李 瑩 葉永安 李志國 張露丹 楊先照
1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院 (北京, 100700) 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)肝病研究所
肝癌是一種高發(fā)病率、高死亡率的惡性腫瘤,數(shù)據(jù)顯示,2014年我國肝癌新發(fā)病例約36.5萬例,死亡病例約31.9萬例[1]。盡管乙肝疫苗免疫接種及早期篩查等相關(guān)一、二級預(yù)防在我國已初見成效,但人口增長和老齡化加劇導(dǎo)致肝癌新發(fā)及死亡病例數(shù)量大幅增加。肝癌帶來的疾病負擔(dān)已成為危害我國人群健康的重要因素之一。此外,由于肝癌具有癥狀出現(xiàn)較晚、病情進展迅速、手術(shù)復(fù)發(fā)率高等特點,使得肝癌的有效治療成為亟待解決的難題。這些都迫切要求肝癌的臨床治療及相關(guān)基礎(chǔ)研究戰(zhàn)略前移,因此,開展肝癌前病變的研究具有非常重要的現(xiàn)實意義。
肝癌前病變,是一種具有細胞不典型性和分化異常的增生性病變,是良性病變向惡性病變過渡的移行階段,有高度惡變風(fēng)險[2, 3],如能阻斷其病理進程,則可有效預(yù)防肝癌發(fā)生??估w抑癌方是葉永安教授多年來防治肝癌前病變的臨床經(jīng)驗方,前期研究已證實該方可通過調(diào)控整合素α5β1信號通路改善大鼠肝臟纖維堆積及肝細胞異常增生[4, 5]。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K /Akt) 信號通路是整合素α5β1下游重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,在肝纖維化、肝硬化及肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用,但在肝癌前病變的研究中未見報道。本研究觀察了抗纖抑癌方對肝癌前病變大鼠PI3K/Akt信號通路的影響,探討其治療肝癌前病變的可能作用機制。
1.1 材料
1.1.1 動物 SPF級雄性10周齡Wistar大鼠85只,體重(180±20)g,由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供,許可證編號:SCXK(京)2016-0006,飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院屏障環(huán)境動物實驗室。實驗動物購買、飼養(yǎng)方案報經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院實驗動物倫理委員會許可。
1.1.2 藥品 抗纖抑癌方顆粒劑,由柴胡、黃芪、山藥、白芥子等藥物組成[培力(南寧)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)];復(fù)方鱉甲軟肝片(內(nèi)蒙古福瑞中蒙藥科技股份有限公司生產(chǎn),批號:Z19991011);二乙基亞硝胺(美國Sigma公司,貨號:N0756)。
1.1.3 試劑與儀器 Anti-GSTP1(bs-2735R,北京博奧森生物技術(shù)有限公司),PI3K p85抗體(#4292,美國CST公司),Phospho-PI3K p85 (Tyr458)/p55 (Tyr199) 抗體(#4228,美國CST公司),Akt抗體(#9272,美國CST公司),Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP Rabbit mAb(#4060,美國CST公司),GAPDH(ab9485,英國Abcam公司);兔SP試劑盒(SP-9001,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),DAB顯色試劑盒(DA1010,北京索萊寶科技有限公司),Trizol試劑盒(15596026,美國Invitrogen公司),PCR引物(上海生工生物工程有限公司),M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(M1701,美國Promega公司),Real-timePCR擴增試劑盒(北京中原領(lǐng)先科技有限公司),Agarose(V2111,美國Promega公司),DEPC(D5758,美國Sigma公司),Real-Time PCR儀(7500,美國ABI公司),4℃低溫高速離心機(SORVALL Stratos,美國Thermo公司),核酸蛋白測定儀(BioPhotometer,德國Eppendorf公司),蛋白電泳槽(1658001,美國Bio-Rad公司),半干轉(zhuǎn)印槽(1703940,美國Bio-Rad公司)。
1.2 方法
