低氧誘導因子的調(diào)控途徑和在腸道疾病中的作用*

滕文彬， 李玉紅, 2△， 祝勝美

(浙江大學紹興醫(yī)院 1麻醉科， 2醫(yī)學研究中心， 浙江 紹興 312000； 3浙江大學附屬第一醫(yī)院麻醉科， 浙江 杭州 310000)

腸道上皮覆蓋著整個胃腸道系統(tǒng)，在成人有大約300平方米的表面積，形成了通往外部的重要屏障，在維持內(nèi)環(huán)境和體內(nèi)外的平衡起著至關重要的作用。腸道上皮不僅對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和對非致病性抗原耐受性的形成起著重要作用，同時也受到氧供的調(diào)節(jié)。近年來，人們越來越認識到組織氧代謝是維持腸道上皮內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的關鍵。

正常腸道上皮處于“生理性缺氧”的環(huán)境，由于逆流血流和大量細菌的存在，腸道基線動脈氧分壓水平低于正常值。腸道獨特的生理結(jié)構(gòu)，一側(cè)是高度血管化和氧氣充足的黏膜，另一側(cè)是嚴重缺氧的管腔，因此在上皮層之間有一個陡峭的氧梯度，這種正常腸道上皮獨特的耐氧能力，可能是對極低水平氧合狀態(tài)的一種適應性調(diào)節(jié)。低氧性應答對機體內(nèi)的多種生物學進程起著至關重要的作用，是多種疾病如胃腸道疾病，腫瘤和心血管疾病的發(fā)病機制。

腸道疾病多發(fā)生在腸道“生理性缺氧”的基礎上。研究發(fā)現(xiàn)，低氧誘導因子(hypoxia-inducible factor，HIF)在維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)起著關鍵作用，對炎癥性腸病、腸道腫瘤、缺血再灌注損傷及腸道菌群失調(diào)的發(fā)展過程中引起的低氧甚至缺氧產(chǎn)生適應性應答，從而維持腸道上皮細胞(intestinal epithelial cells，IECs)的正常功能[1]。

本文將對HIF在IECs中的結(jié)構(gòu)、功能、調(diào)節(jié)途徑及在腸道疾病中作用的相關文獻做一綜述。

1 HIF的結(jié)構(gòu)、功能和活性調(diào)控

HIF作為適應性低氧反應的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，最初在促紅細胞生成素的調(diào)節(jié)中被發(fā)現(xiàn)，后來發(fā)現(xiàn)它能轉(zhuǎn)錄激活并調(diào)節(jié)氧平衡和多種與代謝有關的基因[2]，包括參與能量代謝、血管生成、細胞凋亡、炎癥應答以及其它蛋白質(zhì)產(chǎn)物增加氧傳遞或促進對低氧代謝適應的基因，從而成為細胞和系統(tǒng)內(nèi)對低氧穩(wěn)態(tài)反應的主要調(diào)節(jié)器。

HIF是堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)轉(zhuǎn)錄因子的Per-ARNT-Sim(PAS)家族成員。HIF的結(jié)構(gòu)呈異源二聚體，由不穩(wěn)定的α亞基和相對穩(wěn)定的β亞基組成，每個亞基都包含bHLH-PAS結(jié)構(gòu)域，參與DNA結(jié)合的調(diào)節(jié)[3]。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有3種HIF，即HIF-1、HIF-2和HIF-3。除普遍表達的HIF-1外，哺乳動物中HIF-2也廣泛表達，并在紅細胞生成、血管化和幼體發(fā)育中發(fā)揮重要作用[4]；HIF-3通過競爭靶基因與低氧反應元件(hypoxic response element,HRE)結(jié)合負調(diào)控HIF-1和HIF-2[5]。

α亞基是HIF-1的活性亞基，其穩(wěn)定性和活性均受內(nèi)環(huán)境氧濃度的調(diào)控，見圖1。在常氧條件下，HIF-1α的轉(zhuǎn)錄激活功能被抑制。HIF-1α包含2個高度保守的氧依賴性降解結(jié)構(gòu)域(oxygen-dependent degradation domain，ODD)，每個結(jié)構(gòu)域包括脯氨酸殘基[6]。脯氨酸羥化酶(proline hydroxylases，PHDs)是Fe2+、α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid，α-KG)和O2依賴的雙加氧酶，以O2和α-KG為底物，在特定的脯氨酸殘基上(P402和P564)使HIF-1α羥基化，其中一個氧原子與脯氨酰殘基結(jié)合，另一個與α-KG結(jié)合，生成CO2和琥珀酸[6]。羥基化后的脯氨酸被 von Hippel-Lindau (VHL)腫瘤抑制蛋白(pVHL)識別并綁定，然后招募E3泛素連接酶(E3-ubiquitin ligase)，并在24S蛋白酶體作用下泛素化靶向降解[7]。

Figure 1. Structure and activity regulation of HIF-1α.

