體外消化模型中酸乳β-酪啡肽-7和β-酪啡肽-5的釋放及阿片活性

寧亞茹，李 琪，劉曉宇，智童心，劉曉涵，桑亞新*

（河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，河北 保定 071000）

食源性活性肽具有廣泛的藥理和生物活性，開發(fā)其在食品中的營養(yǎng)潛力對于人類健康十分必要[1-2]。近些年乳制品在我國食品行業(yè)較為火熱，尤其是酸乳制品，所以酸乳制品中的生物活性肽是目前研究的熱點。酸乳是食源性生物活性肽的重要來源[3]，通常由乳酸菌發(fā)酵乳品而得，常用發(fā)酵菌種為保加利亞乳桿菌（Lactobacillus）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）[4]。β-酪蛋白約占牛乳中總蛋白的40%，除了營養(yǎng)價值外，它還能在發(fā)酵過程中通過乳酸菌從乳蛋白中釋放出生物活性肽[5-7]，其中β-酪啡肽（beta-casomorphins，β-CM）是衍生自β-酪蛋白的阿片樣肽，在乳蛋白序列內(nèi)無活性，最初從酶解酪蛋白中分離出來[8]。對β-CM研究最多的是β-CM-7和β-CM-5，它們在β-酪蛋白中的氨基酸位置分別為f60-66和f60-64[9]，β-CM-7的摩爾質(zhì)量為789.93 g/mol，β-CM-5的摩爾質(zhì)量為579.65 g/mol，均含有常見的N-末端氨基酸Tyr-Pro-Phe-Pro，并具有優(yōu)先的μ-受體激動劑活性[10]。β-CM可以與中樞神經(jīng)系統(tǒng)和腸肌叢中的阿片受體結(jié)合，抑制其興奮，并減少腎上腺皮質(zhì)激素釋放，具有促進胃腸運動、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、誘導睡眠、抗焦慮、舒緩神經(jīng)等多種作用[11]。

已有研究表明，酸乳在消化過程中會釋放β-CM，但對其活性作用還缺乏進一步驗證。目前國外部分研究對乳制品中β-CM進行了定量分析，但對阿片活性研究數(shù)據(jù)不足[12-17]。Nguyen等[9]利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法鑒定和定量酸乳中的β-CM-5和β-CM-7，認為其無阿片活性；Kunda等[18]通過微量液相色譜與飛行時間質(zhì)譜相結(jié)合在酸乳中檢測出50 種生物活性肽，但無活性數(shù)據(jù)；Cattaneo等[19]研究了體外消化模型中嬰兒配方奶粉蛋白質(zhì)的分解和消化液中β-CM的釋放，但沒有對其生物活性進行研究。國內(nèi)的研究主要集中在干酪素來源的β-CM，對酸乳中的β-CM研究較少。張源淑等用胃蛋白酶水解干酪素得到β-CM-7，發(fā)現(xiàn)其具有阿片活性，并建立了檢測β-CM含量的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[20]，能夠準確鑒定和定量β-CM[20]；張建輝[21]也利用相同的方法得到來自于β-酪蛋白變體的新型β-CM，發(fā)現(xiàn)其具有屬于阿片活性的鎮(zhèn)痛作用；鐘海濤等[22]建立了檢測β-CM含量的酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法，該方法具有靈敏度高、專一性強的優(yōu)點，但因β-CM類分子質(zhì)量較小，制備其多克隆抗體有一定困難，因此不利于生產(chǎn)上推廣應用。本實驗以普通市售酸乳為研究對象，通過改進以往所建立的HPLC法，對酸乳酪蛋白酶解釋放的β-CM進行定性和定量分析，從細胞生物學、小鼠行為學方面對酶解液的阿片活性進行測定，以期為酸乳中β-CM的釋放規(guī)律及其生理功能的研究提供有效的方法和手段，進一步挖掘酸乳中生物活性肽的營養(yǎng)與功能，并為具有鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜活性的功能食品開發(fā)提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

凝固型酸乳由保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌發(fā)酵而成，蛋白含量3.2 g/100 g，乳品酸度為（80±4）°T；菌種由河北新希望天香乳業(yè)有限公司提供，接種量5%（質(zhì)量分數(shù)，下同），42 ℃厭氧發(fā)酵5 h，凝固后4 ℃過夜進行后熟。

