高糖對肝臟胰高血糖素受體的表達及作用影響

劉夢丹 冀琳琳 葉陽 祝超瑜 肖元元 高清歌 魏麗

[摘要] 目的 觀察db/db小鼠肝組織和高糖對待的肝癌細胞株HepG2細胞中胰高血糖素受體（GCGR）的表達及作用的變化。 方法 db/db小鼠和對照小鼠均進行腹腔注射葡萄糖耐量試驗（IPGTT）和腹腔注射胰島素耐量試驗（IPITT），收集兩組小鼠的血液進行生化指標檢測;采用Western blot或免疫組化法檢測兩組小鼠肝臟中GCGR、蛋白激酶A（PKA）、磷酸化蛋白激酶A（p-PKA）的表達情況。采用Western blot法檢測在無胰高血糖素（GLN）刺激下，不同糖濃度或不同時間梯度高糖（30 mmol/L）處理的HepG2細胞GCGR的表達情況，以及在GLN刺激下，不同時間梯度高糖處理的HepG2細胞GCGR、PKA、p-PKA蛋白的表達情況。 結果 與對照小鼠比較，db/db小鼠肝臟GCGR表達增加，而PKA磷酸化水平下降（P < 0.05或P < 0.01）。HepG2細胞的GCGR蛋白表達水平隨葡萄糖濃度增加而升高，隨高糖作用時間延長先下降后升高（均P < 0.01）。GLN刺激下，隨著高糖對待時間的增加，GCGR蛋白表達水平逐漸升高（均P < 0.01）;p-PKA/PKA水平則較對照組（0 h）降低（P < 0.05或P < 0.01）。 結論 慢性高糖可增加肝臟GCGR的表達，并導致肝臟胰高血糖素抵抗。

[關鍵詞] 胰高血糖素受體;胰高血糖素抵抗;糖尿病;db/db小鼠;HepG2細胞

[中圖分類號] R587? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）08（a）-0012-05

[Abstract] Objective To investigate the changes of the expression and function of glucagon receptor （GCGR） in db/db mice liver and hepatocellular carcinoma cell line HepG2 cells treated with high glucose. Methods Intraperitoneal glucose tolerance test （IPGTT） and intraperitoneal insulin tolerance test （IPITT） were performed in both db/db mice and control mice. The blood of mice in the two groups was collected for biochemical test; the expression of GCGR， protein kinase A （PKA） and phosphorylated protein kinase A （p-PKA） in the liver of the two groups were detected by Western blot or immunohistochemistry. The expression of GCGR in HepG2 cells treated with high glucose （30 mmol/L） in different glucose concentrations or different time gradients was detected by Western blot without stimulation of glucagon （GLN）. Under GLN stimulation， the expression of GCGR， PKA and p-PKA proteins in HepG2 cells treated with high glucose at different time gradients was also detected by Western blot. Results Compared with control mice， the expressions of GCGR were markedly elevated in liver of db/db mice， but phosphorylated PKA levels were decreased （P < 0.05 or P < 0.01）. GCGR protein expressions were increased following the growth of glucose concentrations in HepG2 cells， meanwhile， the expressions of GCGR protein were decreased at first， then increased with time extended （all P < 0.01）. Under GLN stimulation， the GCGR protein levels were upregulated by high glucose in a time-dependent manner （P < 0.01）. However， p-PKA/PKA levels were decreased compared with control group （0 h） （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Chronic hyperglycemia can increase the expression of GCGR in the liver and lead to glucagon resistance in the liver.

[Key words] Glucagon receptor; Glucagon resistance; Diabetes mellitus; db/db mice; HepG2 cell

近年來對糖尿病發(fā)病機制的研究發(fā)現(xiàn)，胰高血糖素（GLN）分泌過多是造成糖尿病的重要原因之一[1-3]。GLN由胰島α細胞分泌，主要通過與胰高血糖素受體（GCGR）結合來調節(jié)血糖[4]。在肝臟中，其可激活與糖異生有關的酶系，加速糖原分解和糖異生，增加肝糖輸出[5]。GCGR是一個具有7次跨膜序列的G蛋白偶聯(lián)受體，主要分布于肝臟中[6]。GCGR主要的生物學作用是與GLN結合后，通過PKA-cAMP途徑和Gq-PLC/Ca2+兩種途徑發(fā)揮調節(jié)血糖的作用[7-9]，在肝臟中，其主要是通過PKA-cAMP途徑。