圖1 HIF-1α的結(jié)構(gòu)及活性調(diào)控

HIF抑制因子1(factor inhibiting HIF-1，F(xiàn)IH-1)是一種天冬酰胺羥化酶，與PHDs類似，也以氧依賴的方式調(diào)節(jié)HIF的轉(zhuǎn)錄活性。FIH-1通過誘導HIF-1α N803位點天冬酰胺殘基的羥基化，阻止HIF-1α將轉(zhuǎn)錄共激活因子和組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300/CBP招募到HIF-1α的羧基端反式激活結(jié)構(gòu)域(C-terminal transactivation domain,C-TAD)中，阻斷與HIF-1α的聯(lián)系，從而抑制HIF-1α的轉(zhuǎn)錄功能[8]。

當機體或細胞受到低氧刺激時，F(xiàn)IH-1和PHDs等氧依賴型酶的活性被抑制，導致胞內(nèi)HIF-1α累積，然后HIF-1α轉(zhuǎn)位入核與HIF-1β(也稱作ARNT)聚合形成異源二聚體，通過招募轉(zhuǎn)錄輔活化因子p300/CBP，繼而與啟動子區(qū)域內(nèi)含有序列5’-A/GCGTG-3’的E-box like HRE結(jié)合并調(diào)控相關基因的轉(zhuǎn)錄表達[7]，從而維持氧穩(wěn)態(tài)，使細胞避免低氧損傷或適應低氧環(huán)境。

機體或者細胞大多數(shù)的低氧應答，都是由HIF介導的。幾乎在任何的細胞系中，HIF與至少500個基因位點結(jié)合，從而調(diào)控相關基因的轉(zhuǎn)錄，促進細胞對低氧產(chǎn)生應答[9]。HIF不僅調(diào)控多種基因，同時，HIF-1α的基因轉(zhuǎn)錄水平、蛋白活性和穩(wěn)定性也受多種因素調(diào)控。除缺氧外，還有其它因素如鐵螯合劑、氯化鈷、硫化氫和琥珀酸鹽等均可影響HIF的活性。

PHDs是鐵、α-KG及O2依賴的酶，對HIF-1α修飾后進行蛋白酶體降解。PHDs活性的穩(wěn)定需要鐵，當細胞內(nèi)鐵水平較高時，HIF-1α的活性也被穩(wěn)定激活[10]。CoCl2的Co2+通過與Fe2+交換來阻止脯氨酸羥化酶和天冬酰胺羥化酶發(fā)揮作用，因而作為誘導HIF-1α常用模擬物[10]。H2S通過增強真核生物翻譯起始因子2α的磷酸化抑制HIF-1α的轉(zhuǎn)錄激活[11]。琥珀酸過量時會因副產(chǎn)物抑制作用而損害PHDs活性，導致HIF-1α的穩(wěn)定和激活[12]，這一作用被α-KG所阻斷，α-KG是PHDs的底物，在HIF-1α羥基化作用下生成琥珀酸。

2 HIF的調(diào)控途徑

2.1核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)通路 NF-κB是一種快速誘導轉(zhuǎn)錄因子，在基因誘導中起著廣泛的作用。靜息狀態(tài)下，NF-κB二聚體與NF-κB抑制物(inhibitor of NF-κB，I-κB)家族的蛋白質(zhì)結(jié)合而處于非活性狀態(tài)[13]。NF-κB活化由I-κB激酶(I-κB kinase，IKK)復合體控制，IKK復合物磷酸化特定絲氨酸殘基上的I-κB(主要是I-κBβ)蛋白，誘導其泛素化和蛋白酶體降解，使NF-κB二聚體(p65/p50)在細胞內(nèi)積聚[13]。隨后NF-κB磷酸化的二聚體易位入核，促進HIF-1α的轉(zhuǎn)錄[14]。

