大孔樹(shù)脂純化甜茶葉總黃酮及其純化前后的抗氧化性

吳婕 吳學(xué)慧 徐高

摘要：通過(guò)對(duì)比聚酰胺、DM-130、LSA-40、DHP-600與FL-1等5種大孔樹(shù)脂的靜態(tài)“吸附-解吸”性能，篩選出最適合甜茶葉總黃酮分離純化的大孔樹(shù)脂，并對(duì)其動(dòng)態(tài)純化工藝條件進(jìn)行探討。結(jié)果表明，最適大孔樹(shù)脂的動(dòng)態(tài)“吸附-解吸”參數(shù)如下：上樣液質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL，上樣液體積為60 mL，上樣液pH值為5.0，上樣流速為 2 BV/h，洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，洗脫劑用量為70 mL，洗脫流速為2 BV/h。在此優(yōu)化條件下，得到甜茶葉總黃酮的純度為39.6%。并且在抗氧化研究中，純化后的甜茶葉總黃酮對(duì)2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）自由基的抗氧化能力半抑制濃度（IC50值）由108.7 μg/mL降低到77.6 μg/mL。由結(jié)果可知，甜茶葉總黃酮經(jīng)過(guò)FL-1大孔樹(shù)脂的純化，能夠提高抗氧化能力，因此，它具有很好的醫(yī)藥保健品生產(chǎn)前景。

關(guān)鍵詞：甜茶葉;總黃酮;FL-1大孔樹(shù)脂;抗氧化性

中圖分類號(hào)： R284 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）16-0190-04

收稿日期：2018-09-12

基金項(xiàng)目：赤水河流域環(huán)境保護(hù)與山地農(nóng)業(yè)發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心開(kāi)放基金（編號(hào)：遵師協(xié)同創(chuàng)新[2018]06）。

作者簡(jiǎn)介：吳 婕（1982—），女，貴州銅仁人，碩士，副教授，主要從事天然產(chǎn)物研究。Tel：（0856）5238982;

甜茶葉，別稱傘花八仙葉，其味微甜，屬于薔薇科懸鉤子屬多年生多刺灌木，主要分布在廣西、廣東、湖南、貴州、江西等地[1]。甜茶葉既可入茶，亦可入藥，被稱為“神茶”。甜茶葉富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和微量元素，如生物類黃酮、氨基酸、鍶、維生素B1、B2、B3、超氧化物歧化酶等。其中，黃酮類化合物可以降低血脂和膽固醇，也有抗炎和抗氧化作用[2-4]。因此分離純化甜茶葉總黃酮，對(duì)于提高甜茶葉總黃酮的工業(yè)生產(chǎn)價(jià)值有重要意義。

在分離純化植物活性成分的方法中，大孔樹(shù)脂因具有成本低、無(wú)污染、操作簡(jiǎn)單、選擇性好、可再生等優(yōu)點(diǎn)而備受人們關(guān)注[5-7]，但是用大孔樹(shù)脂分離純化甜茶葉總黃酮的研究卻鮮有報(bào)道。本研究以甜茶葉總黃酮的吸附量、吸附率與解吸率為考察指標(biāo)，比較5種大孔樹(shù)脂對(duì)總黃酮的“吸附-解吸”性能，篩選出最適宜分離純化甜茶葉總黃酮的大孔樹(shù)脂，并且通過(guò)大孔樹(shù)脂的動(dòng)態(tài)“吸附-解吸”試驗(yàn)，得到最適合大孔樹(shù)脂分離純化甜茶葉總黃酮的優(yōu)化工藝參數(shù)。通過(guò)抗氧化性試驗(yàn)，表明優(yōu)化條件下大孔樹(shù)脂純化甜茶葉總黃酮的抗氧化能力得到了較大提高。研究結(jié)果可為工業(yè)化生產(chǎn)甜茶葉總黃酮提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甜茶葉，貴州健康茶科技有限公司;聚酰胺（60～100目），滄州寶恩吸附材料有限公司;DHP-600、FL-1型樹(shù)脂，天津歐瑞生物科技有限公司;DM-130、LSA-40型樹(shù)脂，鄭州勤實(shí)科技有限公司;蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品（分析純），合肥博美生物有限公司;乙醇、氫氧化鈉、鹽酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

UV2300分光計(jì)，上海天美科學(xué)儀器有限公司;KL04A型離心機(jī)，湖南凱達(dá)公司;XT120A型電子天平，瑞士普利賽斯公司;FZ102微型植物粉碎機(jī)，上海書培實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;SHA-B恒溫振蕩儀，金壇市富華儀器有限公司。