NG108-15神經(jīng)雜交瘤細胞（即大鼠的神經(jīng)母細胞×小鼠的神經(jīng)膠質(zhì)細胞） 國家實驗細胞資源共享平臺；KM小鼠（生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2014-0004）北京華阜康生物科技有限公司。

β-CM-7標準品、β-CM-5標準品 武漢百意欣生物技術(shù)有限公司；胃蛋白酶（酶活力3 000～3 500 U/mg）、胰蛋白酶（酶活力250 U/mg）、葡聚糖凝膠（Sephadex）G15 北京索萊寶科技有限公司；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準品（1.7～40.0 kDa） 上海威奧生物技術(shù)有限公司；乙腈、三氟乙酸（色譜純）、蛋白定量檢測試劑盒、CytokineTMcAMP ELISA Kit 北京百智生物科技有限公司；鉛皮 保定萬科試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

BG-Power 600電泳儀 北京百晶有限公司；Mini Pellicon切向流超濾系統(tǒng) 密理博中國有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；FD5-2.5冷凍干燥機 美國SIM公司；1260液相色譜儀 美國Agilent公司；1500-823酶標儀 美國Thermo Scientific公司；HH-2數(shù)顯水浴鍋 國華電器有限公司；小鼠游泳缸保定萬科試劑有限公司。

1.3 方法

1.3.1 體外消化模型構(gòu)建

采用體外模擬消化，先獲得酸乳胃消化液（VSYSD），再將VSYSD進行腸道消化，獲得不同階段的酸乳胰消化液（VSYPD）。稱取300 g酸乳2 份，分別與等體積的35 mmol/L氯化鈉混合，用鹽酸將混合物調(diào)節(jié)至pH 2.0，加入胃蛋白酶（酶/底物質(zhì)量比為1∶100），37 ℃孵育2 h。反應結(jié)束后，用1 mol/L NaOH溶液將水解產(chǎn)物調(diào)節(jié)至pH 7.0使胃蛋白酶失活，獲得VSYSD，取一份4 ℃保存；另一份VSYSD加入胰蛋白酶（酶/底物質(zhì)量比為1∶100），并在37 ℃孵育2 h，通過加入1 mol/L NaOH溶液將pH值調(diào)節(jié)至11.0，獲得VSYPD[23]。取酸乳、VSYSD、VSYPD，10 000 r/min 4 ℃離心20 min取上清液，將獲得的粗樣品保存用于下一步實驗。

1.3.2 酸乳消化程度驗證

以酪蛋白為對照，對1.3.1節(jié)中得到的樣品及酪蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，對比電泳圖中的酪蛋白電泳條帶，驗證酸乳在模擬胃腸道中的消化情況。據(jù)文獻[23]可知，樣品的蛋白質(zhì)量濃度需要稀釋到0.65 mg/mL才能得到清晰美觀的電泳條帶。因此，測定獲得粗樣品的蛋白質(zhì)量濃度，選擇合適的稀釋度。電泳條件為：質(zhì)量分數(shù)20%分離膠，電壓120 V；質(zhì)量分數(shù)5%濃縮膠，電壓100 V；上樣量10 μL。觀察電泳條帶，確定酸乳在胃腸道中的消化情況以及短小生物活性肽的生成情況。

1.3.3 β-CM分離純化

將所得VSYSD和VSYPD用質(zhì)量分數(shù)75%硫酸銨進行沉淀除雜，再將其經(jīng)4 500 r/min離心，上清液過0.45 μm濾膜后，用1 000 Da濾膜超濾，取分子質(zhì)量小于1 000 Da部分旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、透析、冷凍干燥。采用葡聚糖凝膠G15層析柱對1.3.1節(jié)獲得的酸乳消化液粗品進行分離純化。用pH 7.0雙蒸水洗脫，樣品質(zhì)量濃度為40 mg/mL，上樣量為l mL，流速為1 mL/min，檢測波長為215 nm。

1.3.4 β-CM質(zhì)量濃度測定

HPLC條件：流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，波長215 nm，進樣量10 μL，流動相溶劑A：0.1%（體積分數(shù)，下同）三氟乙酸；溶劑B：100%乙腈+0.1%三氟乙酸，流動相均經(jīng)真空泵過濾除雜和超聲清洗機脫氣，梯度洗脫程序為：0～20 min，5%～60%流動相A；20～40 min，60%～5%流動相A；洗脫流速為1 mL/min。

