CPT1A負(fù)調(diào)節(jié)IMF含量。在雞中，較低的脂代謝可能促進(jìn)IMF沉積。而張艷芳[28]研究發(fā)現(xiàn)，在金華豬和長白豬中CPT1的表達(dá)與IMF沉積呈正相關(guān)。Zhang等[32]發(fā)現(xiàn)，CPT1A在金華豬背最長肌內(nèi)中與肌內(nèi)脂肪含量呈顯著正相關(guān)。綜上所述，CPT1A表達(dá)量在哺乳動物肌肉組織中可能與IMF呈正相關(guān)。IMF沉積是一個復(fù)雜的機制，需要進(jìn)行后續(xù)的試驗探究，且本試驗做了7只簡州大耳羊分析，樣本量不足，IMF測定結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)差較大，CPT1A在肌肉組織中表達(dá)量并不顯著。后續(xù)試驗擬打算擴大山羊樣本量，完善IMF數(shù)據(jù)。設(shè)計并合成CPT1A基因干擾SiRNA，干擾體外培養(yǎng)肌內(nèi)脂肪細(xì)胞，進(jìn)一步深入研究CPT1A基因在山羊IMF沉積中的作用機理。

本研究成功獲得簡州大耳羊CPT1A基因的cDNA序列，包括CDS區(qū)2 319 bp，編碼773個氨基酸殘基(MH345735)。CPT1A基因序列具有較高的物種保守性，并廣泛表達(dá)于山羊各組織中，且在山羊肝和腎中具有最高的表達(dá)水平，而在肌肉、脂肪組織表達(dá)量較低。CPT1A基因的表達(dá)水平隨著前體脂肪細(xì)胞的分化而先升高后下降，3種肌肉組織中mRNA表達(dá)水平與IMF含量顯著正相關(guān)。本試驗研究結(jié)果表明，CPT1A基因可能參與山羊肌內(nèi)脂肪沉積和前體脂肪分化，為進(jìn)一步探究CPT1A基因在山羊肌肉生長中的作用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。