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    氟比洛芬微生物計(jì)數(shù)方法適用性研究

    2019-10-24 04:56:24北京市藥品檢驗(yàn)所中藥成分分析與生物評價北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室102206江志杰張光華
    首都食品與醫(yī)藥 2019年8期
    關(guān)鍵詞:需氧菌山梨試液

    北京市藥品檢驗(yàn)所 中藥成分分析與生物評價北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(102206)江志杰 張光華

    北京茗澤中和藥物研究有限公司(102629)李斐菲 郭青葦

    氟比洛芬又稱苯氟布洛芬、氟聯(lián)苯丙酸,是一種強(qiáng)效苯丙酸類解熱抗炎鎮(zhèn)痛藥,能抑制前列腺素合成環(huán)氧合酶而起到止痛、抗炎及解熱作用。它為白色或類白色結(jié)晶性粉末,在甲醇、乙醇、丙酮或乙醚中易溶,在乙腈中溶解,在水中幾乎不溶[1]。它是一種新型的非甾體類鎮(zhèn)痛抗炎藥,品種有片劑、滴眼藥、緩釋膠囊劑等[2]。藥品一旦受到微生物污染,將造成藥品變質(zhì),主要成分分解而失效,也可能分解產(chǎn)生毒素,造成機(jī)體反應(yīng),引起疾病甚至威脅生命[3],而原料的微生物污染情況直接影響到最終產(chǎn)品的質(zhì)量。微生物檢查作為藥品安全性的重要指標(biāo)[4],微生物計(jì)數(shù)法用來測定原輔料或藥品受污染的程度,評價產(chǎn)品的一般衛(wèi)生質(zhì)量及安全性[5]。按照《中國藥典》2015年版四部通則1107非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定,應(yīng)對產(chǎn)品進(jìn)行需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的測定。中國藥典2005年版開始引入微生物檢查方法驗(yàn)證試驗(yàn),通過方法適用性試驗(yàn)研究來考察其抑菌性的大小,制定適合產(chǎn)品的微生物學(xué)檢查方法[7],以保證選用方法準(zhǔn)確、可靠。本文按照《中國藥典》2015年版的操作要求及指導(dǎo)原則,對氟比洛芬微生物計(jì)數(shù)方法進(jìn)行適用性研究,以確定適宜、有效的檢查方法。

    1 儀器與材料

    1.1 儀器設(shè)備 SPX-100B-Z生化培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);DNP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱(TAMATO科學(xué)株式會社);XS1.DTXD-0.36脈動真空滅菌器(山東新華醫(yī)療器械股份有限公司);SW-CJ-1FD超凈工作臺(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)公司);JM-B2002電子天平(諸暨市超澤衡器設(shè)備有限公司)。

    1.2 樣品 氟比洛芬(批號分別為2131701、2131702、2131703),由永光制藥有限公司生產(chǎn)。

    1.3 試劑與培養(yǎng)基 蛋黃卵磷脂(批號:20180304)和組氨酸鹽酸鹽(批號:20180304)來源于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;聚山梨酯80(批號:1306211)、磷酸氫二鉀(批號:1405061)和磷酸二氫鉀(批號:1303011)來源于西隴化工股份有限公司;pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號:20171208)來源于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號:20170123)、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(批號:20170711)、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(批號:20170920)和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(批號:20170810)來源于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司,均在驗(yàn)證合格的滅菌程序下滅菌,培養(yǎng)基適用性試驗(yàn)均符合藥典要求。

    pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液:照中國藥典2015年版通則8004配制,過濾,分裝,滅菌。

    緩沖液A:聚山梨脂80 30g、蛋黃卵磷脂3g、組氨酸鹽酸鹽1g、蛋白胨1g、氯化鈉4.3g、磷酸二氫鉀3.6g、磷酸氫二鈉7.2g、純化水1000ml,121度消毒15分鐘。注意:先將蛋黃卵磷脂加到聚山梨酯80中,研磨,混合,然后加入培養(yǎng)基或是混合液體中,煮沸,待完全溶解后分裝,消完毒后,帶厚手套,將底下的沉淀慢慢搖均勻,也可以放置一周后,搖勻使用。

    1.4 菌種 金黃色葡萄球菌 [CMCC (B)26003]、銅綠假單胞菌 [CMCC (B)10104]、大腸埃希菌 [CMCC(B)44102]、白色念珠菌 [CMCC(F)98001]、黑曲霉 [CMCC(F)98003]均購自中國食品藥品檢定研究院,菌株傳代數(shù)均為第3代。