1.2 黃酮含量的測(cè)定

采用NaNO2-Al（NO3）3顯色法測(cè)定黃酮含量。精確配制濃度為0.202 mg/mL的蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別在25 mL容量瓶中加入0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加蒸餾水至總體積為6.0 mL;加入1.0 mL 5% NaNO2溶液，搖勻靜置10 min后，加入1.0 mL 10% Al（NO3）3溶液，搖勻靜置10 min后，加入10.0 mL 4% NaOH溶液，用蒸餾水定容至刻度處，搖勻靜置20 min。在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制總黃酮質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=6.749 9x-0.030 4（r2=0.999 7）。

1.3 大孔樹(shù)脂吸附量、吸附率、解吸率及甜茶葉總黃酮純度的計(jì)算

大孔樹(shù)脂的吸附量、吸附率、解吸率及甜茶葉總黃酮純度的計(jì)算公式如下：

H=（CⅠ-CⅡ）×VⅠ/MⅠ;（1）

P=（CⅠ-CⅡ）/CⅠ×100%;（2）

Q=CⅢ×VⅡ/[（CⅠ-CⅡ）×VⅠ]×100%;（3）

L=（CⅢ×VⅡ）/MⅡ×100%。（4）

式中：H為吸附量，mg/g;P為吸附率，%;Q為解吸率，%;L為純度，%;CⅠ、CⅡ、CⅢ分別為初始、吸附平衡、解吸平衡的甜茶葉總黃酮的質(zhì)量濃度，mg/mL;VⅠ、VⅡ分別為上樣液甜茶葉總黃酮體積、解吸液乙醇體積，mL;MⅠ為大孔樹(shù)脂的干質(zhì)量，g;MⅡ?yàn)榇罂讟?shù)脂純化后旋干物質(zhì)的質(zhì)量，g。

1.4 粗制甜茶葉總黃酮的方法

采用超聲輔助浸提甜茶葉總黃酮技術(shù)，提取條件如下：超聲波功率為120 W，提取時(shí)間為30 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%，液料比為15 mL ∶1 g，提取溫度為60 ℃，提取次數(shù)為2次，離心（1 800 r/min、15～20 min），取上清液，濃縮，旋干，得到粗制的甜茶葉總黃酮，備用。

1.5 大孔樹(shù)脂的活化

用無(wú)水乙醇將大孔樹(shù)脂浸泡24 h，再用蒸餾水洗去醇溶性雜質(zhì)至無(wú)醇味，然后用4% HCl溶液浸泡4 h，再用蒸餾水沖洗酸溶性雜質(zhì)至中性，然后用4% NaOH溶液浸泡4 h，最后用蒸餾水沖洗堿溶性雜質(zhì)至中性，備用。

1.6 大孔樹(shù)脂對(duì)甜茶葉總黃酮靜態(tài)“吸附-解吸”性能的研究

在室溫下，稱取2.0 g大孔樹(shù)脂于具塞三角瓶中，加入粗制的甜茶葉總黃酮溶液（濃度為0.93 mg/mL;體積為 80 mL），振蕩24 h，測(cè)定吸附平衡后的甜茶葉總黃酮質(zhì)量濃度。將吸附平衡后的大孔樹(shù)脂先用蒸餾水沖洗至無(wú)色，再加入80 mL無(wú)水乙醇解吸液，振蕩24 h，測(cè)定大孔樹(shù)脂解吸后的甜茶葉總黃酮質(zhì)量濃度。根據(jù)“1.3”節(jié)中的公式計(jì)算大孔樹(shù)脂的吸附量、吸附率和解吸率，篩選出最合適純化甜茶葉總黃酮的大孔樹(shù)脂。

1.7 FL-1大孔樹(shù)脂對(duì)甜茶葉總黃酮的動(dòng)態(tài)“吸附-解吸”性能研究

大孔樹(shù)脂在吸附過(guò)程中，除了本身的物理化學(xué)性質(zhì)以外，上樣液質(zhì)量濃度、上樣液pH值及上樣流速都是影響大孔樹(shù)脂純化效果的重要因素。在室溫下，用濕法將20 mL活化的FL-1大孔樹(shù)脂裝入層析柱（半徑×高=10 mm×400 mm）中，考察甜茶葉總黃酮的上樣液質(zhì)量濃度（1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL）、上樣液pH值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）、上樣流速（1、2、3 BV/h）與不同上樣體積對(duì)FL-1大孔樹(shù)脂吸附率的影響;此外，考察洗脫液乙醇的體積分?jǐn)?shù)（50%、60%、70%、80%）及洗脫液體積對(duì)FL-1大孔樹(shù)脂解吸率的影響。

