蝸牛勻漿液直腸給藥對潰瘍性結腸炎大鼠的保護作用

范志源 余秋雨 李歡 蘇小嬌 盛艷梅

[摘要] 目的 探討蝸牛勻漿液直腸給藥對潰瘍性結腸炎大鼠是否具有保護作用。 方法 用冰醋酸誘導急性潰瘍性結腸炎大鼠模型，將40只6～7周齡的SPF級雄性SD大鼠采用隨機數(shù)字表法分為模型組、空白組、蝸牛勻漿液的高劑量組（1.0 g/kg）和低劑量組（0.5 g/kg），每組各10只。造模后，高、低劑量組連續(xù)直腸給予蝸牛勻漿液7 d，空白組與模型組均給予相同體積的生理鹽水。每日觀察大鼠的主要體征與糞便性狀，同時計算體重變化并進行糞便評分。實驗結束后，處死大鼠取目標結腸段，稱量計算腸重系數(shù)，同時采用HE染色法進行病理組織檢測。結果 與模型組比較，高劑量組和低劑量組大鼠體征明顯改善，大鼠體重增加程度更顯著（P < 0.05或P < 0.01），并且腸重系數(shù)顯著降低（P < 0.01），高劑量組給藥后第4天開始出現(xiàn)糞便評分顯著下降（P < 0.05或P < 0.01）。同時，高劑量組炎性細胞浸潤及炎癥細胞浸潤深度評分和潰瘍深度評分與模型組比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。 結論 蝸牛勻漿液對潰瘍性結腸炎模型大鼠可通過改善體征、增加體重、降低腹瀉、對抗結腸組織水腫及炎性反應等產(chǎn)生較好的保護作用，尤以高劑量組作用明顯。

[關鍵詞] 蝸牛勻漿液;潰瘍性結腸炎;直腸給藥;保護作用

[中圖分類號] R574.62? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）08（a）-0017-05

[Abstract] Objective To investigate whether snail homogenate has protective effect on ulcerative colitis in rats. Methods Rat model of acute Ulcerative Colitis induced by glacial acetic acid. Forty male Sprague-Dawley rats aged 6-7 weeks were randomly divided into model group， blank group， snail homogenate high （1.0 g/kg） and low （0.5 g/kg） dose groups according to random number table， with 10 rats in each group. After the model was completed， the high （1.0 g/kg） and low （0.5 g/kg） dose groups were given snail homogenate continuously for 7 days in the rectum， and the blank group and the model group were given the same volume of normal saline. The main signs and fecal traits of the rats were observed daily， and body weight changes were calculated and fecal scores were performed. At the end of the experiment， the rats were sacrificed and the target colon segment was taken. The coefficient of intestinal weight was calculated and the pathological tissue was detected by HE staining. Results Compared with model group， the symptoms in rats of high-dose group and low-dose group were significantly improved， the degree of weight gain of rats increased significantly （P < 0.05 or P < 0.01）， and intestinal weighting coefficient reduced significantly （P < 0.05 or P < 0.01）， a significant decrease in fecal scores of high-dose group began on day 4 after administration （P < 0.01）. Meanwhile， the scores of inflammatory cell infiltration depth and ulcer depth in the high-dose group were significantly different from those in the model group （P < 0.01）. Conclusion Snail homogenate can improve the physical signs， increase body weight， reduce diarrhea， and fight colonic hyperplasia and inflammatory reaction in rats with ulcerative colitis， especially at high doses.

[Key words] Snail homogenate; Ulcerative colitis; Rectal administration; Protective effect

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）主要表現(xiàn)為直腸與結腸黏膜的炎性潰瘍性病變，嚴重可累及黏膜下層，臨床表現(xiàn)為腹瀉、腹痛、黏液便及血便等癥狀[1]。目前，UC治療研究文獻中中藥和中西結合研究約占80%，應用較為廣泛，且相對于化學藥物，不良反應相對較少[2]，其中尤以中藥直腸給藥治療起效較快，效果最為明顯[3]。直腸可以使藥物與潰瘍面直接接觸，持續(xù)高濃度作用于病灶，減少了炎癥因子的滲出，取得了良好效果[4]。