    1.5 試驗(yàn)環(huán)境 符合《中國藥典》2015年版的要求,在環(huán)境潔凈度D級下的局部潔凈度B級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行;微生物限度室、潔凈工作臺及生物安全柜潔凈度經(jīng)監(jiān)測符合相關(guān)要求;每次試驗(yàn)潔凈工作臺沉降菌監(jiān)測記錄均符合規(guī)定。

    2 方法

    2.1 菌液的制備 接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基中,33℃培養(yǎng)24h;接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中,23℃培養(yǎng)24h。上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液。

    附表1 不同方法的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    附表2 氟比洛芬微生物計(jì)數(shù)方法適用性回收比值

    附表3 中和劑對照組的回收比值

    接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基中,25℃培養(yǎng)7d,加入3ml含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫。過濾菌絲吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi),用含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的孢子懸液。

    2.2 微生物計(jì)數(shù)法用供試液的制備 供試液①:取本品5g,加含3%聚山梨脂80 pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至1000ml,振搖至供試品分散均勻,制成1∶200的供試液。

    供試液②:取本品5g,加含3%聚山梨脂80 pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液至1000ml,振搖至供試品分散均勻,制成1∶200的供試液。

    供試液③:取本品5g,加緩沖液A至1000ml,振搖至供試品分散均勻,制成1∶200的供試液。

    2.3 需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

    2.3.1 菌液對照組 方法1、方法2、方法4和5:取pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10ml,加入制備好的試驗(yàn)菌液0.1ml(細(xì)菌、酵母菌小于1000cfu,霉菌小于600cfu),混勻,使每1ml稀釋液中含菌量小于100cfu,分別取此菌液1ml注皿,測定其每毫升的活菌數(shù),結(jié)果為 A。方法3:取pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液20ml,加入制備好的試驗(yàn)菌液0.1ml(細(xì)菌、酵母菌小于1000cfu,霉菌小于600cfu),混勻,使每2ml稀釋液中含菌量小于100cfu,分別取此菌液2ml注皿,測定其每毫升的活菌數(shù),結(jié)果為A。

    2.3.2 供試品對照組 方法1、方法2、方法4和5:分別取取供試液①、供試液②、供試液③10ml,加入稀釋液0.1ml,取1ml注皿,分別測定供試品本底的需氧菌總數(shù)和霉菌和酵母菌總數(shù),測定結(jié)果為B。方法3:取供試液③20ml,加入稀釋液0.1ml,取2ml注皿,分別測定供試品本底的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù),測定結(jié)果為B。

    2.3.3 試驗(yàn)組 方法1、方法2、方法4和5:取供試液①、供試液②、供試液③10ml各五只試管,分別加入制備好金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白念珠菌和黑曲霉試驗(yàn)菌菌懸液0.1ml,混勻,取1ml注皿,測定需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù),測定結(jié)果為C。方法3:取供試液③20ml各五只試管,分別加入制備好金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白念珠菌和黑曲霉試驗(yàn)菌菌懸液0.1ml,混勻,取2ml注皿,測定需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù),測定結(jié)果為C。

    2.3.4 中和劑對照組 方法5:取供試液③10ml各五只試管,分別加入制備好金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白念珠菌和黑曲霉試驗(yàn)菌菌懸液0.1ml,混勻,取1ml注皿,測定需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù),測定結(jié)果為D。上述所加菌液的體積均未不超過供試液體積的1%。已注入供試液的平皿,細(xì)菌計(jì)數(shù)傾注胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基,而方法5是傾注含3%聚山梨酯80、0.3%卵磷脂的胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基,待凝固后,置33℃培養(yǎng)3d,逐日觀察結(jié)果;霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基,待凝固后,置25℃培養(yǎng)5d,逐日觀察結(jié)果。

    2.3.5 比值計(jì)算 試驗(yàn)菌的比值=(菌落數(shù)C-菌落數(shù)B)/菌落數(shù)A;中和劑對照組的比值=菌落數(shù)D/菌落數(shù)A。

    3 結(jié)果與分析

    3.1 微生物計(jì)數(shù)方法適用性預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 從附表1預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,方法1中的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、黑曲霉的回收率均為0,說明氟比洛芬的抑菌作用很強(qiáng),通過分析發(fā)現(xiàn),供試液①pH值為6.0左右,偏酸性,因此后面的試驗(yàn)均采用了堿性的磷酸緩沖液作為稀釋液,考慮到樣品為非水溶性的粉末狀,為了分散均勻,稀釋液中添加了一定量的聚山梨酯80;方法2中的銅綠假單胞菌的回收率為0.2,方法3中的金黃色葡萄球菌的回收率為0,可能是供試液量增加導(dǎo)致的,均不符合藥典要求;方法4結(jié)果顯示,除銅綠假單胞菌的回收比值為0.4,其余試驗(yàn)菌株的回收比值均大于0.5,因此考慮在培養(yǎng)基中添加一定量的卵磷脂和聚山梨酯80。