糖毒性作用可通過增加氧化應激、增加線粒體應激以及造成DNA損傷等多種途徑導致胰腺、肝臟等多種臟器的損傷[10]。研究表明，在體內外葡萄糖均可增加GCGR和mRNA的表達[11-12]。慢性高糖對肝臟GCGR蛋白表達及GLN作用的影響目前鮮見報道。本研究以db/db小鼠和高糖對待的HepG2細胞為研究對象，旨在從動物及細胞分子水平探討慢性高糖對肝臟GCGR的表達及GLN作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物? HepG2細胞株取自上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）糖尿病研究所。SPF級雄性8周齡小鼠共16只，db/db小鼠及同窩對照db/m小鼠各8只，均購于南京大學模式動物研究所，實驗動物使用許可證號：SCXK（蘇）2015-0001，合格證號：201803367。小鼠均飼養(yǎng)在20～25℃室溫、濕度50%的動物房，普食喂養(yǎng)，自由飲食。本研究經我院動物實驗福利倫理委員會審批同意。

1.1.2 試劑? GCGR抗體（Thermo Fisher，美國，貨號：PA5-50668）;HSP90（貨號：4874）、蛋白激酶A（PKA，貨號：5842S）、磷酸化蛋白激酶A（p-PKA，T197，貨號：5661S）、辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔IgG二抗（貨號：7074S）均購自Cell Signaling Technology（美國）;羊抗兔二抗（DAKO，丹麥，貨號：K5007）;GLN（Millipore，美國，貨號：05-23-2700）;BCA定量試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，貨號：P0010）;三酰甘油測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號：A110-1）;小鼠胰島素酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（Crystal Chem，美國，貨號：90080）。

1.2 方法

1.2.1 動物實驗? 小鼠適應性喂養(yǎng)1周，進行腹腔注射葡萄糖耐量試驗（IPGTT）。禁食16 h后，用2 g/kg D-葡萄糖溶液進行腹腔注射，檢測0、15、30、60、90、120 min時小鼠的血糖水平。1周后，進行腹腔注射胰島素耐量試驗（IPITT）。禁食6 h后，腹腔注射胰島素1.0 U/kg，同樣在上述相同時間點測定小鼠的血糖水平。禁食12 h后，將小鼠處死，收集血液行生化指標測定，留取肝臟組織保存于-80℃冰箱。

1.2.2 細胞實驗? 將HepG2細胞用無糖無血清的培養(yǎng)基孵育2 h后，以不同濃度葡萄糖溶液（5.6、11.2、25、30、50 mmol/L）處理48 h，用甘露醇調節(jié)滲透壓至50 mmol/L;以30 mmol/L葡萄糖溶液干預細胞不同時間（0、6、12、24、48 h），或在收細胞蛋白前用100 nmol/L的GLN對待細胞15 min，以觀察高糖對GLN作用的影響。

1.2.3 Western blot分析? 蛋白提取后，BCA法測定蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜、封閉，HSP90、PKA、p-PKA（1∶1000）及GCGR（l∶500）一抗4℃孵育過夜，二抗（1∶1000）室溫孵育60 min，曝光。

1.2.4 免疫組化染色? 石蠟組織切片脫蠟、脫水，EDTA（pH 9.0）抗原修復，3%雙氧水孵育20 min，滴加山羊血清封閉，分別滴加一抗GCGR抗體（1∶50）和即用性羊抗兔二抗，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，鏡檢拍片。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0統(tǒng)計學軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，Western blot結果采用Image J分析軟件，免疫組化結果采用Image pro plus分析軟件，使用Graphpad Prism7做圖，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組小鼠的生化指標比較

與對照小鼠相比，db/db小鼠體重、肝重、空腹血糖、空腹胰島素、總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇、丙氨酸轉氨酶、肝脂及胰島素抵抗指數升高，胰島素分泌指數降低，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。見表1。db/db小鼠IPGTT、IPITT各時間點的血糖水平均較對照小鼠升高，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。見圖1。

2.2 兩組小鼠肝臟組織GCGR蛋白表達水平比較

Western blot結果顯示，與對照小鼠（0.43±0.02）比較，db/db小鼠GCGR蛋白表達（1.56±0.26）明顯升高，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）;免疫組化結果顯示，與對照小鼠（1.86±0.34）比較，db/db小鼠肝臟中GCGR表達（14.84±0.31）也明顯增加，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。見圖2（封四）。

2.3 兩組小鼠肝臟組織PKA磷酸化水平比較

兩組小鼠PKA蛋白表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。與對照小鼠（1.82±0.07）比較，db/db小鼠p-PKA蛋白表達水平（1.12±0.08）降低，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。與對照小鼠p-PKA/PKA水平（1.33±0.16）比較，db/db小鼠p-PKA/PKA水平（0.78±0.02）降低，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。見圖3。