中藥蝸牛為巴蝸牛科巴蝸牛屬動物同型巴蝸牛Bradybaena similaris（Ferussde）、華蝸牛屬動物華蝸牛Cathaica fasciola（Draparnaud）及其同科近緣種的全體，《中藥大辭典》載其“歸膀胱、胃、大腸經(jīng)。主治風熱驚癇……痔瘡，脫肛等”[5]。早在古代的西方醫(yī)學中，使用碾碎的蝸牛應用于傷口[6]。蝸牛肉富含蛋白質(zhì)、必需氨基酸和多不飽和脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)，并且蝸牛分泌的黏液中提取出的尿囊素可促進細胞再生，應用于燒燙傷[7]，黏液組分能促進膠原蛋白、彈性蛋白和真皮成分的形成，修復光老化，減少自由基造成的傷害[8-9]，并顯示出較好的抗炎、促愈合作用[10-11]。因此，本實驗擬采用含有蝸牛組織和黏液的勻漿液，對其直腸給藥用于治療UC的效果進行初步研究，以期為后續(xù)應用提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

蝸牛（自行捕捉，經(jīng)鑒定為巴蝸牛科巴蝸牛屬同型巴蝸牛）;冰乙酸（成都市科龍化工試劑廠，批號：2016041301），水合氯醛（成都市科龍化工試劑廠，批號：20160316），乙醚（四川西隴化工有限公司，批號：20170524），甲醛溶液（成都市科龍化工試劑廠，批號：2016033102）;通用臺式離心機（賽默飛世爾科技中國公司），分析天平（Sartorius，BP211D型），優(yōu)譜超純水器（成都超純科技有限公司，UPH-1-20T型）等。

1.2 實驗動物與分組

SPF級雄性SD大鼠40只，6～7周齡，體重180～220 g，購自四川成都達碩生物科技有限公司，動物許可證號[SCXK（川）2015-030]，分籠飼養(yǎng)，自由攝食飲水。根據(jù)隨機數(shù)字表將實驗動物分為空白組、模型組、高劑量組與低劑量組，每組10只，各組大鼠造模前禁食不禁水24 h，編號稱重。

1.3 蝸牛勻漿液制備

取活體蝸牛洗凈外殼后，禁食不禁水靜養(yǎng)12 h排盡糞便。將活體蝸牛去殼后，取出蝸牛組織，稱量，加入適量生理鹽水，用手動勻漿儀研磨均勻[12]，加入不同體積生理鹽水分別稀釋成0.2、0.1 g/mL，即得含蝸牛勻漿液的高劑量組與低劑量組溶液備用。

1.4 動物模型建立與給藥

將水合氯醛溶液（5%）按0.7 mL/100 g腹腔注射給予大鼠，待其麻醉后，經(jīng)肛門注入冰乙酸（5%）1 mL，作用30 s后，用0.5 mL生理鹽水灌洗1次[13]。低劑量組和高劑量組于造模后第2天，按照0.5 g/kg大鼠、1.0 g/kg大鼠分別直腸給予蝸牛勻漿液，模型組和空白組均給予相應體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)7 d。

1.5 大鼠體征的測定

每日觀察大鼠精神狀態(tài)、活動情況，記錄大鼠造模前和實驗結束時的體重，并計算體重變化。

1.6 糞便評分

參考文獻[14]擬定糞便評分標準，每日記錄各組大鼠糞便情況，給出相應評分，按糞便性狀的程度：正常糞便、軟糞便、非定型軟糞便、水樣糞便、血便分別記為0、1、2、3、4分。

1.7 腸重系數(shù)測定

給藥完成后，采用脫頸椎法處死所有大鼠，解剖取出自肛門往上約7 cm腸段，在生理鹽水中清洗，濾紙吸干表面水分后，統(tǒng)一剪取5 cm腸段稱重，按照下述公式計算腸重系數(shù)：腸重系數(shù)=腸重/體重×100%。

1.8 結腸組織病理學檢測

將取出的各組動物腸組織，固定于4 %甲醛溶液送檢（成都里來生物醫(yī)學實驗中心）。步驟：依次進行脫水、包埋、切片、染色、封片后，在光鏡4×10倍下觀察大體組織、病變，再選擇要觀察的區(qū)域采集400倍圖片，觀察具體病變[15]。對各組結腸的炎癥細胞浸潤、浸潤深度、潰瘍深度，按照潰瘍性結腸炎癥分級評分標準進行評分。見表1。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，非正態(tài)分布資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（IQR）]進行描述。計量資料經(jīng)t檢驗分析，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗;計數(shù)資料和非正態(tài)分布資料經(jīng)秩和檢驗分析，多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 對大鼠體征及體重的影響