    3.2 微生物計(jì)數(shù)方法適用性結(jié)果 氟比洛芬的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)采用平皿法進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)結(jié)果見附表2。在3次獨(dú)立的需氧菌計(jì)數(shù)方法平行試驗(yàn)中,金黃色葡萄球菌的回收比值分別為1.1、0.9、0.7,枯草芽孢桿菌的回收比值分別為0.6、1.0、0.8,銅綠假單胞菌的回收比值分別為1.0、1.0、0.9,黑曲霉的回收比值分別為0.8、1.0、0.9,白色念珠菌的回收比值分別為0.9、1.0、1.3,5株需氧菌的回收比值均符合藥典規(guī)定,因此,可照此方法測定氟比洛芬的需氧菌總數(shù)。在3次獨(dú)立的霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)方法平行試驗(yàn)中,黑曲霉的回收比值分別為0.7、0.9、0.8,白色念珠菌的回收比值分別為0.7、0.9、1.1,2株真菌的回收比值均符合藥典規(guī)定,因此,可照此方法測定氟比洛芬的霉菌和酵母菌總數(shù)。

    3.3 中和劑對微生物有無毒性結(jié)果 為考察緩沖液A和培養(yǎng)基中添加一定量的卵磷脂和聚山梨酯80對微生物有無毒性,設(shè)置了中和劑對照組,從附表3中的結(jié)果來看,中和劑對照組的菌落數(shù)與菌液對照組的菌落數(shù)比值均在0.8~1.5之間,符合藥典要求的0.5~2.0范圍內(nèi)。

    4 討論

    隨著《中國藥典》2015年版的實(shí)施,對原料及輔料的微生物限度控制也越來越嚴(yán)格[6]。而原料的微生物檢驗(yàn)方法適用性驗(yàn)證也應(yīng)符合《中國藥典》2015年版四部[7]通則1106的要求,若回收比值為0.5~2.0,方法可用于樣品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的計(jì)數(shù)檢查。產(chǎn)品存在抑菌性時,中國藥典2015年版強(qiáng)調(diào)的方法學(xué)適用性試驗(yàn)更顯重要性,只有采用適宜方法去除抑菌活性,才有可能檢出藥品中污染的微生物,避免檢驗(yàn)結(jié)果假陰性,從而保證微生物限度檢查方法的科學(xué)性,以有效控制藥品質(zhì)量[8]。已有許多文獻(xiàn)報道,通過各種手段消除供試品的抑菌作用,找到合理的科學(xué)的檢測方法。平皿法是非無菌制劑微生物計(jì)數(shù)的傳統(tǒng)方法,具有簡單方便,成本低,結(jié)果準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn),是優(yōu)先考慮的方法[4]。預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氟比洛芬的抑菌性比較強(qiáng),而薄膜過濾法能直接徹底消除抑菌作用、計(jì)數(shù)結(jié)果準(zhǔn)確度高,但是不適用于非完全溶解的供試品。Tween-80 和卵磷脂常作為季銨化合物、對羥基苯甲酸等化合物的中和劑,可能會保護(hù)微生物細(xì)胞膜起到中和作用。聚山梨酯80是一種表面活性劑,可作為乳化劑和中和劑等,用于藥品的微生物限度檢查時供試液的制備,使供試液分散系統(tǒng)更具相容性。因此,選用卵磷脂和聚山梨酯80作為中和劑,采用培養(yǎng)基稀釋法,最低稀釋級取1∶200的供試液1ml 注皿,才可以消除其抑菌作用。最終確定的方法為:取本品10g,加緩沖液A至2000ml,振搖至供試品分散均勻,制成1∶200的供試液。需氧菌總數(shù)測定,取1∶200的供試液1ml,注皿,平行2份,注入3%聚山梨酯80和0.3%蛋黃卵磷脂的胰酪大豆瓊脂培養(yǎng)基,依法檢查(中國藥典2015年版通則1105平皿法);霉菌和酵母菌總數(shù)測定,取1∶200的供試液1ml,注皿,平行20份,依法檢查(中國藥典2015年版通則1105平皿法)。

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