以β-CM-7、β-CM-5標準品制作標準曲線，對消化液及其葡聚糖凝膠G15層析分離各組分進行HPLC分析，利用峰面積通過標準曲線回歸方程對β-CM進行定量分析。

1.3.5 β-CM阿片活性的測定

1.3.5.1 NG108-15細胞體外活性測定

NG108-15細胞培養(yǎng)：按張源淑等[24]的方法，用PRIM-1640完全培養(yǎng)液，半懸浮傳代培養(yǎng)。

細胞勻漿腺苷酸環(huán)化酶（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）實驗：參照張雨梅等[25]的方法并加以改進。細胞在RPMI-1640完全培養(yǎng)液中37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，待細胞貼壁后，棄去上清液，用細胞培養(yǎng)液清洗一次，吹打細胞，調(diào)整細胞濃度，鏡檢計數(shù)使每毫升培養(yǎng)液中含NG108-15細胞數(shù)基本一致，將細胞均勻分裝于50 mL一次性細胞培養(yǎng)皿中，加RPMI-1640完全培養(yǎng)液10 mL，37 ℃、5% CO2條件下預培養(yǎng)約12 h，待細胞貼壁后棄去培養(yǎng)液。

不同處理組的樣品（表1）與NG108-15細胞共同培養(yǎng)15 min，加入15%三氯醋酸2.0 mL終止反應。原瓶吹打細胞，3 000 r/min離心10 min，棄上清液；加入50 mmol/L醋酸緩沖液2.0 mL懸浮沉淀，盡量全部移入小瓶，-30 ℃過夜，反復凍融5 次，超聲波破碎細胞（300 Hz、3 min）；17 000×g離心30 min，取上清液于小瓶中沉淀；加入2.0 mL無水乙醇混勻，離心。合并上清液于小瓶中，測定制備液中蛋白質(zhì)量濃度，60 ℃烘干，4 ℃保存待測。

表1 細胞培養(yǎng)液添加量Table 1 Medium formulations

采用CytokineTMcAMP ELISA Kit測定NG108-15細胞cAMP活力，分析步驟和試劑配制均按使用說明書進行。取0.1 mL溶液加入分析試管做雙管測定。以每毫克蛋白生成cAMP的物質(zhì)的量計算。

1.3.5.2 β-CM鎮(zhèn)痛實驗

β-CM能夠通過血腦屏障，可以由血液進入腦組織，最終使小鼠喪失痛覺[26-27]，因此通過小鼠的舔足實驗來驗證β-CM的阿片活性。取雌性小鼠數(shù)只，依次放入燒杯內(nèi)，立即用秒表記錄時間。自放入燒杯至出現(xiàn)舔后足所需的時間作為該小鼠的痛閾。凡在30 s內(nèi)不舔足或者逃避者棄置不用。篩選出合格的雌性小鼠，隨機分組，每組8 只，各小鼠編號后重復測其正常痛閾一次，以確保小鼠正常痛閾的準確性。

待測樣品腹腔注射：按0.1 mL/10 g給藥，第1組給予生理鹽水作為陰性對照，第2組給予粗VSYSD，第3組給予粗VSYPD，第4組給予粗VSYSD+納洛酮（VSYSD+N），第5組給予粗VSYPD+納洛酮（VSYPD+N）。因為納洛酮是阿片類物質(zhì)的特異性拮抗劑，只要納洛酮能夠拮抗樣品的鎮(zhèn)痛作用，就說明樣品中含有阿片肽類物質(zhì)。分別在給藥后0、10、20、30、45、60、90 min后各測小鼠痛閾1 次。若放入燒杯內(nèi)60 s仍無反應，應將小鼠取出，痛閾按照60 s計[21]。鎮(zhèn)痛效果用痛閾提高率表示，計算公式如下。

1.3.5.3 β-CM抗疲勞實驗

40 只小鼠隨機分為5 組，每組8 只，雌雄各半，第1組注射生理鹽水作為對照組，第2組注射粗VSYSD（50 mg/mL），第3組注射粗VSYSD（50 mg/mL）+納洛酮，第4、5組分別為VSYSD純化樣品高劑量（20 mg/mL）組和低劑量（5 mg/mL）組，腹腔注射給藥。給藥后30 min進行負重游泳實驗，將小鼠置于玻璃游泳缸中游泳，水深80 cm，水溫保持在（30.0±0.5）℃，小鼠尾根部負荷5%體質(zhì)量的鉛皮。小鼠自游泳開始至死亡的時間為小鼠的游泳時間。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗數(shù)據(jù)處理表示為平均值±標準差，采用SPSS軟件t檢驗法分析差異顯著性，P＜0.05認為結(jié)果差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸乳消化程度分析