模型大鼠經(jīng)蝸牛勻漿液高、低劑量組直腸給藥后，食量、活動開始增加，精神狀態(tài)也由萎靡狀態(tài)逐漸好轉(zhuǎn)。與空白組比較，模型組體重差值降低，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。蝸牛勻漿液直腸給藥后，與模型組比較，高、低劑量組大鼠體重差值均升高，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表2。

2.2 對大鼠糞便性狀的影響

冰醋酸造模后大鼠表現(xiàn)出明顯腹瀉，呈現(xiàn)水樣糞便、稀溏或黏液稠密便，甚至血便，肛周毛發(fā)被糞便污染嚴重。模型組糞便評分高于空白組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。給藥后，高、低劑量組腹瀉癥狀逐漸減輕，由水樣型稀便轉(zhuǎn)為松散型軟糞便，從第4天開始，高劑量組的糞便評分低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表3。

2.3 對大鼠腸重系數(shù)的影響

與模型組比較，空白組、高劑量組和低劑量組的腸重系數(shù)均降低，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。見表4。

2.4 對大鼠結腸組織炎癥的影響

用400倍光學顯微鏡觀察，與模型組比較，高、低劑量組的結腸組織黏膜單層柱狀上皮、固有層及黏膜層結構相對清晰和完整，少見變性及壞死，炎癥細胞浸潤深度較淺。見圖1。另外，采用Kruskal-Wallis H檢驗，各組炎癥細胞浸潤、浸潤深度、潰瘍深度評分的分布不同，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。見表5。同時，采用Bonferroni法矯正顯著性水平后兩兩比較，模型組在炎癥細胞浸潤、浸潤深度、潰瘍深度評分的分布與空白組比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）;高劑量組的炎癥細胞浸潤深度評分與潰瘍深度評分的分布與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表6。

3 討論

現(xiàn)代研究表明中藥蝸牛黏液已顯示出較好的抗炎、促愈合作用等，如：蝸牛組織勻漿液中提取的粗蛋白對于多種致病菌和真菌顯示出較高的抗微生物活性[16];蝸牛的黏液中存在多種復雜并未充分表征且不能被實驗室所合成的活性天然產(chǎn)物[17]，在黑色素瘤的體外研究中表現(xiàn)出較好的抗腫瘤活性[18];另外在對黏液的粗制純化提取物進行哺乳動物成纖維細胞定居的傷口愈合體外實驗中，發(fā)現(xiàn)其對成纖維細胞具有促存活、增殖與遷移作用，誘導IL-8的分泌，促進傷口愈合[19-20]。同時，研究[3]表明潰瘍性結腸炎的現(xiàn)代臨床治療采用中藥特別是中藥直腸給藥較西藥更具綜合優(yōu)勢。

鑒于此，本研究創(chuàng)新性地將蝸牛勻漿液直腸給藥治療UC模型大鼠，通過對其各項體征的觀察及糞便性狀、體重、腸重系數(shù)、結腸組織炎癥等指標的分析，發(fā)現(xiàn)蝸牛勻漿液可以改善模型大鼠活動，使其食量增加、精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)等，并且能夠改善大鼠糞便性狀，降低腹瀉評分;同時，蝸牛勻漿液可以通過減少結腸炎病理損傷程度來降低腸重系數(shù)和結腸炎癥評分，有效控制潰瘍惡化累及至結腸黏膜下層，且以高劑量組作用突出，該研究結果提示，蝸牛勻漿液直腸給藥對于UC大鼠確有較好的保護作用。

本實驗在蝸牛勻漿液的處理方法中，對鮮蝸牛靜養(yǎng)排便、去殼去雜、低溫保存、低溫勻漿等環(huán)節(jié)進行控制，確保受試樣品的活性與實驗操作的可靠性。盡管結果提示采用該法制備的蝸牛勻漿液確實顯示出良好的抗UC大鼠結直腸炎癥損傷作用，但蝸牛勻漿液同樣具備中藥組成成分復雜這一共性，其用于抗炎作用的物質(zhì)基礎目前還不明確，可能的作用機制也不清楚。課題組將在此基礎上，進一步對蝸牛勻漿液進行活性成分研究，以揭示其治療UC的物質(zhì)基礎與可能機制，以期深入開發(fā)挖掘蝸牛的臨床應用價值。

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（收稿日期：2019-01-13? 本文編輯：封? ?華）