角鯊烯/γ-環(huán)糊精包合物制備及分子模擬

張光杰，谷令彪，周民生，袁 超，劉金洲

（1.安陽工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，河南 安陽 455000；2.齊魯工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250353）

角鯊烯又名鯊烯、三十碳六烯、魚肝油萜，化學(xué)名為2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯，由Tsujimoto于1906年在黑鯊魚肝油中發(fā)現(xiàn)，是一種高度不飽和烴類化合物[1]。在常溫下，角鯊烯為油狀的無色液體，不溶于水，難溶于冰醋酸、乙醇和甲醇，易溶于四氯化碳、乙醚、丙酮、石油醚等有機(jī)溶劑，因其含6 個(gè)非共軛雙鍵，因此極不穩(wěn)定，很容易氧化。角鯊烯具有提高體內(nèi)超氧化物歧化酶活性、增強(qiáng)機(jī)體免疫能力、改善性功能、抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤等多種生理功能[2]，因此，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品和食品行業(yè)[3]，但由于其水溶性較差、易被氧化等，使其在具體應(yīng)用過程中受到了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。雖然已有膠囊產(chǎn)品問世，但多數(shù)以保健品形式銷售，產(chǎn)品品種單一。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)可以通過環(huán)糊精分子包埋技術(shù)改善其水溶性并已成功應(yīng)用于營養(yǎng)果凍的研發(fā)制作。

環(huán)糊精是由環(huán)糊精葡萄糖殘基轉(zhuǎn)移酶[4]作用于淀粉、糖原、麥芽寡聚糖等葡萄糖聚合物后形成的由6～12 個(gè)D-吡喃葡萄糖基以α-1,4-糖苷鍵連接而成的低聚糖，由于其具有內(nèi)疏水外親水的特性，所以可通過氫鍵、范德華力、疏水作用等分子間作用力與多種有機(jī)化合物形成包合物，并可改變被包合物的物理及化學(xué)性質(zhì)。常見的環(huán)糊精種類主要有α-、β-、γ-環(huán)糊精。其中，γ-環(huán)糊精因其分子內(nèi)腔空間較大而被廣泛應(yīng)用于食品及醫(yī)藥[5-7]等領(lǐng)域。而有關(guān)環(huán)糊精包埋角鯊烯的文獻(xiàn)鮮有報(bào)道，已有研究制備了角鯊烯/環(huán)糊精包合物[8]，但是并未對其包合機(jī)理進(jìn)行相關(guān)研究。

鑒于此，本實(shí)驗(yàn)通過水溶液法結(jié)合冷凍干燥法制備角鯊烯/γ-環(huán)糊精包合物，并對其進(jìn)行相溶解度、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）分析、氫譜核磁共振（hydrogen nuclear magnetic resonance，1H NMR）分析及分子模擬，以期探索包合物的形成機(jī)理，改善角鯊烯在水溶性環(huán)境中的溶解效果，并為擴(kuò)大角鯊烯的應(yīng)用范圍提供理論依據(jù)及參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%） 北京寰宇科創(chuàng)生物科技發(fā)展有限公司；γ-環(huán)糊精（純度＞99.0%） 東京化成工業(yè)株式會(huì)社；正己烷（色譜純） 天津賽孚瑞科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

2010-Plus氣相色譜儀（配有氫火焰離子檢測器和色譜工作站） 日本島津企業(yè)管理有限公司；Tensor II FTIR儀、AM-400型1H NMR分析儀 德國布魯克科技有限公司；FA2004B電子天平 上海佑科儀器儀表有限公司；KQ-200VDE型三頻數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；TH70-85-2磁力攪拌器 余姚市東方電工儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 包合物的制備