1.7.1 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)FL-1大孔樹(shù)脂吸附率的影響 為了使加入的甜茶葉總黃酮的量相等，分別設(shè)pH值為5.0，上樣液體積為80、40、26.7、20 mL，質(zhì)量濃度為1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL，以2 BV/h的流速加入FL-1大孔樹(shù)脂柱中。收集流出液并測(cè)定總黃酮的質(zhì)量濃度，得出FL-1大孔樹(shù)脂對(duì)不同質(zhì)量濃度總黃酮的吸附率。

1.7.2 上樣液pH值對(duì)FL-1大孔樹(shù)脂吸附率的影響 取100 mL上樣液，甜茶葉總黃酮質(zhì)量濃度為2 mg/mL，pH值分別設(shè)為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，以2 BV/h的流速加入FL-1大孔樹(shù)脂柱中，收集流出液并測(cè)定總黃酮的質(zhì)量濃度，考察甜茶葉總黃酮溶液pH值對(duì)大孔樹(shù)脂吸附率的影響。

1.7.3 上樣液流速對(duì)FL-1樹(shù)脂吸附率的影響 取80 mL甜茶葉總黃酮上樣液，質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL，pH值為5.0，分別以1、2、3 BV/h的流速加入FL-1大孔樹(shù)脂柱中，按 5 mL/管收集流出液并測(cè)定總黃酮的質(zhì)量濃度，直至流出液的質(zhì)量濃度是原上樣液質(zhì)量濃度的1/10，繪制不同流速對(duì)應(yīng)的FL-1大孔樹(shù)脂柱動(dòng)態(tài)吸附穿透曲線，找出泄漏點(diǎn)，得到最適宜的上樣流速和上樣體積。

1.7.4 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)FL-1大孔樹(shù)脂解吸性能的影響 ?向吸附飽和的FL-1大孔樹(shù)脂柱中，以3 BV/h的洗脫流速，加入60 mL體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，測(cè)定總黃酮的質(zhì)量濃度，得到不同體積分?jǐn)?shù)洗脫劑的解吸率。

1.7.5 洗脫流速和洗脫劑體積對(duì)FL-1大孔樹(shù)脂解吸性能的影響 向吸附甜茶葉總黃酮的飽和FL-1大孔樹(shù)脂柱中，加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，分別以1、2、3 BV/h的流速進(jìn)行洗脫。按10 mL/管收集洗脫液，測(cè)定洗脫液的總黃酮質(zhì)量濃度，計(jì)算FL-1大孔樹(shù)脂柱在不同洗脫速度下的動(dòng)態(tài)解吸率，確定最佳洗脫流速和洗脫液用量。

1.8 FL-1大孔樹(shù)脂純化工藝的驗(yàn)證

得到粗制的甜茶葉總黃酮溶液（pH值為5.0，濃度為 2.0 mg/mL，體積為60 mL）后，設(shè)上樣流速為2 BV/h，加入 20 mL FL-1大孔樹(shù)脂層析柱（半徑×高=10 mm×400 mm）中，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，收集流出液，計(jì)算吸附率。當(dāng)FL-1大孔樹(shù)脂柱吸附平衡后，按照2 BV/h的洗脫速度，加入70 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，收集流出液，計(jì)算解吸率。進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，取均值，驗(yàn)證FL-1大孔樹(shù)脂純化甜茶葉總黃酮的可行性及穩(wěn)定性。

1.9 粗制和純化的甜茶葉總黃酮對(duì)2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）自由基的抗氧化性

將粗制和純化的甜茶葉總黃酮配制成不同質(zhì)量濃度的待測(cè)液，同時(shí)以維生素C作為參比。參考林戀竹等的方法[7]，測(cè)定它們對(duì)ABTS自由基的清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹(shù)脂的靜態(tài)“吸附-解吸”試驗(yàn)