圖1 酸乳及消化液的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig. 1 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis patterns of yogurt and its digests

如圖1所示，在泳道2、3上酪蛋白位置均沒有條帶，但在較小的分子質(zhì)量處出現(xiàn)條帶；酸乳所在的泳道4只有單一的酪蛋白條帶，這個現(xiàn)象表明酪蛋白并沒有被酸乳發(fā)酵過程中的乳酸菌水解。在人工模擬胃腸道消化液中，酸乳中的酪蛋白被胃蛋白酶、胰蛋白酶完全水解并且產(chǎn)生了小分子質(zhì)量活性多肽。

2.2 酸乳消化液的分離純化結(jié)果

圖2 VSYPD的葡聚糖凝膠G15層析結(jié)果Fig. 2 Sephadex G15 gel chromatogram of VSYPD

如圖2所示，采用葡聚糖凝膠G15層析柱對酸乳消化液粗品進行分離純化，得到單一峰且峰形良好，響應值較高，收集各組分的洗脫液，待進一步分析。

2.3 酸乳及其消化液β-CM的定量分析

由圖3、4可以得出，在酸乳的人工模擬胃腸道消化過程中，β-CM-7在胰腺中的釋放量高于在胃中，在酸乳胰腺粗消化液中質(zhì)量濃度達到0.407 mg/mL，可能是其他β-CM經(jīng)過胰蛋白酶分解成β-CM-7，從而使β-CM-7在胰腺中的質(zhì)量濃度升高；而β-CM-5在胃中的釋放量高于胰腺中，在VSYSD粗品中達到0.830 mg/mL，其原因可能是胰蛋白酶對β-CM-5進一步分解，使其在胰腺中的質(zhì)量濃度降低。在未純化的酸乳粗樣品中存在微量的β-CM-7（0.022 mg/mL）和β-CM-5（0.021 mg/mL），但是經(jīng)過復雜的純化步驟后，酸乳中的β-CM質(zhì)量濃度利用HPLC法已經(jīng)不能檢出，此實驗結(jié)果與Nguyen等[9]發(fā)現(xiàn)實驗室制備的酸乳中存在微量β-CM-7、β-CM-5的結(jié)論相同。綜上可知，酸乳在經(jīng)過胃腸消化后β-CM釋放量在胃中達到最高，但相比血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽等生物活性肽其釋放量較小[23]。

圖3 酸乳粗消化液中β-CM質(zhì)量濃度Fig. 3 β-Casophanin concentrations in crude yogurt digests

圖4 純化后酸乳消化液中β-CM質(zhì)量濃度Fig. 4 β-Casomorphin concentrations in purified yogurt digests

2.4 酸乳及其消化液β-CM阿片活性分析

2.4.1 NG180-5細胞的cAMP活力

NG108-15細胞是研究阿片類物質(zhì)活性常用細胞模型，其富含δ-阿片受體，阿片類物質(zhì)可以與其上受體結(jié)合，影響cAMP活力，阿片特異性拮抗劑納洛酮能拮抗這種作用。

表2 酸乳及其消化液的cAMP活力Table 2 cAMP activity of yogurt and its digests

由表2可以看出，β-CM-7標準品以及酸乳的胃消化液、胰消化液均可刺激NG108-15 cAMP活力，并且它們的刺激作用均可以被納洛酮拮抗；酸乳樣品也可以影響NG108-15 cAMP活力，但是影響較小且不能被納洛酮拮抗，由此說明酸乳本身不具有阿片活性，經(jīng)過人體胃腸消化后均可以產(chǎn)生具有阿片活性的β-CM。這與張源淑等[24]的實驗結(jié)果相一致，證明經(jīng)過胃腸道消化后，酸乳在胃中產(chǎn)生的物質(zhì)阿片活性高于腸道中，這與2.3節(jié)利用HPLC法檢測的β-CM-7、β-CM-5質(zhì)量濃度的結(jié)果相一致。酸乳可以在胃腸消化后釋放具有阿片活性的β-CM，這對于食源性生物活性肽以及功能性食品的研究具有重要意義。