采用水溶液法參考相關(guān)文獻(xiàn)[9]制備包合物。稱量一定量的γ-環(huán)糊精溶于25 mL蒸餾水中，使其形成40 mmol/L的γ-環(huán)糊精溶液，將角鯊烯緩慢滴加在γ-環(huán)糊精溶液中（參照文獻(xiàn)[8]按照主客物質(zhì)的量比為3∶1添加）并超聲振蕩15 min。在40 ℃條件下磁力攪拌72 h即可得到包合物溶液。靜置1 h，用吸油紙去除溶液表面未包合的角鯊烯油滴，置于-60 ℃、100 Pa條件下凍干，得到角鯊烯/γ-環(huán)糊精包合物粉末。

1.3.2 包合物的表征

1.3.2.1 相溶解度測定

參照相關(guān)文獻(xiàn)[10-11]對包合物進(jìn)行相溶解度測定。稱取一定量的γ-環(huán)糊精溶于25 mL蒸餾水中，分別配制濃度為0、10、20、30 mmol/L和40 mmol/L的環(huán)糊精溶液，并按主客物質(zhì)的量比1∶1.5的比例向其中滴加過量的角鯊烯，超聲振蕩15 min，分別在25、40 ℃及55 ℃條件下磁力攪拌72 h，得到包合物溶液。取5 mL包合物溶液，向其中加入10 mL正己烷，超聲萃取10 min。靜置后經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過濾后用氣相色譜檢測得到包合物中角鯊烯含量。

氣相色譜條件參照相關(guān)文獻(xiàn)[12-14]，具體條件如下：Rtx-5毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：150 ℃維持1 min，15 ℃/min升溫至250 ℃維持12 min；載氣為99.999% N2，空氣流速400 mL/min，氫氣流速40 mL/min，分流比1∶10；進(jìn)樣口溫度250 ℃；進(jìn)樣口壓力204 kPa；氫火焰離子檢測器溫度290 ℃；進(jìn)樣量1 μL；定量方法為峰面積歸一化外標(biāo)法。

以環(huán)糊精的濃度為橫坐標(biāo)，角鯊烯的溶解度為縱坐標(biāo)，繪制相溶解圖，并計(jì)算包合常數(shù)、增溶因子（S/S0，S及S0分別為角鯊烯在環(huán)糊精溶液及水中的溶解度）[15]及熱力學(xué)參數(shù)，按式（1）～（3）計(jì)算：

式（1）中：K為包合常數(shù)/（L/mol）；k為相溶解度圖中線性回歸方程的斜率；d為相溶解度圖中線性回歸方程的截距/（mmol/L）。

式（2）中：ΔG為反應(yīng)的吉布斯自由能/（J/mol）；Δ H為反應(yīng)的焓變/（J/m o l）；R為氣體常數(shù)，8.314 J/（K·mol）；T為熱力學(xué)溫度/K；ΔS為反應(yīng)的熵變/（J/（K·mol））。

根據(jù)式（3），將lnK對1/T作圖，通過線性擬合得到直線的截距可計(jì)算ΔS。

1.3.2.2 FTIR分析

將約1 mg樣品（γ-環(huán)糊精和角鯊烯/γ-環(huán)糊精包合物）置于盛有約100 mg干燥溴化鉀的瑪瑙研缽中充分混合并研磨成細(xì)粉末。然后將樣品裝入模具中壓成片狀，并置于FTIR儀中進(jìn)行測試。通過向溴化鉀片劑中加入1滴角鯊烯制備角鯊烯片劑樣品。

1.3.2.31H NMR分析

用核磁共振波譜儀在500 MHz、25 ℃條件下記錄1H NMR譜。將角鯊烯、包合物和γ-環(huán)糊精分別溶解在氘代二甲基亞砜中，置于內(nèi)徑為5 mm的核磁管中，分別進(jìn)行測試。并根據(jù)包合物1H NMR圖譜中呈現(xiàn)的各基團(tuán)圖譜的積分面積計(jì)算包合物中主客物質(zhì)的量比[16-17]。

1.3.3 分子模擬

用Hyperchem8.0構(gòu)建角鯊烯、γ-環(huán)糊精及不同主客物質(zhì)的量比（1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1）包合物的分子結(jié)構(gòu)模型，并選擇PM3方法用共軛梯度優(yōu)化器對各分子模型的能量進(jìn)行最小化運(yùn)算，直到得到0.01 kcal/（mol·?）的均方根值[18]。模擬條件為300 K，1 個(gè)大氣壓，最小能量模型的ΔE按式（4）計(jì)算：

