35株臨床分離的大腸埃希菌耐藥性與tem基因的鑒別

虞春華 高建華 潘斌輝 楊林 柯慧

摘 要 目的：對(duì)臨床分離的大腸埃希菌的耐藥性與編碼TEM型β-內(nèi)酰胺酶基因（簡(jiǎn)稱tem基因）的研究情況進(jìn)行分析探討，為今后的臨床治療工作提供有價(jià)值的參考依據(jù)。 方法：選擇2017年6月—2018年6月間送檢的臨床標(biāo)本作為研究對(duì)象，對(duì)其采用全自動(dòng)微生物鑒定藥敏分析儀進(jìn)行分離鑒定及藥敏分析，并對(duì)其中的35株耐藥大腸埃希菌展開(kāi)tem 基因及 tem-1、tem-2 基因亞型檢測(cè) 。結(jié)果：藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，35株大腸埃希菌對(duì)氨芐西林的耐藥率為100.0%、對(duì)頭孢唑林的耐藥率為74.3%、對(duì)頭孢呋辛的耐藥率為 71.4%。經(jīng)PCR擴(kuò)增檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，它們均為tem基因陽(yáng)性。結(jié)論：目前臨床上分離的大腸埃希菌存在嚴(yán)重的耐藥性，tem基因攜帶率高，在今后的臨床用藥過(guò)程中，應(yīng)對(duì)其給予足夠的重視。

關(guān)鍵詞 大腸埃希菌 耐藥性 tem基因

中圖分類號(hào)：R181.32 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2019）17-0047-03

Study on drug resistance and tem gene of 35 clinical isolates of Escherichia coli*

YU Chunhua1**， GAO Jianhua1， PAN Binhui2， YANG Lin1， KE Hui3（1. Department of Pathogens and Immunology， Jiangxi Medical College；2. Computer Teaching and Research Department of Jiangxi Medical College；3. Laboratory Department， the Peoples Hospital of Shangrao， Jiangxi Shangrao 334000， China）

ABSTRACT Objective： To analyze the drug resistance of clinical isolates of Escherichia coli and the genes coding for TEM type b-lactamase （tem gene）， and provide valuable reference for future clinical treatment. Methods： Clinical specimens obtained from June， 2017 to June， 2018 were selected as subjects. The analysis of isolates and drug sensitivity were performed by automatic microbial identification drug sensitivity analyzer and gene identification of 35 resistant E.coli strains were carried out by PCR amplification. Results： The drug sensitivity test showed that the ratio of resistance strains against ampicillin reached to100.0% in 35 strains of Escherichia coli detected， in which the resistance rate accounted for 74.3% to cefazolin， and 71.4% to cefuroxime. They all were tem gene positive by PCR amplification. Conclusion： The clinically isolated Escherichia coli has serious drug resistance and high tem gene-carrying rate at present， to which great attention should be paid in the future clinical medication.

KEy WORDS Escherichia coli； drug resistance； tem gene

大腸埃希菌是寄居在人和動(dòng)物腸道中的菌群，生物學(xué)性狀與革蘭陰性菌相似，在遺傳學(xué)上與腸桿菌屬于親緣關(guān)系，在自然界是廣泛存在的，屬于條件致病菌[1]。若是機(jī)體免疫力低下或者是細(xì)菌侵入，會(huì)導(dǎo)致大腸埃希菌成為致病菌，誘發(fā)腸道外感染、消化道感染、呼吸道感染、泌尿系統(tǒng)感染、敗血癥等，范圍比較廣泛。大腸埃希菌為臨床常見(jiàn)的一種革蘭陰性菌，位居腸桿菌科細(xì)菌分離的第一位，會(huì)增加醫(yī)源感染發(fā)生率，對(duì)一些臨床常用的抗菌藥物呈現(xiàn)出明顯的多重耐藥性[2]。本次研究中，以對(duì)臨床分離的大腸埃希菌的耐藥性與tem基因的研究情況進(jìn)行分析探討為目的，對(duì)我院收集到的送檢標(biāo)本進(jìn)行了細(xì)菌分離、鑒定以及tem基因檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果匯報(bào)如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

菌株來(lái)源于2017年6月至2018年6月間我院收集的送檢標(biāo)本，包括中段尿、血液、痰、分泌物、膿液、胸腹水等。取標(biāo)本接種于麥康凱及 SS 平板培養(yǎng)，革蘭染色鏡檢進(jìn)行初篩，以全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程為依據(jù)，凡符合氧化酶陰性、發(fā)酵葡萄糖的菌株，接種腸桿菌科細(xì)菌生化編碼鑒定管 （ GYZ-11e） 鑒定大腸埃希菌，保存于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面。選擇分離出的35株大腸埃希菌展開(kāi)tem基因檢測(cè)，無(wú)重復(fù)菌株。