大孔樹(shù)脂的空間結(jié)構(gòu)、極性和粒徑?jīng)Q定其對(duì)活性成分的“吸附-解吸”性能。由表1可以看出，在相同條件下，5種大孔樹(shù)脂對(duì)甜茶葉總黃酮都有一定的“吸附-解吸”能力，其靜態(tài)吸附能力排序?yàn)镕L-1>聚酰胺（60～100目）>HPD-600>LSA-40>DM-130;其靜態(tài)解吸能力排序?yàn)镠PD-600>FL-1>LSA-40>DM-130>聚酰胺（60～100目）。綜合考慮吸附率和解吸率，F(xiàn)L-1大孔樹(shù)脂是純化甜茶葉總黃酮較為理想的樹(shù)脂。

2.2 FL-1大孔樹(shù)脂的動(dòng)態(tài)“吸附-解吸”性能研究

2.2.1 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)FL-1大孔樹(shù)脂吸附率的影響 由圖1可知，當(dāng)上樣液濃度為1.0 mg/mL時(shí)，F(xiàn)L-1大孔樹(shù)脂的吸附率達(dá)到最大值93%。當(dāng)上樣液的質(zhì)量濃度為1.0～2.0 mg/mL 時(shí)，F(xiàn)L-1大孔樹(shù)脂的吸附率隨著上樣液質(zhì)量濃度的增加而緩慢降低，若繼續(xù)增加上樣液質(zhì)量濃度，其吸附率迅速降低。這是由于在等溫條件下，當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度較低時(shí)，黃酮類化合物與樹(shù)脂接觸得越充分，大孔樹(shù)脂的吸附率越高，但是吸附量較小;當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度過(guò)大時(shí)，受到大孔樹(shù)脂吸附容量和孔容的影響，導(dǎo)致大孔樹(shù)脂吸附量、吸附率均減小?？紤]到上樣液質(zhì)量濃度過(guò)低會(huì)導(dǎo)致吸附量太小，純化效率不高，而上樣液質(zhì)量濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致大孔樹(shù)脂吸附不充分，浪費(fèi)原料。因此，甜茶葉總黃酮的上樣液質(zhì)量濃度選擇 2.0 mg/mL 為共宜。

2.2.2 上樣液pH值對(duì)FL-1大孔樹(shù)脂吸附率的影響 如圖2所示，F(xiàn)L-1大孔樹(shù)脂對(duì)甜茶葉總黃酮的吸附率隨著上樣溶液pH值的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)pH值為5.0時(shí)，甜茶葉總黃酮的吸附率達(dá)到最大值89%，這是因?yàn)楫?dāng)上樣溶液pH值為5.0時(shí)，溶液中的黃酮類化合物主要以分子形式存在，有利于FL-1大孔樹(shù)脂的吸附。若上樣溶液pH值較小，黃酮分子易形成“徉鹽”;若上樣溶液pH值較大，黃酮類化合物以離子狀態(tài)存在，都不利于FL-1大孔樹(shù)脂對(duì)甜茶葉總黃酮發(fā)生物理吸附作用。因此，甜茶葉總黃酮上樣液的pH值為5.0時(shí)較適宜。

2.2.3 上樣液流速和上樣體積的確定 由圖3可知，甜茶葉總黃酮的上樣流速越快，滲漏點(diǎn)也出現(xiàn)得越早。當(dāng)上樣流速為1 BV/h時(shí)，上樣體積約為80 mL時(shí)出現(xiàn)泄露點(diǎn);當(dāng)上樣流速為2 BV/h時(shí)，上樣體積約為60 mL時(shí)出現(xiàn)泄漏點(diǎn);當(dāng)上樣流速為3 BV/h時(shí)，上樣體積約為30 mL時(shí)就出現(xiàn)了泄漏點(diǎn)。因?yàn)榇罂讟?shù)脂的吸附過(guò)程主要是活性成分在大孔樹(shù)脂的膜擴(kuò)散和粒擴(kuò)散的過(guò)程[8]，上樣流速越快，甜茶葉黃酮類化合物與大孔樹(shù)脂接觸的時(shí)間越短，它們還沒(méi)有來(lái)得及被吸附到樹(shù)脂表面或孔內(nèi)就流出樹(shù)脂柱。所以，在上樣液質(zhì)量濃度相同的情況下，當(dāng)上樣流速為3 BV/h時(shí)，F(xiàn)L-1大孔樹(shù)脂柱對(duì)甜茶葉總黃酮的吸附量小，吸附率較低;當(dāng)上樣流速為1 BV/h時(shí)，F(xiàn)L-1大孔樹(shù)脂柱對(duì)甜茶葉總黃酮的吸附量和吸附率相對(duì)較高。然而，在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中，上樣流速過(guò)慢會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)效率低，因此選擇上樣流速為2 BV/h較好，并且在此條件下的最佳上樣體積為60 mL。