式中：E主、E客和E包分別為γ-環(huán)糊精、角鯊烯和包合物的計(jì)算能量/（kcal/mol）。

2 結(jié)果與分析

2.1 相溶解度分析

圖1 角鯊烯在不同溫度下γ-環(huán)糊精溶液中的相溶解圖Fig. 1 Phase dissolution diagrams of squalene in γ-cyclodextrin solutions at different temperatures

由圖1可知，在25、40 ℃及55 ℃下，在0～40 mmol/L范圍內(nèi)，角鯊烯在γ-環(huán)糊精溶液中的相溶解圖為AL型[19]，即形成的包合物主客物質(zhì)的量比為1∶1，不同于文獻(xiàn)[8]報(bào)道的γ-環(huán)糊精與角鯊烯可形成主客比近似為2.68∶1的包合物，這可能與包合物制備條件不同有關(guān)。

表1 角鯊烯在不同溫度下γ-環(huán)糊精溶液中的包合常數(shù)、增溶因子及熱力學(xué)參數(shù)Table 1 Inclusion constants, solubilization factors and thermodynamic parameters of squalene in γ-cyclodextrin solution at different temperatures

包合過程是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過程，即包合與解離同時(shí)存在。而包合常數(shù)K值是決定包合物性質(zhì)的一個(gè)重要參數(shù)，其大小能夠反映環(huán)糊精和角鯊烯形成包合物過程中結(jié)合力的強(qiáng)弱，所以，K值可對包合過程作出定量描述。一般K值越大說明環(huán)糊精的包合效果越明顯，增大客體分子溶解度的能力越強(qiáng)。由表1可看出，包合常數(shù)K隨著溫度的升高而增大，表明所形成的包合物越來越穩(wěn)定，這是由于分子熱運(yùn)動(dòng)隨溫度的升高變得更加劇烈，有利于角鯊烯進(jìn)入環(huán)糊精的空腔內(nèi)，從而使反應(yīng)向有利于包合的方向進(jìn)行，這與相關(guān)研究[20-21]結(jié)論一致。

通過比較表1中各增溶因子可知，在本實(shí)驗(yàn)條件下，γ-環(huán)糊精對角鯊烯的增溶效果隨溫度的升高和濃度的增加而增強(qiáng)，且最大可使角鯊烯的溶解度提高為原來的309 倍。這個(gè)結(jié)果可能與溫度升高使分子運(yùn)動(dòng)更加劇烈及環(huán)糊精濃度增加使主客體包合的幾率增加有關(guān)。

由表1可看出，ΔH為正值，表明包合反應(yīng)為吸熱反應(yīng)，ΔS為正值，表明包合過程是無序化程度升高的熵增加的過程。由熱力學(xué)第2定律可得，當(dāng)環(huán)糊精的空腔容納疏水性客體分子前需要脫去水殼，此時(shí)會(huì)釋放結(jié)合水，進(jìn)而被客體分子取代，這個(gè)過程會(huì)引起熵的正變，說明疏水作用在整個(gè)包合過程中起著重要作用[22]。此外，該過程是吸熱反應(yīng)，但客體分子與環(huán)糊精空腔內(nèi)壁之間通過范德華力和分子間氫鍵力的相互作用是放熱反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中，熵增加期間吸收的熱量可能大于主-客體絡(luò)合反應(yīng)釋放的熱量，從而導(dǎo)致正焓變[23-24]，即溫度升高所帶來的無序化增加較之包合過程釋放的反應(yīng)熱而引發(fā)的焓變更為明顯，因此，熵增加對整個(gè)包合反應(yīng)的影響更大些。ΔG為負(fù)值表明包合反應(yīng)是一個(gè)自發(fā)過程[25]，ΔG隨著溫度的升高而呈負(fù)增加，表明溫度的升高增加了形成包合物的自發(fā)傾向，而溫度升高也是增加無序化（熵增加）的過程。因此，從能量變化可以推斷，無序化增加（熵增加）是角鯊烯分子進(jìn)入環(huán)糊精空腔的主要驅(qū)動(dòng)力。