2.4 葡萄糖對無GLN刺激下HepG2細胞GCGR蛋白表達影響的濃度和時間效應

與5.6 mmol/L葡萄糖濃度的對照組比較，11.2～50 mmol/L葡萄糖濃度均可使HepG2細胞GCGR蛋白表達升高，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01），其中30 mmol/L葡萄糖濃度組使HepG2細胞GCGR蛋白表達升高最為明顯。與高糖（30 mmol/L）對照組比較，隨著高糖作用時間的延長，HepG2細胞GCGR蛋白表達呈現(xiàn)先下降后逐漸升高的趨勢，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01），其中48 h時GCGR蛋白表達升高最為明顯。見圖4。

2.5 高糖對GLN刺激下的HepG2細胞GCGR、PKA、p-PKA表達的影響

在GLN刺激下，與高糖對照組（0 h）比較，隨著高糖對待時間的增加，GCGR蛋白表達水平逐漸升高，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01），而p-PKA/PKA水平則隨著高糖對待時間的增加而降低，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。其中，24 h及48 h高糖組GCGR蛋白表達水平約是0 h高糖組的2倍，而24 h及48 h高糖組p-PKA/PKA水平較0 h組約下降40%。見圖5。

3 討論

40多年前，Unger和Orci便提出了“雙激素異常”假說：絕對或相對的低胰島素血癥和絕對或相對的高胰高血糖素血癥是糖尿病高血糖最核心的原因[13]。研究發(fā)現(xiàn)，即使完全破壞β細胞，GCGR小鼠也可不出現(xiàn)高血糖癥狀且葡萄糖耐量正常[9，14]。而恢復肝臟GCGR表達后小鼠很快表現(xiàn)出高血糖癥狀，說明GLN及其受體GCGR在糖代謝中發(fā)揮重要作用。

慢性高糖可引起胰島素抵抗，并增加肝癌發(fā)病風險[15-16]。糖毒性對GLN作用的影響目前鮮見報道。本實驗觀察到db/db小鼠肝臟GCGR蛋白表達較對照小鼠顯著升高，而GLN的主要信號通路PKA磷酸化水平卻下降，說明db/db小鼠肝臟GCGR敏感性下降，存在胰高血糖素抵抗。GLN作用下，隨著高糖作用時間的增加，HepG2細胞的GCGR蛋白表達水平逐漸增加，而p-PKA/PKA水平下降，與db/db小鼠的實驗結果一致，這種結果將導致GLN刺激糖異生的作用減弱。慢性高糖可導致肝細胞胰高血糖素抵抗，這可能是糖毒性對肝細胞的另一種表現(xiàn)形式，這也可能是糖尿病患者耐受饑餓能力較差而且容易發(fā)生低血糖的原因之一。

GCGR的表達受多種因素影響。葡萄糖、糖異生底物甘油及二羥基丙酮、cAMP、肝臟脂肪變、鍛煉、年齡、氧濃度等均可影響小鼠肝臟GCGR mRNA的表達[11-12，17-18]。其中葡萄糖對GCGR的表達影響尤其重要。在糖尿病、高糖鉗夾下GCGR mRNA表達量均增加，但高糖被糾正后，上述效應便明顯減弱[12]。db/db小鼠表現(xiàn)為明顯高血糖，肝臟GCGR蛋白表達較對照小鼠明顯升高。細胞實驗也觀察到慢性高糖增加GCGR蛋白表達。結果與既往研究結果基本一致[10，12]。不同的是本實驗報道db/db小鼠GCGR蛋白表達變化，并且主要從蛋白水平上進行實驗，而既往研究多在mRNA水平上進行。

目前關于慢性高糖引起肝臟GCGR表達升高的具體機制尚不明確。既往研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖可激活轉錄因子糖類應答元件結合蛋白（ChREBP）[19-20]。ChREBP通過與GCGR啟動子區(qū)的糖類反應元件（ChoRE）結合促進GCGR的翻譯。GLN可通過作用于GCGR蛋白抑制ChREBP活性，從而降低GCGR的翻譯表達[21]，該過程形成了一個負反饋環(huán)路。結合本研究結果考慮，db/db小鼠肝臟GCGR表達升高的可能機制為高糖作用激活ChREBP導致GCGR表達升高。而長期高糖環(huán)境導致GCGR對GLN的作用不敏感，GLN對GCGR負反饋抑制作用減弱，進而db/db小鼠肝臟和慢性高糖作用下的HepG2細胞GCGR表達升高。

綜上所述，慢性高糖在動物及細胞水平均增加肝臟GCGR的蛋白表達，使GLN下游信號p-PKA/PKA水平下降，導致肝臟胰高血糖素抵抗。本研究的不足在于db/db小鼠是一種存在多重代謝缺陷的小鼠，不僅存在高血糖一種異常，因而無法排除其他代謝因素的干擾作用。且本研究只是初步研究，今后會進一步探討肝臟胰高血糖素抵抗對機體代謝紊亂的影響及慢性高糖引起肝臟GCGR表達升高的具體機制。

[參考文獻]

[1]? Edgerton DS，Cherrington AD. Glucagon as a critical factor in the pathology of diabetes [J]. Diabetes，2011，60（2）：377-380.

