超臨界流體萃取與模擬移動床色譜純化靈芝三萜類化合物

余書奇，包曉青，梁明在*，金晨鐘，田 蔚

（1.湖南人文科技學院農(nóng)業(yè)與生物技術學院，湖南 婁底 417000；2.璞勵卓越（北京）科技有限公司，北京 100000；3.義守大學化工系，中國臺灣 高雄 84001）

靈芝作為傳統(tǒng)的中藥材具有很高的藥用價值，已經(jīng)成為保健食品的主要原料之一。研究發(fā)現(xiàn)靈芝具有調節(jié)免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等藥理功能[1]，其中靈芝三萜類化合物是靈芝的關鍵藥效成分之一，主要指標成分為靈芝酸A、靈芝酸F和靈芝醇B，現(xiàn)代藥理學研究表明靈芝三萜類化合物具有抗腫瘤、保肝護肝、抗菌消炎等功能[2-6]。因此，對靈芝中的靈芝三萜類化合物進行有效提取及純化，可拓寬靈芝產(chǎn)品多元化發(fā)展。目前，靈芝三萜類化合物的提取多采用有機溶劑提取、超聲波輔助提取等方式。而采用超臨界二氧化碳提取可提高靈芝三萜類化合物的穩(wěn)定性，并且綠色無污染，安全無毒[7-9]。研究顯示超臨界流體萃取的操作條件對產(chǎn)物中靈芝三萜類化合物的組分種類和活性有一定程度的影響[10-13]，因此本實驗優(yōu)化了超臨界流體萃取的最佳條件與方法；同時采用模擬移動床（simulated moving bed，SMB）移除粗萃物中的不純物以提高靈芝三萜類化合物含量。SMB技術是一種現(xiàn)代化精細的色譜分離技術，在固定床和真實移動床的基礎上發(fā)展而來[14-15]。該技術采用固定相與移動相連續(xù)式地逆向流動，大幅提高了固定相的使用效率，達到連續(xù)進料提高產(chǎn)量的目的[15-17]。由于其相對于傳統(tǒng)制備色譜分離技術具有能連續(xù)化操作、易實現(xiàn)自動化、分離能力強、分離效率高等特點，因而在食品科學和生物化學、醫(yī)學領域得到了越來越廣泛的應用[18-22]，目前，食品領域中SMB的應用熱點在天然產(chǎn)物的提取純化上，如鐵皮石斛[23]、白藜蘆醇[24]、紫杉醇[25]、甜葉菊苷[26]、甘草苷[27]等的純化，曾有研究者利用使用超臨界流體的SMB進行了中國臺灣牛樟芝三萜的分離純化研究[28]，但國內外尚未有SMB純化靈芝三萜類化合物的應用報道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈芝子實體由浙江壽仙谷公司提供，為赤靈芝。

靈芝酸A（＞98%）、靈芝酸F（＞98%）、靈芝醇B（＞98%）標準品 成都曼思特股份有限公司；95%乙醇景明化工股份有限公司；乙腈（色譜純） 友和貿(mào)易股份有限公司；二氧化碳30 kg（插管、高純度）錦德氣體股份有限公司。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜（ high performance liquid chromatography，HPLC，泵：2130，紫外檢測器：L-2455）儀 日本Hitachi公司；超臨界萃取設備（萃取槽體積為1 L，10.5 cm×11.1 cm） 中國臺灣金屬工業(yè)研究中心；SMB色譜（1/8不銹鋼配管，配置8 支管柱，1.0 cm×25 cm） 中國臺灣喬璞科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 超臨界流體萃取條件優(yōu)化

取1 3 7 g的靈芝子實體切粒（顆粒直徑約1～3 mm），置于萃取槽中，在350 bar、45 ℃進行萃取，每0.5 h從分離槽中取樣一次，分離槽溫度設定為50 ℃，壓力設定為45 bar，持續(xù)萃取6 h，根據(jù)萃取液中目標物含量的變化確定萃取時間?？疾鞀A帶劑對萃取結果的影響：A組不添加夾帶劑，二氧化碳流速為60 g/min，在萃取過程中同時從萃取槽出口端以5 mL/min流速泵入乙醇溶液，以避免萃取物阻塞；B組采用乙醇為夾帶劑，流速為5 mL/min，二氧化碳流速為60 g/min，在進入萃取槽前便與二氧化碳混合后再加熱，共同進入萃取槽中萃取。

1.3.2 萃取液中靈芝三萜類化合物含量的測定

采用1.3.1節(jié)B組的方式對靈芝進行萃取，所得萃取液用HPLC測定目標組分含量。分析方法參照文獻[29]：色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相按表1進行梯度洗脫，分析波長252 nm，流速1 mL/min，進樣量20 μL。繪制靈芝酸A、靈芝醇B及靈芝酸F標準曲線，所得曲線相關系數(shù)均在0.999 5以上，線性范圍在0～500 mg/L，通過內標法測定靈芝三萜類化合物的含量。