2.2 FTIR分析

圖2 角鯊烯（A）、包合物（B）及γ-環(huán)糊精（C）的FTIR圖譜Fig. 2 FTIR spectra of squalene (A), inclusion complex (B) and γ-cyclodextrin (C)

FTIR可通過分子的振動(dòng)和旋轉(zhuǎn)躍遷識別和分析化合物。主體和客體分子的IR吸收峰的變化可以提供關(guān)于包合物形成的重要信息。

如圖2A線所示，2 968 cm-1和2 853 cm-1處非常強(qiáng)的吸收峰為—CH3的伸縮振動(dòng)峰，2 919 cm-1處為—CH2—的不對稱伸縮振動(dòng)峰，1 669 cm-1處為＝CH—的伸縮振動(dòng)峰，1 444 cm-1處為與雙鍵相連的CH2的變形振動(dòng)峰，1 381 cm-1處為—CH3中C—H的變形振動(dòng)峰，836 cm-1處為＝CH—中C—H的非平面搖擺振動(dòng)峰，上述結(jié)果與文獻(xiàn)[26]報(bào)道一致。

另外，包合物的紅外光譜（圖2B線）與γ-環(huán)糊精（圖2C線）非常相似。γ-環(huán)糊精的主要特征吸收峰有：3 384 cm-1左右為γ-環(huán)糊精上—OH的伸縮振動(dòng)；2 926 cm-1為—CH3及—CH2—中C—H的伸縮振動(dòng)；1 645 cm-1左右為結(jié)合水的振動(dòng)；1 367、1 336、1 304 cm-1為—CH3及—CH2—中C—H的彎曲振動(dòng)；1 156 cm-1左右為C—O—C的反對稱伸縮振動(dòng)；1 079、1 026 cm-1左右為C—C或C—O的伸縮振動(dòng)，此結(jié)果與文獻(xiàn)[27]報(bào)道相符。而在包合物的紅外譜圖中角鯊烯的部分特征吸收峰（2 919、1 669 cm-1及1 444 cm-1）消失，這些譜帶由于與更強(qiáng)的γ-環(huán)糊精譜帶重疊而被掩蓋。然而，在836 cm-1處的吸收峰表現(xiàn)出強(qiáng)度降低及輕微的偏移，這可能與角鯊烯分子中雙鍵上的C—H的非平面搖擺振動(dòng)在包含物形成后受限制并且包合物中的客體含量較低有關(guān)。上述信息表明角鯊烯分子中的雙鍵進(jìn)入γ-環(huán)糊精的空腔，間接證實(shí)了角鯊烯被γ-環(huán)糊精成功包埋。