1.2 儀器與試劑

ABI 9700型PCR擴(kuò)增儀（Techne公司）； 凝膠成像分析系統(tǒng)（上海領(lǐng)成生物科技有限公司）；Vitek2-Compact全自動(dòng)微生物鑒定藥敏分析儀（法國(guó)BioMérieux公司）。

1.3 菌株鑒定與藥敏試驗(yàn)

菌株經(jīng)Del96Ⅱ全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定和藥敏分析。

1.4 基因擴(kuò)增

從GenBank尋找并下載tem-1、tem-2 和tem 基因序列，通過(guò)DNA序列比對(duì)找到其共有序列，并設(shè)計(jì)引物：P1：5-GAGTATTCAACATTTCCGTGTC-3，P2： 5-TAATCAGTGAGGCACCTATCTC-3 ，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為535 bp。PCR擴(kuò)增試劑購(gòu)自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，引物合成也委托其完成。

質(zhì)粒的提取：參照UNIQ-10柱式小量抽提試劑盒提取細(xì)菌質(zhì)粒DNA [3]。

PCR反應(yīng)體系：10 ml DNA模板，25 ml 2×MasterMix， tem-1或tem-2上下游引物各2 ml，Taq DNA聚合酶（5 U/ml）0.5 ml，加ddH2O至50 ml。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性 5 min，然后95℃ 1 min，65℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)35次，最后72 ℃ 延伸10 min。2%瓊脂糖凝膠電泳法分析擴(kuò)增片段[4]，用凝膠成像儀采集圖像。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大腸埃希菌對(duì)氨芐西林、頭孢唑林、頭孢呋辛、頭孢曲松、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星及復(fù)方新諾明均具有較高的耐藥性，對(duì)阿米卡星的耐藥率較低，對(duì)呋喃妥因、美羅培南及亞胺培南的耐藥率均為0（表1）。

2.2 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

35株大腸埃希菌TEM型b-內(nèi)酰胺酶基因檢測(cè)全部呈現(xiàn)為陽(yáng)性，部分菌株（S1～S6）PCR擴(kuò)增片段的電泳圖見(jiàn)圖1。

3 討論

大腸埃希菌是院內(nèi)感染監(jiān)測(cè)中非常重要的病原菌之一，有資料顯示該菌株在醫(yī)院感染標(biāo)本中分離率達(dá)到30～60%，其中產(chǎn)超廣譜b-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）的分離率更高，非常容易引起暴發(fā)流行，此外ESBLs易在菌株間傳播，導(dǎo)致耐藥菌產(chǎn)生和擴(kuò)散從而影響治療效果[5-6]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大腸埃希菌對(duì)氨芐西林的耐藥率已經(jīng)達(dá)到100%，對(duì)頭孢呋辛、頭孢唑林、頭孢曲松等一代、二代、三代頭孢菌素類存在明顯耐藥性，耐藥率均超過(guò)了65%，并且會(huì)對(duì)復(fù)方新諾明的耐藥率也達(dá)到了80%，提示這些藥物無(wú)法作為臨床治療大腸埃希菌誘發(fā)的感染性疾病[7]。此外，研究表示大腸埃希菌對(duì)碳青霉烯類藥物具有顯著敏感性，提示碳青霉烯類藥物對(duì)大腸埃希菌、ESBLs大腸埃希菌均有較高的穩(wěn)定性，與Han等[8]的報(bào)道結(jié)果基本一致。 病原菌基因型檢測(cè)也是提高用藥針對(duì)性和治療有效性的關(guān)鍵[9-10]，本研究應(yīng)用TEM型b-內(nèi)酰胺酶基因展開(kāi)檢測(cè)，耐藥菌株tem基因均呈現(xiàn)為陽(yáng)性，說(shuō)明菌株對(duì)b-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性多是tem基因編碼[11]。

綜上所述，本地區(qū)大腸埃希菌耐藥率非常高，尤其是對(duì)常見(jiàn)的廣譜抗生素耐藥率極高，本次實(shí)驗(yàn)中所選取的藥物種類有限，細(xì)菌對(duì)其他藥物的耐藥機(jī)制尚需展開(kāi)進(jìn)一步的研究，旨在為大腸埃希菌的院內(nèi)感染治療提供幫助。

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