基于表達(dá)譜芯片探索地五養(yǎng)肝膠囊防治肝癌的生物信息分析*

王明剛 陳 乞 高 翔 葉之華 肖明中 李瀚旻,△

1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院 (湖北 武漢, 430065) 2.湖北省中醫(yī)院 3.湖北省中醫(yī)藥研究院

原發(fā)性肝癌(PLC)是我國常見惡性腫瘤，肝細(xì)胞癌(HCC)是其主要類別，在全部惡性腫瘤中順位死亡率中已上升至第2位，占全球PLC死亡率的51%左右[1, 2]。在我國HBV感染相關(guān)HCC占絕大部分?？紤]到龐大的HBsAg陽性感染率，肝癌人口標(biāo)化率(中標(biāo)率)呈逐步上升趨勢(shì)[3]?？傮w上看HCC具備發(fā)病隱匿、高發(fā)病率、高死亡率、高年增率的特性，是學(xué)術(shù)界公認(rèn)的重大疑難疾病[4]。

如何切實(shí)有效地提高肝癌臨床治療效果是學(xué)術(shù)界面臨的巨大挑戰(zhàn)，中醫(yī)肝病專家李瀚旻教授提出 “髓失生肝”的肝癌病理機(jī)制，形成“補(bǔ)腎生髓成肝”防治肝癌的治療法則[5]。凝練為地五養(yǎng)肝膠囊(由熟地、五味子、姜黃、茵陳、甘草等組成)這一經(jīng)典方藥，臨床研究證實(shí)地五養(yǎng)肝膠囊能顯著降低肝硬化發(fā)生率，改善肝再生微環(huán)境，降低肝癌發(fā)生率和肝癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[6]。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)該方能影響JAK/STAT、Ras/Raf/Mek/Erk信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)，抑制骨髓干細(xì)胞轉(zhuǎn)化肝癌干細(xì)胞，促進(jìn)肝細(xì)胞再生修復(fù)，改善肝再生微環(huán)境而抑制肝癌發(fā)生發(fā)展[5]。為深入探索地五養(yǎng)肝膠囊防治肝癌的分子機(jī)制，構(gòu)建地五養(yǎng)肝膠囊防治肝癌的生物信息網(wǎng)絡(luò)，本研究將采用Solt-Farber二步法構(gòu)建肝癌大鼠模型，地五養(yǎng)肝膠囊干預(yù)治療，收集肝癌組織，采用表達(dá)譜芯片檢測(cè)，提取mRNA差異表達(dá)信息進(jìn)行生物信息學(xué)綜合分析，為深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 4～5周齡SD雄性大鼠，SPF級(jí)，體重(150±50)g，由湖北省疾病預(yù)防控制中心提供；二乙基亞硝胺(DEN)及二乙酰氨基芴(2-AAF) 購于sigma公司，地五養(yǎng)肝膠囊(批號(hào)：鄂藥制藥字Z20113160)由湖北省中醫(yī)院肝病研究所提供。

1.2 造模方法 雄性SPF級(jí)SD大鼠，48只，4-5周齡，體重(150±50)g。大鼠按隨機(jī)數(shù)字法分為空白對(duì)照組(Normal)、模型組(Model)、地五養(yǎng)肝治療組(DWYG)每組16只。造模第1天，模型組與地五養(yǎng)肝治療組按50mg/kg的劑量一次性腹腔注射二乙基亞硝胺(DEN)作為啟動(dòng)劑，2周后均按15mg/kg/d劑量予以二乙酰氨基芴(2-AAF)灌胃7天，第3周末行2/3肝部分切除術(shù)(PHx)，切除肝左葉和中葉。地五養(yǎng)肝治療組于造模期間按750mg/kg/d劑量給予地五養(yǎng)肝膠囊水溶液灌胃、空白對(duì)照組則給予等量生理鹽水灌胃對(duì)照。

1.3 標(biāo)本收集與芯片檢測(cè) 成模后地五養(yǎng)肝膠囊中藥干預(yù)16周，16周后即時(shí)處死各組大鼠，取腫瘤組織，Trizol法提取總RNA，測(cè)定RNA濃度，全部芯片檢測(cè)樣本均質(zhì)量控制合格，使用Arraystar RNA Flash Labeling Kit對(duì)樣本進(jìn)行標(biāo)記，使用Agilent SureHyb進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)。使用Agilent GeneSpring GX v12.1進(jìn)行芯片標(biāo)準(zhǔn)化操作，挑選差異表達(dá)的mRNAs。topGO軟件對(duì)差異mRNAs進(jìn)行GO分析與PATHWAY分析。