2.3 1H NMR分析

1H NMR可以提供關(guān)于客體分子在環(huán)糊精腔內(nèi)空間位置的有價(jià)值的信息。H-3和H-5是環(huán)糊精腔內(nèi)壁中的質(zhì)子，當(dāng)客體分子進(jìn)入環(huán)糊精空腔時(shí)，由于客體分子與環(huán)糊精疏水內(nèi)腔之間的相互作用，會(huì)使H-3和H-5質(zhì)子的化學(xué)位移發(fā)生變化[28]。結(jié)合圖3、表2可以看出，角鯊烯分子進(jìn)入γ-環(huán)糊精分子空腔后，γ-環(huán)糊精的質(zhì)子發(fā)生明顯的化學(xué)位移，角鯊烯的質(zhì)子在包合物的圖譜上峰高和峰面積也發(fā)生很大變化。γ-環(huán)糊精的質(zhì)子H-3和H-5、OH-2和OH-3及OH-6均發(fā)生明顯偏移，分析原因可能是包合物形成后，角鯊烯分子進(jìn)入γ-環(huán)糊精空腔內(nèi)部，由于客體分子雙鍵環(huán)電流的影響使得位于γ-環(huán)糊精空腔內(nèi)壁的H-3和H-5電子屏蔽作用減小，移向低場，化學(xué)位移值增大，且二者化學(xué)位移相差不大，可見角鯊烯分子進(jìn)入γ-環(huán)糊精空腔內(nèi)的入口（大口端或小口端）是沒有明確的選擇性的[29-30]。同時(shí)由于角鯊烯分子上雙鍵的屏蔽效應(yīng)，使得OH-2、OH-3及OH-6周圍的電子云密度增加，化學(xué)位移減小，移向高場，這些變化表明包合物已成功形成。結(jié)合上述紅外光譜分析結(jié)果及角鯊烯的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可以推測角鯊烯的部分雙鍵結(jié)構(gòu)進(jìn)入γ-環(huán)糊精空腔內(nèi)部。而對于H-2和H-4，由于δ3.3附近水分的強(qiáng)質(zhì)子峰（可能與樣品未充分干燥有關(guān)）的存在覆蓋了H-2和H-4的質(zhì)子信號，無法對其進(jìn)行準(zhǔn)確分析。

圖3 角鯊烯（A）、包合物（B）及γ-環(huán)糊精（C）的1H NMR圖譜Fig. 3 1H NMR spectra of squalene (A), inclusion complex (B) and γ-cyclodextrin (C)

表2 γ-環(huán)糊精及角鯊烯分子中特征基團(tuán)的化學(xué)位移Table 2 Chemical shifts of characteristic groups in γ-cyclodextrin and squalene molecules

另根據(jù)包合物1H NMR圖譜中呈現(xiàn)的各基團(tuán)圖譜的積分面積計(jì)算包合物中主客物質(zhì)的量比約為3.45∶1，此結(jié)果既不同于上述相溶解度結(jié)果顯示的1∶1，也不同于相關(guān)文獻(xiàn)[8]報(bào)道的2.68∶1。這進(jìn)一步印證了環(huán)糊精分子包合客體分子是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過程，不同的客體分子結(jié)構(gòu)、主客體的相對用量、不同的包合條件都會(huì)影響到包合物的分子結(jié)構(gòu)。上述主客物質(zhì)的量比差異可能是由于分子結(jié)構(gòu)呈鏈狀的角鯊烯分子在溶液環(huán)境中的分子熱運(yùn)動(dòng)很容易進(jìn)入γ-環(huán)糊精相對寬廣的內(nèi)腔，但是也很容易“溜走”，即包合解離同時(shí)存在，并且相溶解度實(shí)驗(yàn)中角鯊烯過量，因此更多的包合物主客物質(zhì)的量比近似為1∶1形式；而本研究中用于1H NMR分析的角鯊烯/γ-環(huán)糊精包合物樣品在制備過程中是按照主客物質(zhì)的量比3∶1添加的，可以有更多γ-環(huán)糊精空腔可供選擇，且一旦形成多個(gè)環(huán)糊精分子包合同一個(gè)角鯊烯分子的包合物結(jié)構(gòu)，相對于主客物質(zhì)的量比1∶1的包合物要穩(wěn)定一些，另3.45∶1的主客物質(zhì)的量比為平均值，說明形成的包合物是含有多個(gè)主客物質(zhì)的量比的混合物；與文獻(xiàn)[8]報(bào)道的2.68∶1的差異主要與包合物的制備條件（主客物質(zhì)的量比、包合時(shí)間、溫度、主客體攪拌的激烈程度等）差異有關(guān)。

2.4 分子模擬結(jié)果

圖4 角鯊烯（A）、γ-環(huán)糊精（B）及不同主客物質(zhì)的量比的包合物分子（C～F）模擬模型Fig. 4 Molecular simulation models of squalene (A), γ-cyclodextrin (B)and inclusion complex (C-F) with different host to guest molar ratios