表1 流動相梯度洗脫方法Table 1 Mobile phase gradient elution program

3 種標準品的HPLC如圖1所示，靈芝酸A的保留時間為35.1 min，靈芝酸F的保留時間為53.0 min，靈芝醇B的保留時間為86.5 min。

圖1 靈芝三萜類化合物標準品液相色譜圖Fig. 1 Liquid chromatogram of triterpenoid standards

1.3.3 SMB初始參數(shù)確定

按1.3.1節(jié)B組的方法萃取靈芝，所得萃取液作為SMB的進樣原料。選取SMB系統(tǒng)8 只管柱中的1只管柱作為HPLC的分析柱，將C18填料填充于1.0 cm×25 cm的不銹鋼管柱中。采用95%乙醇溶液及0.01%鹽酸溶液作為流動相?？疾觳煌鲃酉嗯浔龋ㄒ掖既芤号c鹽酸溶液體積比為95∶5、90∶10、85∶15、50∶50、45∶55、40∶60）對分離結果的影響，從而選擇適合SMB系統(tǒng)的流動相。

1.3.4 SMB參數(shù)優(yōu)化設計

以1.3.1節(jié)B組方法所得到的萃取液為進樣原料，以C18為固定相，選擇1.3.3節(jié)最佳比例的乙醇-鹽酸溶液作為流動相。通過優(yōu)化SMB操作參數(shù)：不同的管柱設計、流動相配比及多通閥的切換時間等分離純化靈芝三萜類化合物。分離實驗共分兩組進行：第1組目的是將低極性雜質分離，第2組目的是將高極性雜質分離。

1.3.5 三角形理論

SMB參數(shù)設計主要包括各出入口端流速的設定與多通閥的切換時間，本研究SMB參數(shù)的設定以三角形理論為基礎[30-32]，“三角形理論”法是在線性條件或非線性條件下，對操作SMB快速選擇合適實驗條件的有用工具。它能用于確定最佳條件，并可通過公式在高產(chǎn)率和短切換時間上得到一個折中方案。其主要參數(shù)mj為第j區(qū)段移動相的體積流速與固體體積流速的比值，定義如下：

式中：Qj為j區(qū)段流體的體積流速；VC為空管柱體積（本研究所采用的管柱體積為11.78 mL）；tsw為所設定的多通閥切換時間周期；εt為管柱的孔隙度，即柱橫截面上流動相所占的分數(shù)，為管柱內流動相體積與柱總體積之比；Vd為死體積，即管柱中未被固定相占據(jù)的空隙體積。

本研究進一步假設εt＝0.35，并忽略死角體積Vd＝0。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及圖表繪制

SMB結果數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法：SMB系統(tǒng)平衡穩(wěn)定后，收取一個循環(huán)周期每個端口的樣品，旋轉蒸發(fā)揮干溶劑后，定容，通過液相色譜定量分析目標組分的濃度。

三角形繪制方法：通過式（2）[33-34]計算SMB中各組分的亨利常數(shù)K，假設實驗中共有兩個組分A和B，其中A組分為弱滯留性成分，B組分為強滯留性成分，所對應的亨利常數(shù)分別為KA和KB，將兩個K值標注于正方形平面的對角線上，那么平行于縱坐標且通過KA的直線與平行于橫坐標且通過KB的直線將構成一個三角形區(qū)域，該三角形區(qū)域即為理論上可以分離A和B兩組分的操作區(qū)間。依據(jù)式（1）及管柱設計形態(tài)分別求得第2段區(qū)段和第3段區(qū)段的m值，即分別為m2與m3值，然后以m2為橫坐標，m3為縱坐標將每組操作條件標在平面上。依據(jù)實驗結果則可推算出實際可分離A和B兩組分的操作區(qū)間，以下將以虛線三角形表示。

式中：t為SMB單柱實驗中組分的保留時間；t0為接管柱后系統(tǒng)的死時間；td為不接管柱時系統(tǒng)的死時間；εt為管柱的孔隙度。

2 結果與分析

2.1 超臨界萃取條件優(yōu)化結果

如圖2所示，A組僅在萃取的前0.5 h可以得到訊號較強的萃取物，但峰響應低，目標物含量低，因此單獨使用超臨界二氧化碳無法有效地萃取靈芝子實體中的三萜類化合物。對比圖2中A、B組可發(fā)現(xiàn)，兩者的HPLC圖譜的信號數(shù)量與峰形極其相似，說明此兩種萃取方式所得到的產(chǎn)物基本一致。B組中各組分的響應值明顯高于A組，表明添加乙醇作為夾帶劑更能有效地萃取出靈芝三萜類化合物。這可能是因為靈芝三萜類化合物的極性偏高，更易溶于添加乙醇溶液的超臨界二氧化碳中。因此，后續(xù)SMB實驗中的進料選擇B組方式進行萃取。