2 結(jié)果

2.1 地五養(yǎng)肝膠囊可影響大鼠肝癌組織多個(gè)mRNA表達(dá) 以Fold Change>2，P<0.05為條件進(jìn)行差異mRNA篩選，與模型組比較地五養(yǎng)肝膠囊下調(diào)481個(gè)大鼠mRNA表達(dá)，上調(diào)236個(gè)mRNA表達(dá)，差異表達(dá)聚類熱圖如下。

2.2 地五養(yǎng)肝膠囊調(diào)控的差異mRNA GO分析

2.2.1 地五養(yǎng)肝膠囊下調(diào)的mRNA GO分析 對(duì)地五養(yǎng)肝膠囊下調(diào)的481個(gè)mRNA進(jìn)行GO分析，在生物學(xué)過程中可影響細(xì)胞損傷反應(yīng)(化學(xué)應(yīng)激)、細(xì)胞組織發(fā)育過程，循環(huán)系統(tǒng)(微血管育)發(fā)育等過程；在細(xì)胞組份中可影響細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外囊泡、細(xì)胞外膜結(jié)合、膜結(jié)合囊泡；生物學(xué)功能可影響蛋白質(zhì)結(jié)合、鈣離子結(jié)合、細(xì)胞粘附分子結(jié)合、生長因子結(jié)合、蛋白質(zhì)同二聚體活性等功能。見表1。

2.2.2 地五養(yǎng)肝膠囊上調(diào)的mRNA GO分析 對(duì)地五養(yǎng)肝膠囊上調(diào)的236個(gè)mRNA表達(dá)進(jìn)行GO分析，在生物學(xué)過程中可影響細(xì)胞間粘附、細(xì)胞內(nèi)受體信號(hào)通路、類固醇激素反應(yīng)、有機(jī)環(huán)狀化合物反應(yīng)等過程，在細(xì)胞組份中可影響離子通道復(fù)合體、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體、突觸膜、質(zhì)膜區(qū)等細(xì)胞組份。在分子功能中可影響金屬離子結(jié)合、序列特異性DNA結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性，配體激活序列特異性DNA結(jié)合、類固醇激素受體等分子生物功能。見表2。

2.3 地五養(yǎng)肝膠囊調(diào)控的差異mRNA PATHWAY分析

2.3.1 地五養(yǎng)肝膠囊下調(diào)的mRNA PATHWAY分析 地五養(yǎng)肝膠囊下調(diào)的481個(gè)mRNA進(jìn)行PATHWAY分析，發(fā)現(xiàn)其可影響緊密連接信號(hào)途徑、造血細(xì)胞功能途徑、膽汁分泌信號(hào)通路、肌動(dòng)蛋骨架調(diào)節(jié)通路、ECM受體相互作用通路、細(xì)胞因子-受體相互作用通路等。見圖1。

圖1 地五養(yǎng)肝膠囊下調(diào)的mRNA PATHWAY分析

2.3.2 地五養(yǎng)肝膠囊上調(diào)的mRNA PATHWAY分析 地五養(yǎng)肝膠囊下調(diào)的236個(gè)mRNA進(jìn)行PATHWAY分析，發(fā)現(xiàn)其可影響癌癥轉(zhuǎn)錄失調(diào)信號(hào)通路、GnRH信號(hào)通路、糖酵解/糖異生信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號(hào)通路、TRP通道炎癥介質(zhì)調(diào)控信號(hào)通路等。見圖2。

圖1 地五養(yǎng)肝膠囊上調(diào)的mRNA PATHWAY分析

3 討論

長期以來，肝癌的防治策略多集中在腫瘤細(xì)胞本身，外科手術(shù)切除、放療、化療均以有效清除或殺死腫瘤細(xì)胞為目標(biāo)，隨著對(duì)肝癌防治水平未見實(shí)質(zhì)性提高的反思及對(duì)發(fā)病機(jī)制復(fù)雜性的深入認(rèn)識(shí)，近年來在對(duì)肝癌發(fā)病機(jī)制及防治策略上逐步由著眼肝癌細(xì)胞本身向肝癌微環(huán)境方向轉(zhuǎn)變，已形成新的肝癌防治策略[7]。肝癌微環(huán)境指非肝癌細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)所共同構(gòu)成的復(fù)雜混合物，從類別上區(qū)分，HCC微環(huán)境主要包括了纖維化微環(huán)境、血管微環(huán)境、免疫微環(huán)境、氧化微環(huán)境和干細(xì)胞微環(huán)境等。 這些微環(huán)境之間存在相互關(guān)聯(lián)、相互影響的復(fù)雜關(guān)系[8]，但難以形成關(guān)鍵概念來統(tǒng)籌這些微環(huán)境的根本落腳點(diǎn)。肝病專家李翰旻教授提出肝癌異常肝再生微環(huán)境的基本概念[7,9]，認(rèn)為HCC的發(fā)生與發(fā)展其本質(zhì)是異常肝再生微環(huán)境的形成與維持過程，各種肝癌微環(huán)境可與肝再生異常微環(huán)境產(chǎn)生直接或間接的復(fù)雜影響關(guān)系，并提出基于“補(bǔ)腎生髓成肝”的中醫(yī)藥改善肝再生微環(huán)境防治HCC的治療新策略，充分發(fā)揮中醫(yī)藥防治肝癌的多次層、多時(shí)限、整體、動(dòng)態(tài)調(diào)控的療效優(yōu)勢(shì)[10]。