表3 不同主客物質(zhì)的量比包合物的最小能量模型的ΔETable 3 ΔE of minimum energy model for inclusion complexes with different host to guest molar ratios kcal/mol

目前，基于分子力學(xué)的分子模擬已被廣泛應(yīng)用于表征包合物與環(huán)糊精的三維結(jié)構(gòu)[31]。通過上述FTIR和1H NMR分析，可以基本確定角鯊烯/γ-環(huán)糊精包合物的主客體分子結(jié)合形式，角鯊烯鏈狀分子通過大口端（或小口端）進(jìn)入γ-環(huán)糊精空腔，且部分雙鍵位于γ-環(huán)糊精的H-3及H-5附近，而其余長鏈部分位于空腔外。通過Hyperchem 8.0構(gòu)建并優(yōu)化的角鯊烯和γ-環(huán)糊精的結(jié)構(gòu)見圖4A、B，不同主客物質(zhì)的量比的包合物分子模型及其ΔE分別見圖4C～F及表3。結(jié)果表明，角鯊烯分子呈稍彎曲的鏈狀時(shí)較為穩(wěn)定，且隨著主客物質(zhì)的量比的增加，角鯊烯分子將γ-環(huán)糊精分子均勻地“串聯(lián)”在一起形成包合物分子，包合物的ΔE逐漸降低，分子結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定，但是當(dāng)主客比增加到5∶1時(shí)，E包及ΔE突然增大為正值，且包合物分子模型中主客體相互遠(yuǎn)離（圖4未顯示），包合物變得不穩(wěn)定。究其原因可能是由于雖然角鯊烯鏈狀分子可以同時(shí)“串聯(lián)”多個(gè)γ-環(huán)糊精分子，但是當(dāng)“串聯(lián)”的γ-環(huán)糊精分子過多時(shí)會(huì)導(dǎo)致相鄰的環(huán)糊精分子間斥力增大，而主客體結(jié)合的作用力又比較弱，導(dǎo)致分子間距離突然增大，并影響到整個(gè)包合物的穩(wěn)定。因此，從分子模擬角度而言，最佳主客物質(zhì)的量比為4∶1，這與上述1H NMR圖譜積分分析的的結(jié)果（3.45∶1）較為接近。

3 結(jié) 論

應(yīng)用水溶液法結(jié)合冷凍干燥法制備角鯊烯/γ-環(huán)糊精包合物，并通過相溶解度、FTIR、1H NMR分析及分子模擬對γ-環(huán)糊精包合角鯊烯的機(jī)理進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，角鯊烯被γ-環(huán)糊精成功包埋，且在客體分子過量的情況下，可與γ-環(huán)糊精形成主客物質(zhì)的量比1∶1的包合物，而當(dāng)γ-環(huán)糊精過量時(shí)，可形成主客物質(zhì)的量比3.45∶1的包合物。相溶解度及熱力學(xué)參數(shù)分析結(jié)果表明，γ-環(huán)糊精對角鯊烯增溶效果明顯，最大可提高至原來的309 倍；包合常數(shù)隨溫度升高而增大，整個(gè)包合過程釋放的反應(yīng)熱較小，呈自發(fā)的吸熱反應(yīng)，溫度升高導(dǎo)致的無序化增加（熵增加）是包合反應(yīng)的主要驅(qū)動(dòng)力。分子模擬結(jié)果表明，包合物的分子結(jié)構(gòu)為角鯊烯鏈狀分子將γ-環(huán)糊精環(huán)狀分子均勻地“串聯(lián)”在一起，且最佳主客物質(zhì)的量比為4∶1，但大于4∶1后包合物分子結(jié)構(gòu)突然變得不穩(wěn)定，具體機(jī)理仍有待進(jìn)一步研究。本研究對于進(jìn)一步闡明環(huán)糊精包合角鯊烯的機(jī)理具有重要的指導(dǎo)意義，并可為擴(kuò)大角鯊烯在食品、化妝品及醫(yī)藥等領(lǐng)域水溶性環(huán)境中的應(yīng)用提供理論依據(jù)及參考。