1.2.1 分組與模型制備 按照Excel隨機數(shù)字表法隨機分為正常組10只,模型組、抗纖抑癌低、中、高劑量組及鱉甲軟肝組每組各15只。正常組大鼠按0.4ml/l00g劑量給予生理鹽水腹腔注射,其余各組大鼠按50mg/kg劑量予二乙基亞硝胺腹腔注射制備肝癌前病變模型,每周1次,共14周。
1.2.2 給藥 第9周起,正常組和模型組大鼠給予蒸餾水灌胃,抗纖抑癌低、中、高劑量組分別予臨床劑量4、7、14倍的抗纖抑癌方灌胃,鱉甲軟肝組予臨床劑量7倍的復(fù)方鱉甲軟肝片灌胃,每次用藥體積均為1ml/l00g,每天1次,連續(xù)給藥6周。
1.2.3 取材 各組大鼠在實驗第14周末取材。在末次給藥24h后,配置10%水合氯醛溶液按照0.33ml/100g腹腔注射麻醉,開腹,于肝臟最大葉、距邊緣約1cm的部位切取肝組織置于4%多聚甲醛中固定,另取肝組織快速置于液氮中以備Western blot、實時熒光定量PCR檢測用。
1.2.4 檢測指標及方法
1.2.4.1 免疫組化法檢測大鼠肝組織中胎盤型谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST-Pi)的表達 取出固定好的標本,進行常規(guī)流程石蠟包埋,制成切片;脫蠟至水,PBS沖洗3min×3次;置抗原修復(fù)液中煮沸15min,PBS沖洗5min×2次;滴加3%過氧化氫一滴,室溫孵育10min,PBS沖洗3min;加山羊血清封閉液一滴,放入濕盒內(nèi),室溫10min;甩掉封閉液,滴加一抗(稀釋度1:150)蓋住組織,放入濕盒內(nèi)4℃過夜;加二抗50μl,室溫孵育10min,PBS沖洗3min×3次;滴加一滴鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液,室溫孵育10min,PBS沖洗3min×3次;DAB顯色,顯微鏡下控制染色;蘇木素復(fù)染,1~2min,細胞核變藍色即可終止,自來水沖洗反藍;常規(guī)脫水、透明、封片。顯微鏡下觀察陽性細胞分布,陽性信號為胞漿被染成棕黃色,每組隨機選取6張切片,每張切片取5個視野拍照,運用圖像分析軟件Image-Pro Plus6.0測量平均光密度(MOD),取5個視野平均值代表每張切片的MOD值。
1.2.4.2 實時熒光定量PCR法檢測大鼠肝臟組織中PI3K、Akt mRNA的表達 采用Trizol試劑提取總RNA,核酸紫外分光光度計測定經(jīng)稀釋的RNA提取物的OD值和濃度,判斷RNA純度,計算RNA濃度;用二步法進行mRNA表達的檢測;按反轉(zhuǎn)錄按試劑盒說明書操作,取5μl總RNA,在反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV和引物oligo(dT)15條件下進行反轉(zhuǎn)錄,得到cDNA鏈;以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR反應(yīng),反應(yīng)體系為20μl,含2μlcDNA,10pmol/μl上下游引物各0.5μl,SYBRmix10μl,不足的體積以無RNA酶的水補齊;以GAPDH作為內(nèi)參照,循環(huán)參數(shù):預(yù)變性94℃×10min,變性94℃×15s,退火60℃×60s,延伸72℃×10min,共45個循環(huán)。所得Ct值按照2-△△Ct法均一化處理后進行統(tǒng)計。引物序列見表1。
表1 實時熒光定量PCR引物序列
1.2.4.3 Western blot法檢測大鼠肝臟組織中PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt蛋白的表達 將肝臟組織加蛋白裂解液進行勻漿裂解,按蛋白抽提試劑盒說明書提取總蛋白,Bradford法定量;把蛋白樣品分裝到離心管中,并加入上樣緩沖液,沸水煮5min,4℃放置;制備12%SDS-PAGE分離膠和5%濃縮膠,各取5μl蛋白樣品進行上樣,電泳4~5h,轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,然后用5%脫脂牛奶封閉,分別加入一抗(稀釋度1∶1000),4℃孵育過夜,TBST沖洗5~10min,反復(fù)3次,加入辣根過氧化酶標記的山羊抗兔IgG(稀釋度1∶5000),室溫孵育60min,洗去未結(jié)合的二抗,滴加化學(xué)發(fā)光劑ECL進行發(fā)光顯影?;叶葤呙韬笥肐mageJ軟件分析條帶的灰度值,結(jié)果以各目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值的比值表示。
2.1 各組大鼠肝組織中GST-Pi的表達情況 GST-Pi陽性灶表現(xiàn)為圓形或不規(guī)則形棕黃色團塊,主要分布在細胞胞漿中。正常組(A)未見明顯陽性表達,模型組(B)可見多處位于匯管區(qū)周圍及肝小葉內(nèi)的陽性灶,且染色較深;與模型組相比,抗纖抑癌低、中劑量組(C、D)及鱉甲軟肝組(F)陽性表達面積減少,染色變淺;抗纖抑癌高劑量組(E)陽性表達面積則明顯減少,染色減輕。見插頁圖1。采用IPP軟件對其陽性表達MOD進行半定量分析,兩兩比較可見,模型組MOD值較正常組顯著升高(P<0.01),抗纖抑癌高劑量組MOD值較模型組顯著降低(P<0.05)。見圖2。