表1 地五養(yǎng)肝膠囊下調(diào)的mRNA GO分析

地五養(yǎng)肝膠囊正是在“補(bǔ)腎生髓成肝”防治肝癌理論指導(dǎo)下形成的有效中藥制劑，方中熟地滋陰補(bǔ)腎，五味子柔肝補(bǔ)腎，兩藥相合增強(qiáng)補(bǔ)腎之功；茵陳清熱利濕而退黃，姜黃活血化瘀而通絡(luò)，生甘草清熱解毒。甘草與五味子清熱養(yǎng)陰、酸甘化陰，全方共奏補(bǔ)腎養(yǎng)肝、利濕退黃、活血通絡(luò)之效。前期研究已經(jīng)證實(shí)該方具有防治肝癌發(fā)生與發(fā)展的臨床治療效果，本研究構(gòu)建了大鼠肝癌模型，地五養(yǎng)肝膠囊進(jìn)行干預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)該方可上調(diào)肝癌組織236個(gè)mRNA表達(dá)，下調(diào)481個(gè)mRNA表達(dá)，體現(xiàn)出該方存在的多層次、多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮療效機(jī)制的可能。在對(duì)地五養(yǎng)肝膠囊下調(diào)的481個(gè)mRNA進(jìn)行GO分析中發(fā)現(xiàn)，該方可影響細(xì)胞損傷反應(yīng)(化學(xué)應(yīng)激)、循環(huán)系統(tǒng)(微血管)發(fā)育過程；影響細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外囊泡、細(xì)胞外膜結(jié)合等細(xì)胞組份；影響蛋白質(zhì)結(jié)合、鈣離子結(jié)合、細(xì)胞粘附分子結(jié)合、生長因子結(jié)合等功能。在對(duì)地五養(yǎng)肝膠囊上調(diào)的236個(gè)mRNA表達(dá)進(jìn)行GO分析，在生物學(xué)過程中可影響細(xì)胞間粘附、細(xì)胞內(nèi)受體信號(hào)通路、類固醇激素反應(yīng)、有機(jī)環(huán)狀化合物反應(yīng)等過程，在細(xì)胞組份中可影響離子通道復(fù)合體、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體、突觸膜、質(zhì)膜區(qū)等細(xì)胞組份。在分子功能中可影響金屬離子結(jié)合、序列特異性DNA結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性，配體激活序列特異性DNA結(jié)合、類固醇激素受體等分子生物功能。綜合分析，地五養(yǎng)肝膠囊可調(diào)控細(xì)胞損傷反應(yīng)、循環(huán)系統(tǒng)(微血管)發(fā)育過程這可能與阻斷肝臟腫瘤惡性增生及微血管新生存在關(guān)聯(lián)，并且可影響腫瘤組織細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞外囊泡傳遞等細(xì)胞組份及細(xì)胞間交流方式。

地五養(yǎng)肝膠囊下調(diào)的481個(gè)mRNA進(jìn)行PATHWAY分析，發(fā)現(xiàn)其可影響緊密連接信號(hào)途徑、造血細(xì)胞功能途徑、膽汁分泌信號(hào)通路、肌動(dòng)蛋白骨架調(diào)節(jié)通路、ECM受體相互作用通路、細(xì)胞因子-受體相互作用通路等相關(guān)。地五養(yǎng)肝膠囊下調(diào)的236個(gè)mRNA進(jìn)行PATHWAY分析，發(fā)現(xiàn)其可影響癌癥轉(zhuǎn)錄失調(diào)信號(hào)通路、GnRH信號(hào)通路、糖酵解/糖異生信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號(hào)通路、TRP通道炎癥介質(zhì)調(diào)控信號(hào)通路等。這些信號(hào)通路均與肝癌的發(fā)生與發(fā)展、侵襲與轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，深入探索地五養(yǎng)肝膠囊通過影響以上信號(hào)途徑發(fā)揮的療效機(jī)制有重要現(xiàn)實(shí)意義。