圖2 A組（不添加夾帶劑）和B組（添加乙醇為夾帶劑）萃取液的液相色譜圖Fig. 2 Liquid chromatograms of extracts A (without co-solvent) and B(with co-solvent)

2.2 粗萃物中靈芝三萜類化合物含量分析

由圖2B可看出，萃取2 h后大部分物質已基本萃取完全。取萃取前3 h中每0.5 h所收集的萃取液進行定量濃縮，干燥后可得到每0.5 h粗萃物的量，再根據(jù)目標物的濃度可算出每0.5 h粗萃物中目標物的質量分數(shù)，如表2所示。計算結果表明2-4之后的樣品中靈芝酸A、靈芝酸F及靈芝醇B的質量分數(shù)均為0或極少，即萃取2 h后目標組分已萃取完全，這與圖2B結果一致。將前2 h收集到的萃取液混合，揮干溶劑共收集得到1.30 g，代表每千克子實體可以萃取到9.49 g的粗萃物。同時依據(jù)表2所得質量濃度，可計算得出3 種目標成分在粗萃物中的質量分數(shù)：靈芝酸A為4.50%，靈芝酸F為3.39%，靈芝醇B為0.29%。

表2 超臨界二氧化碳混合乙醇萃取靈芝三萜類化合物含量Table 2 Contents of triterpenoids extracted by supercritical CO2 extraction using ethanol as co-solvent

2.3 SMB初始參數(shù)確定

單柱實驗中，不同流動相配比（95%乙醇溶液與0.01%鹽酸溶液體積比為95∶5、90∶10、85∶15、50∶50、45∶55、40∶60）的分離色譜圖如圖3所示。通過色譜圖可見，乙醇溶液比例高于85%時，可有效地將樣品中的所有物質脫附下來，但是當乙醇溶液比例低于50%時，便無法將全部樣品脫附。因此若使用低比例乙醇溶液的流動相，在組態(tài)設計上需要加入潤洗的操作，且潤洗操作時的流動相需提高乙醇溶液的比例，才能使固定相成功再生。依據(jù)這些單柱層析圖譜結果，本研究設計出2 組SMB分離實驗，通過去除粗萃液中高極性和低極性雜質，達到純化靈芝三萜類化合物的目的。其中，第1組SMB的實驗以加入0.01%鹽酸的乙醇溶液作為流動相，第2組SMB的分離則以體積比例為40∶60的乙醇溶液與鹽酸（0.01%）混合溶液作為流動相。

圖3 不同流動相的單柱分離色譜圖Fig. 3 Chromatograms for single column separation with different mobile phases

2.4 第1組SMB分離實驗與結果

傳統(tǒng)的SMB共有4 個區(qū)段組成，其中第4區(qū)段主要是利用固體吸附劑將殘留在移動相中的弱滯留性物質成分清除干凈，避免被移動相帶出床體之外繼續(xù)循環(huán)而導致污染。由于本實驗中靈芝粗萃液中的成分種類多而復雜，因此在組態(tài)設計上選擇開放式系統(tǒng)，并且刪除第4區(qū)段，以不回流移動相的方式解決弱滯留成分可能循環(huán)累積在系統(tǒng)的問題，如圖4所示。設定SMB組態(tài)為2/3/3，其中共有2 個入口，即進料端（F端）、移動相端（D端），以及2 個出料口，即萃出液端（E端）、萃余液端（R端）。設定各進出口端的流速為D端5 mL/min，F(xiàn)端0.5 mL/min，E端2.083 mL/min，R端3.417 mL/min。

圖4 第1組SMB實驗的管柱組態(tài)設計Fig. 4 SMB column configuration design for experimental group 1

當系統(tǒng)達穩(wěn)態(tài)操作后，在2個出口端收集樣品并分析。在固定流速的情況下，實驗進行了不同切換時間的測試，由表3可知，在切換時間為3.4 min時移除強滯留性的雜質效果最佳。且在該條件下，3 種目標物的質量分數(shù)相應提高，靈芝酸A提高至5.70%，靈芝酸F提高至4.17%，靈芝醇B提高至0.85%。由于所增加的質量分數(shù)有限，推測是因為低極性雜質的含量不多，所以指標成分質量分數(shù)增加有限。

表3 不同切換時間的SMB分離結果（第1組）Table 3 Results of SMB separation at different switching times in experimental group 1