[2]? Briant LJB，Reinbothe TM，Spiliotis I，et al. δ-cells and β-cells are electrically coupled and regulate α-cell activity via somatostatin [J]. J Physiol，2018，596（2）：197-215.

[3]? Müller TD，F(xiàn)inan B，Clemmensen C，et al. The New Biology and Pharmacology of Glucagon [J]. Physiol Rev，2017， 97（2）：721-766.

[4]? Gylfe E，Gilon P. Glucose regulation of glucagon secretion [J]. Diabetes Res Clin Pract，2014，103（1）：1-10.

[5]? Kim T，Nason S，Holleman C，et al. Glucagon Receptor Signaling Regulates Energy Metabolism via Hepatic Farnesoid X Receptor and Fibroblast Growth Factor 21 [J]. Diabetes，2018，67（9）：1773-1782.

[6]? Zhang H，Qiao A，Yang D，et al. Structure of the full-length glucagon class B G-protein-coupled receptor [J]. Nature，2017，546（7657）：259-264.

[7]? Li XC，Carretero OA，Shao Y，et al. Glucagon receptor-mediated extracellular signal-regulated kinase 1/2 phosphorylation in rat mesangial cells：role of protein kinase A and phospholipase C [J]. Hypertension，2006，47（3）：580-585.

[8]? Kim K，Ryu D，Dongiovanni P，et al. Degradation of PHLPP2 by KCTD17，via a Glucagon-Dependent Pathway，Promotes Hepatic Steatosis [J]. Gastroenterology，2017，153（6）：1568-1580. e10.

[9]? Conarello SL，Jiang G，Mu J，et al. Glucagon receptor knockout mice are resistant to diet-induced obesity and streptozotocin-mediated beta cell loss and hyperglycaemia [J]. Diabetologia，2007，50（1）：142-150.

[10]? Giri B，Dey S，Das T，et al. Chronic hyperglycemia mediated physiological alteration and metabolic distortion leads to organ dysfunction，infection，cancer progression and other pathophysiological consequences：An update on glucose toxicity [J]. Biomed Pharmacother，2018，107：306-328.

[11]? Abrahamsen N，Lundgren K，Nishimura E. Regulation of glucagon receptor mRNA in cultured primary rat hepatocytes by glucose and cAMP [J]. J Biol Chem，1995，270（26）：15 853-15 857.

[12]? Burcelin R，Mrejen C，Decaux JF，et al. In vivo and in vitro regulation of hepatic glucagon receptor mRNA concentration by glucose metabolism [J]. J Biol Chem，1998， 273（14）：8088-8093.

[13]? Unger RH，Orci L. The essential role of glucagon in the pathogenesis of diabetes mellitus [J]. Lancet，1975，1（7897）：14-16.

[14]? Girard J. Glucagon，a key factor in the pathophysiology of type 2 diabetes [J]. Biochimie，2017，143：33-36.

[15]? Garcia-Compean D，Jaquez-Quintana JO，Gonzalez-Gonzalez JA，et al. Liver cirrhosis and diabetes：risk factors，pathophysiology，clinical implications and management [J]. World J Gastroenterol，2009，15（3）：280-288.

[16]? Kim K，Choi S，Park SM. Association of fasting serum glucose level and type 2 diabetes with hepatocellular carcinoma in men with chronic hepatitis B infection：A large cohort study [J]. Eur J Cancer，2018，102：103-113.

[17]? 王倩倩，肖元元，祝超瑜，等.肝臟脂肪變對胰高血糖素受體的表達影響[J].醫(yī)學研究雜志，2016，45（9）：33-38.

[18]? Melancon A，Gagnon V，Milot M，et al. Liver glucagon receptors（GluR）：effect of exercise and fasting on binding characteristics，GluR-mRNA，and GluR protein content in rats [J]. Horm Metab Res，2013，45（10）：716-721.

[19]? Wang H，Dolezal JM，Kulkarni S，et al. Myc and ChREBP transcription factors cooperatively regulate normal and neoplastic hepatocyte proliferation in mice [J]. J Biol Chem，2018，293（38）：14 740-14 757.

[20]? Iizuka K. The transcription factor carbohydrate-response element-binding protein（ChREBP）：A possible link between metabolic disease and cancer [J]. BBA-Mol Basis Dis，2017，1863（2）：474-485.

[21]? Iizuka K，Tomita R，Takeda J，et al. Rat glucagon receptor mRNA is directly regulated by glucose through transactivation of the carbohydrate response element binding protein [J]. Biochem Biophys Res Commun，2012，417（4）：1107-1112. doi：10.1016/j.bbrc.2011.12.042

（收稿日期：2019-01-28? 本文編輯：張瑜杰）