高效液相色譜法測定半胱胺螯合鋅的含量

張倩云 趙威 徐振興 吳月敏 姜燕萍 盧立志 李浙烽 徐二華

（1，杭州康德權(quán)飼料有限公司，包膜飼料添加劑省級重點(diǎn)企業(yè)研究院 311107；2，浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 320021）

半胱胺螯合鋅是一種新型的飼料添加劑[1]，分子式為[H2NCH2CH2S]2Zn[2]，分子量為217.68，該產(chǎn)品具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、生物學(xué)效價高、適口性好，降低環(huán)境污染等優(yōu)勢，半胱胺螯合鋅的合成與在豬上面的生產(chǎn)應(yīng)用有文獻(xiàn)報道[1，2]，但沒有含量檢測方法的報道，本研究建立了高效液相色譜法測定半胱胺螯合鋅含量的方法，為半胱胺螯合鋅質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立和產(chǎn)品質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

賽默飛U3000 高效液相色譜儀（備有紫外檢測器），變色龍6.8 色譜工作站。

半胱胺鹽酸鹽對照品（sigma，批號WXBC1602V），半胱胺螯合鋅樣品為杭州康德權(quán)飼料有限公司提供，批號為181226，190108，190110。

2 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

色譜柱：Agela Technologies，Venusil MP C18 （ 4.6 ×150mm，5um）；流動相：乙腈：0.017mol/L 庚烷磺酸鈉溶液（取1.7g 庚烷磺酸鈉置于500ml 量瓶中，加入0.1mlH3PO4，然后用純水稀釋并定容至刻度）=15:85，進(jìn)樣量5ul，檢測波長214nm；流速1ml/min。此色譜條件下，由半胱胺鹽酸鹽對照品溶液和供試品溶液分析可知，出峰時間一致，均為4.0min，且溶劑無干擾。

在上述色譜條件下分別取對照品溶液、供試品溶液和溶劑溶液各5ul 進(jìn)樣分析，結(jié)果表明，理論板數(shù)按半胱胺計(jì)算不低于4000，色譜峰分離度良好，對照品、樣品和溶劑色譜圖見圖1。

3 方法與結(jié)果

3.1 溶液制備

對照品溶液：精密稱取對照品半胱胺鹽酸鹽1.5g，置100ml 量瓶中，加超純水約20ml 溶解，用超純水定容至刻度，搖勻，制每1ml 約含半胱胺10mg 的對照品溶液。

供試品溶液：稱取樣品約0.5g，精密稱定，置于100ml 容量瓶中，加鹽酸1+1 溶液0.5ml，加超純水約50ml，置于100℃沸水浴中水浴20min，取出放冷至室溫，加超純水定容至刻度，搖勻，備用。

溶劑溶液：取鹽酸1+1 溶液0.5ml，加超純水約50ml，置于100ml 量瓶中，加超純水定容至刻度。

3.2 線性關(guān)系考察

圖1 對照品（A）、樣品（B）、溶劑（C）液相色譜圖

分別精密量取半胱胺鹽酸鹽對照品溶液0.30，0.50，1.00，2.00，3.00ml，分別置10ml 量瓶中，加超純水溶解并定容至刻度，搖勻，分別得半胱胺濃度為0.306，0.510，1.021，2.042，3.063mg/ml 的溶液，分別進(jìn)樣5ul 測定。以對照品溶液濃度（X，mg/ml）為橫坐標(biāo)，以對照品峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，半胱胺回歸曲線方程為：Y=10.739X+0.3834 r2=0.9999，半胱胺在0.306～3.063mg/ml 范圍內(nèi)，與峰面積成良好線性關(guān)系。

3.3 精密度試驗(yàn)

取對照品溶液在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，峰面積的RSD 結(jié)果為：0.89%。

3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號的半胱胺螯合鋅6 份，批號為190110，每份取粉末約0.5g，精密稱定，按3.1 項(xiàng)下的方法操作。在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，計(jì)算半胱胺螯合鋅的平均含量為26.26%，RSD 為0.43%，重復(fù)性良好。

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，室溫下放置，分別于0，2，4，6，8，12h，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，計(jì)算半胱胺螯合鋅峰面積的RSD 為0.50%，結(jié)果表明，供試品溶液在12h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.6 回收率試驗(yàn)

取已知含量的半胱胺螯合鋅9 份，批號為190110，每份取粉末約0.5g，精密稱定，分別精密加入低、中、高3 種濃度的對照品溶液，同上法操作，在上述色譜條件下分析，計(jì)算平均回收率。加樣回收率測定結(jié)果見表1。

3.7 樣品測定

精密稱取半胱胺螯合鋅樣品約0.5g，置于100ml 量瓶中，按3.1 項(xiàng)下的方法操作，在上述色譜條件下對3 批次半胱胺螯合鋅進(jìn)行分析，計(jì)算含量，結(jié)果見表2。

3.8 檢出限與定量限

取半胱胺鹽酸鹽對照品適量，加超純水溶解并稀釋制成一系列濃度的溶液，取5ul 注入液相色譜儀，測得半胱胺鹽酸鹽（以半胱胺螯合鋅計(jì)算）最小檢出限為0.15ng （S/N≥3），定量限為0.45ng （S/N≥10）。

4 討論

4.1 流動相和波長的選擇

半胱胺螯合鋅中的活性物質(zhì)為半胱胺，國家標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)于飼料添加劑半胱胺鹽酸鹽的測定[3]，采用液相色譜法，故首先按照國家標(biāo)準(zhǔn)的流動相配置和儀器參數(shù)設(shè)置，測定半胱胺螯合鋅的樣品時，加50%甲醇水溶解，上機(jī)測定，在與對照品溶液主峰的保留時間相同的位置上，樣品也出峰，說明半胱胺活性成分被檢出。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 25%半胱胺螯合鋅含量測定結(jié)果（n=3）

4.2 溶劑的選擇

樣品溶劑首先選用的是國標(biāo)要求的50%甲醇水，初始的3～5 個樣品峰型比較對稱，但峰面積不穩(wěn)定，忽高忽低，且隨著樣品重復(fù)進(jìn)樣數(shù)量加大，主峰色譜圖會形成嚴(yán)重的前延或拖尾峰，無法對主成分半胱胺進(jìn)行定性定量，可能的原因?yàn)榘腚装夫箱\直接溶于水后形成動態(tài)的解離，導(dǎo)致色譜柱分離效果變差。為了解決樣品動態(tài)解離問題，將溶解樣品的溶劑改成純水，并加入稍微過量的鹽酸1+1 溶液，使得樣品溶液為弱酸性，防止半胱胺螯合鋅的逆解離，影響色譜峰的面積和峰型，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)，加入0.5ml 鹽酸1+1 溶液作為溶劑的樣品色譜圖峰型峰面積均穩(wěn)定。

半胱胺鹽酸鹽的檢測目前有液相法，碘液滴定法[4]，本文獻(xiàn)研究物質(zhì)為半胱胺螯合鋅，該方法檢測活性物質(zhì)半胱胺，在酸性條件下經(jīng)過解離成為半胱胺后，用半胱胺鹽酸鹽作為對照品測定含量。本研究建立了高效液相色譜法測定半胱胺螯合鋅的分析方法，使用的溶劑為水和鹽酸1+1 溶液，方法快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可為半胱胺螯合鋅的質(zhì)量控制方法。