依據(jù)式（1）分別求得m2與m3值，然后以m2為橫坐標，m3為縱坐標繪圖所構成的平面圖稱其為（m2，m3）平面。如果將SMB實驗所進行的操作條件分別標示在（m2，m3）平面上，如圖5所示，圖中實線構成的直角三角形代表三角形理論計算能夠分離低極性雜質的操作區(qū)間，其中三萜類化合物與雜質的等溫吸附常數(shù)分別為0.743與1.107。依據(jù)表3可見，在切換時間周期大約為3.3～3.5 min之間，可以有效移除弱滯留性成分，并依循Yu Hongwei等[33]提出建立最佳操作條件的方法，本研究繪制出圖5虛線所構成的三角形。該虛線構成的三角形頂點坐標為（0.759，1.014），如果在此操作條件下進行，假設切換時間設為1.0 min，那么其各出入口端的流量設定分別為D端12.6 mL/min，F(xiàn)端1.677 mL/min，E端2.389 mL/min，R端11.888 mL/min。若按照最佳條件的流速設定SMB各進出口的流速，以同樣的進料質量濃度3 937 mg/L進行實驗，那么可預測此SMB設備平均每天每升填料的處理量，即本SMB系統(tǒng)在移除低極性雜質時固定相的效率為0.061 kg/（L·d）。

圖5 第1組SMB分離實驗三角形理論預測Fig. 5 Triangle theory prediction of SMB separation in experimental group 1

2.5 第2組SMB分離實驗與結果

用1.3.1節(jié)B組方法所得到的萃取液進行濃縮，并取濃縮溶液400 mL，再加入600 mL的0.01%鹽酸，過濾后得第2次進料溶液。如圖6所示，本組SMB分離實驗設定SMB組態(tài)為1-1-3/3，其中共有4 個入口，即進料端（F端）、移動相端（D端）、清洗端（Wash端）、潤洗端入口（Rinse1端）以及3 個出料口，即萃余液端（R端），清洗端出口（W端），潤洗端出口（Rinse 2端）。移動相使用乙醇-鹽酸體積比40∶60，清洗端則使用添加0.01%鹽酸的乙醇溶液，并設定各進出口端的流速為D端3.8 mL/min，F(xiàn)端0.3 mL/min，R端4.1 mL/min，Wash端5 mL/min，Rinse1端5 mL/min。

圖6 第2組SMB實驗的管柱組態(tài)設計Fig. 6 SMB column configuration design for experimental group 2

根據(jù)表4可知，在切換時間為34 min時，R出口端目標組分未有響應，但根據(jù)干質量結果可知R出口端分離出大量物質，但在本分析方法的檢測波長下無法測出。同時根據(jù)Wash端的含量計算結果發(fā)現(xiàn)3 種目標物質量分數(shù)大幅度提高，其中靈芝酸A質量分數(shù)為19.34%，靈芝酸F質量分數(shù)為15.51%，靈芝醇B質量分數(shù)為0.74%。這代表大部分的三萜類化合物成分是高極性雜質，少部分為第1組SMB所分離出的低極性雜質。因此針對超臨界流體萃取所得的粗萃物，提高三萜類化合物含量的重點在移除高極性的雜質。

表4 不同切換時間的SMB分離結果（第2組）Table 4 Results of SMB separation at different switching times in experimental group 2

同樣如果將第2組SMB分離實驗所進行的操作條件分別標示在（m2，m3）平面上，如圖7所示。根據(jù)表4結果可判定分離的切換時間周期在34～35 min之間，據(jù)此繪出圖中虛線構成的三角形，并計算出其頂點坐標為（6.133，7.662）。如果在此操作條件下進行，假設切換時間設定為1.0 min，那么其各出入口端的流量設定分別為D端64.8 mL/min，F(xiàn)端11.709 mL/min，E端13.712 mL/min，R端62.796 mL/min，并以進料濃度3 937 mg/L進行實驗，預測此本SMB系統(tǒng)在移除高極性雜質時固定相的效率為0.423 kg/（L·d）。

圖7 第2組SMB分離實驗三角形理論預測Fig. 7 Triangle theory prediction of SMB separation in experimental group 2

3 結 論

SFE在加入乙醇作為夾帶劑后可有效從靈芝子實體萃取出靈芝三萜類化合物，且萃取物中三萜類化合物含量高。SMB的實驗顯示：使用酸性流動相可以有效移除非三萜成分；靈芝粗萃液中高極性雜質含量較低極性雜質含量多。SMB可有效地移除靈芝粗萃液中的雜質，靈芝三萜類化合物從進料溶液中質量分數(shù)為8.51%提高至35.59%，大幅提高了靈芝酸的質量分數(shù)。輔以三角形理論所建立的最佳操作條件，預測了本SMB系統(tǒng)在移除低極性雜質時固定相的效率為0.061 kg/（L·d），而移除高極性雜質時固定相的效率為0.423 kg/（L·d）。