2.4.2 小鼠鎮(zhèn)痛實驗結(jié)果

表3 VSYSD和VSYPD的鎮(zhèn)痛活性Table 3 Analgesic activity of VSYSD and VSYPD

阿片活性包括鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜、抗疲勞、促進胃腸道蠕動、促進脂肪代謝、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等作用[28]。本研究主要關(guān)注β-CM阿片活性中的鎮(zhèn)痛以及抗疲勞作用。從表3可以看出，與生理鹽水組相比較，VSYSD和VSYPD鎮(zhèn)痛活性均從20 min開始有顯著性差異，并且在30 min時達到最好效果，從30 min后均有鎮(zhèn)痛效果，但呈下降趨勢。VSYSD和VSYPD的鎮(zhèn)痛作用都能被納洛酮拮抗，并且VSYSD中納洛酮的拮抗作用比VSYPD強。納洛酮是阿片肽的特異性拮抗劑，所以能夠確定VSYSD和VSYPD中均含有阿片活性物質(zhì)，且鎮(zhèn)痛作用為阿片肽的活性。

圖5 酸乳不同酶解液的痛閾提高率Fig. 5 Effect of enzymatic digests of yoghurt on increasing pain threshold

從圖5中可以看出，給藥30 min后，酸乳消化液作用于小鼠，使其痛閾提高率達到最高，注射VSYSD的小鼠痛閾提高率達到59.80%；注射VSYPD的小鼠痛閾提高率達到44.37%，VSYSD的鎮(zhèn)痛效果要高于VSYPD，這與

2.4.1 節(jié)中結(jié)果相一致。

2.4.3 小鼠抗疲勞實驗結(jié)果

疲勞是人體一個極其復雜的生理狀態(tài)，一般指由于身體狀態(tài)與精神狀態(tài)的下降而導致工作能力及工作效率的衰退[29]。本實驗通過給藥后小鼠負重游泳實驗來測定酸乳酶解液中β-CM的抗疲勞作用。

表4 VSYSD對小鼠負重游泳時間的影響Table 4 Effect of VSYSD on swimming time in weight-loading mice

表4結(jié)果表明，不同酸乳消化液注射組與生理鹽水組相比，均能夠延長小鼠的負重游泳時間，注射高劑量純化后的VSYSD使小鼠的平均游泳時間延長了18.94 min。粗VSYSD、純化后VSYSD低劑量組和純化后VSYSD高劑量組與生理鹽水組相比均有顯著差異，此外注射粗VSYSD+納洛酮并沒有延長小鼠的負重游泳時間，說明納洛酮拮抗了VSYSD的作用。結(jié)果表明，VSYSD具有抗疲勞的作用，且此作用可以被阿片拮抗劑納洛酮拮抗，因此本研究中酸乳消化液的抗疲勞作用為阿片活性作用。本實驗中注射酸乳消化液的小鼠平均游泳時間均長于張建輝[21]、陳亮[30]等的研究結(jié)果，說明本實驗得到的β-CM具有更強的抗疲勞活性。酸乳β-CM作為食源性生物活性肽安全性高，是極具發(fā)展前景的功能因子，在營養(yǎng)健康領域具有很大的研究前景。

3 結(jié) 論

本實驗優(yōu)化的分離純化方法為酸乳中生物活性肽的分離提取提供了有效的手段。酸乳中存在微量β-CM-7和β-CM-5，經(jīng)過體外模擬消化后β-CM-7、β-CM-5質(zhì)量濃度顯著上升，說明酸乳經(jīng)過消化液作用后釋放出了β-CM-7、β-CM-5。此外，酸乳本身不具有阿片活性，而酸乳胃、胰消化液具有良好的阿片活性，說明人類在飲用酸乳后體內(nèi)產(chǎn)生了β-CM，且酸乳β-CM具有阿片活性，能夠?qū)θ梭w起到鎮(zhèn)靜舒緩、抗疲勞等功效；動物實驗表明VSYSD可使小鼠痛閾提高59.80%，且酸乳消化液在小鼠的體內(nèi)展現(xiàn)了良好的活性功能。本實驗為酸乳中β-CM的釋放規(guī)律及其生理功能的研究提供了有效的方法和手段，并為具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜活性功能食品的開發(fā)提供數(shù)據(jù)。