2.2.4 不同體積分?jǐn)?shù)的洗脫劑對(duì)FL-1大孔樹(shù)脂洗脫效果的影響 由圖4可知，隨著洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，甜茶葉總黃酮的洗脫率先提高后略有降低。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%～70%時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)越大，它對(duì)甜茶葉黃酮類化合物的解吸率也越高;當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，甜茶葉總黃酮的解吸率為83%;當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，甜茶葉總黃酮的解吸率為85%。但是與體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇得到的洗脫率相比，體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇得到的解吸率提高得較慢。這是因?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)越大，洗脫劑的極性越弱，較小極性的黃酮類化合物更加容易被洗脫[9];但是當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)大時(shí)，醇溶性雜質(zhì)會(huì)增多，它們會(huì)與甜茶葉黃酮類化合物形成競(jìng)爭(zhēng)，使甜茶葉黃酮類化合物與乙醇-水分子結(jié)合的可能性下降，導(dǎo)致甜茶葉總黃酮解吸率降低。綜合考慮，乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)以70%為宜。

2.2.5 洗脫劑流速及洗脫體積的確定 由圖5可知，隨著洗脫液流速的增加，洗脫出的甜茶葉總黃酮的質(zhì)量濃度形成的峰形越寬，并且拖尾現(xiàn)象越明顯，洗脫體積也越大;但是洗脫流速太小會(huì)導(dǎo)致洗脫時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，工業(yè)生產(chǎn)效率低。綜合考慮，最佳洗脫流速為2 BV/h，最佳洗脫體積用量為70 mL。

2.3 FL-1大孔樹(shù)脂純化工藝的驗(yàn)證

由表2可知，F(xiàn)L-1大孔樹(shù)脂對(duì)甜茶葉總黃酮的吸附、解吸和純化的性能較好，其吸附量、解吸率、解吸后的純度分別為41.7 mg/g、81.5%、39.6%。因此可見(jiàn)，在工業(yè)生產(chǎn)中 FL-1大孔樹(shù)脂純化甜茶葉總黃酮具有操作上的可行性。

2.4 純化前后的甜茶葉總黃酮對(duì)ABTS自由基清除能力的比較

ABTS·是由強(qiáng)氧化劑與ABTS鹽反應(yīng)制備的，其氧化還原電勢(shì)較低，可以通過(guò)電子傳遞（ET）反應(yīng)機(jī)制或者通過(guò)氫原子轉(zhuǎn)移（HAT）機(jī)制使自由基失去活性，從而導(dǎo)致體系綠色減退[9]。由圖6可以看出，純化前后的甜茶葉總黃酮對(duì)ABTS自由基均具有一定的清除能力，并且清除率與總黃酮的質(zhì)量濃度有較強(qiáng)的正相關(guān)性（r2=0.97）;當(dāng)甜茶葉總黃酮質(zhì)量濃度相同時(shí)，純化后的總黃酮清除能力更接近維生素C，純化后的總黃酮對(duì)ABTS自由基清除的半抑制濃度（IC50值）由1087 μg/mL降至77.6 μg/mL。由此可見(jiàn)，F(xiàn)L-1純化的甜茶葉總黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

3 結(jié)論

通過(guò)靜態(tài)“吸附-解吸”試驗(yàn)，篩選出最適用于甜茶葉總黃酮分離純化的FL-1大孔樹(shù)脂。在動(dòng)態(tài)“吸附-解吸”試驗(yàn)中，得到FL-1大孔樹(shù)脂優(yōu)化甜茶葉總黃酮的純化工藝參數(shù)：上樣液質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL，上樣液體積為60 mL，上樣液pH值為5，上樣流速為2 BV/h;洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，洗脫劑用量為70 mL，洗脫流速為2 BV/h。在此條件下，得到甜茶葉總黃酮的純度為39.6%。在抗氧化性研究中，當(dāng)甜茶葉總黃酮質(zhì)量濃度相同時(shí)，純化后的總黃酮對(duì)ABTS自由基清除的IC50由108.7 μg/mL降至77.6 μg/mL，用FL-1純化的甜茶葉總黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化能力。綜合分析可知，F(xiàn)L-1大孔樹(shù)脂分離純化甜茶葉總黃酮的純化效率高，純化后的總黃酮更具有商業(yè)價(jià)值。

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