2.2 各組大鼠肝組織中PI3K、Akt mRNA的表達水平 見圖3。與正常組相比,模型組PI3K、Akt mRNA的表達顯著升高(P<0.01);與模型組相比,抗纖抑癌低、中、高劑量組及鱉甲軟肝組PI3K、Akt mRNA的表達均顯著降低(P<0.01);與鱉甲軟肝組相比,抗纖抑癌低劑量組PI3K、Akt mRNA的表達升高(P<0.01或P<0.05),抗纖抑癌高劑量組PI3K mRNA的表達顯著降低(P<0.05),抗纖抑癌高劑量組Akt mRNA的表達顯著降低,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
圖2.各組大鼠肝組織GST-Pi平均光密度(MOD)
注:與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01;與鱉甲軟肝組比較,△P<0.05,△△P<0.01。下圖同。
圖3 各組大鼠肝組織中PI3K、Akt mRNA達結(jié)果
2.3 各組大鼠肝組織中PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt蛋白的表達水平 見圖4。與正常組相比,模型組PI3K、p-PI3K及p-Akt蛋白的表達顯著升高(P<0.01);與模型組相比,抗纖抑癌低劑量組PI3K、p-PI3K蛋白表達顯著降低(P<0.01或P<0.05),抗纖抑癌中、高劑量組PI3K、p-PI3K及p-Akt蛋白的表達均顯著降低(P<0.01或P<0.05);與鱉甲軟肝組相比,抗纖抑癌高劑量組p-PI3K蛋白的表達顯著降低(P<0.05)。
圖4 各組大鼠肝組織PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt 蛋白表達結(jié)果
肝癌前病變的實質(zhì)是肝細胞異常增殖、分化及凋亡紊亂[6],是肝纖維化、肝硬化進展為肝癌的重要階段[7]。預(yù)防及阻斷肝癌前病變的發(fā)生、發(fā)展,逐漸成為當前肝癌防治工作的重點。目前,在肝癌前病變的治療方面還沒有一個公認的療效確切的上市藥物,無論西醫(yī)還是中醫(yī)都處在同一條起跑線上,開展具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的中醫(yī)藥干預(yù)肝癌前病變研究具有重要戰(zhàn)略意義。抗纖抑癌方是葉永安教授治療肝癌前病變的經(jīng)驗方,由柴胡、黃芪、山藥、白芥子等藥物組成,具有調(diào)肝健脾、活血化痰之功,在臨床上取得了較好的療效。已完成的實驗研究證實,抗纖抑癌方可減輕肝癌前病變大鼠的肝細胞變性壞死、結(jié)締組織增生和肝細胞異型增生程度,降低 GST-Pi、PCNA、AFP的表達,抑制HSC活化,調(diào)控 MMP-1、 COX-2及 TIMP-1 表達,從而促進細胞外基質(zhì)降解、抑制腫瘤血管生成[8, 9]。
在肝癌前病變的研究中,GST-Pi是目前公認的癌前指標,在許多惡性腫瘤中均有不同程度地表達,特別是在癌前病變及分化較好的腫瘤中有著較高的表達[10]。由于大多數(shù)的異常增生結(jié)節(jié)中都高度表達此種酶,因此在實驗中被廣泛用作肝癌前病變的標志物。GST-Pi 陽性灶數(shù)目和面積在一定程度上反應(yīng)了癌細胞的增殖情況[11]。本研究中抗纖抑癌方干預(yù)組GST-Pi陽性灶數(shù)量及陽性表達面積明顯減少,表明抗纖抑癌方對肝細胞的異常增殖有抑制作用。
PI3K/Akt 信號通路在促進細胞增殖、抑制細胞凋亡等腫瘤形成過程中發(fā)揮重要作用[12],該通路抑制劑可顯著控制腫瘤血管生成和腫瘤細胞遷移[12, 13]。此外,PI3K/Akt的激活在肝纖維化、肝硬化及肝癌的行程中發(fā)揮重要作用,諸多研究將PI3K/Akt 信號通路作為治療慢性肝病的重要靶標。Wei等[14]研究發(fā)現(xiàn),積雪草酸通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt /mTOR信號傳導(dǎo)途徑可抑制肝星狀細胞活化和細胞外基質(zhì)合成,延緩CCL4 誘導(dǎo)的大鼠纖維化的形成。Ye等[15]通過體內(nèi)及體外實驗證實,鴉膽子素可抑制HCC增殖并誘導(dǎo)HCC凋亡,其機制與調(diào)控PI3K/Akt /mTOR信號通路相關(guān)。本研究顯示抗纖抑癌方可下調(diào)PI3K/Akt通路中相關(guān)mRNA及蛋白的表達,抑制PI3K及Akt的磷酸化,從而誘導(dǎo)異型細胞凋亡,進一步阻斷肝癌前病變的進展。
綜上所述,抗纖抑癌方對于大鼠的肝癌前病變具有抑制作用,其機制可能與調(diào)控PI3K /Akt 信號通路相關(guān)。本研究結(jié)果為抗纖抑癌方干預(yù)肝癌前病變作用機制的深入探討提供了一定的實驗依據(jù)。