2.2Janus激酶(Janus kinase，JAK)-信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)通路 STAT3是介導細胞因子信號通路的重要轉(zhuǎn)錄因子，與多種細胞因子結(jié)合并通過JAK/STAT3途徑發(fā)揮誘導信號轉(zhuǎn)導和基因轉(zhuǎn)錄的作用。JAK活化能直接使STAT3磷酸化[15]，STAT3轉(zhuǎn)移到細胞核并啟動HIF-1α轉(zhuǎn)錄[16]。另外，HIF-1α表達上調(diào)反過來激活JAK1/2-STAT3信號軸，促進腫瘤干細胞的自我更新[17]，表明JAK/STAT3通路與HIF有交互作用。

2.3磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B，PKB，即AKT)-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路 PI3K-AKT-mTOR信號通路對HIF-1α有級聯(lián)放大作用。AKT在下游被PI3K激活，隨后磷酸化激活mTOR[18]。磷酸化的mTOR使核糖體蛋白S6激酶(ribosomal protein S6 kinase，S6K,即p70S6K)磷酸化[19]，隨后磷酸化的p70S6K磷酸化40S核糖體蛋白S6(40S ribosomal protein S6，rpS6)[19]，后者對HIF-1α蛋白的合成起到促進作用。mTOR還能使真核細胞翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1(eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1，4E-BP1)磷酸化[19]，解除對真核細胞翻譯起始因子4E (eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF-4E)結(jié)合與抑制[20]，后者促進HIF-1α蛋白的翻譯[21]。

2.4腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)通路 AMPK是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復合物，在調(diào)節(jié)細胞能量平衡中起重要作用。AMPK能抑制mTOR[20]，通過p70S6K和4E-BP1對HIF-1α蛋白合成起到抑制作用。AMPK缺失能夠提升HIF-1α表達水平，增加糖酵解和合成代謝，增強腫瘤的Warburg效應[22]。

2.5Ras-Raf-MEK-ERK/MAPK通路 Ras-Raf-MEK-ERK/MAPK通路是一種進化保守的通路，參與調(diào)控細胞增殖、存活、分化、凋亡和代謝等許多過程[23]。Ras是一種小的GTPase，能被多種受體誘導激活，并與Raf激酶綁定、招募并激活到細胞膜上進行隨后的激活；激活后的Raf磷酸化激活MAPK/ERK激酶(MAPK/ERK kinase，MEK)，MEK磷酸化激活ERK/MAPK[23]；激活后的ERK使4E-BP1、p70S6K和MAPK相互作用激酶(MAPK interacting kinase，MNK)磷酸化。MNK也能直接使eIF-4E磷酸化。最后使mRNA翻譯成HIF-1α蛋白加速[8]。

2.6非編碼RNA 微小RNAs(microRNAs，miRNAs)是一類小于22個核苷酸的小分子單鏈非編碼RNA，它通過結(jié)合3’-非翻譯區(qū)(3’-untranslated regions，3’-UTR)或氨基酸編碼序列來調(diào)控。miRNAs介導的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)被認為是最重要的細胞調(diào)節(jié)方式之一。miR-145通過與p70S6K的3’-UTR結(jié)合而抑制p70S6K的轉(zhuǎn)錄，從而抑制HIF-1α與血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達[24]。miR-200b通過與HIF-1α的3’-UTR結(jié)合抑制其在上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)中的作用[25]。miR-210通過下調(diào)HIF-1α的高度羥基化而降低甘油-3-磷酸脫氫酶1(glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1，GPD1L)的水平，從而穩(wěn)定HIF-1α蛋白[26]。miR-322能通過上調(diào)HIF-1α的表達水平促進腫瘤的增殖與遷移[27]。miRNA 497～195簇通過靶向F-box和WD-40結(jié)構(gòu)域蛋白7(F-box and WD-40 domain protein 7，F(xiàn)bxw7)以及具有跨膜結(jié)構(gòu)域的脯氨?；?-羥化酶(prolyl 4-hydroxylase, transmembrane，P4HTM)，維持內(nèi)皮Notch活性和HIF-1α的穩(wěn)定性[28]。

長鏈非編碼RNA(long noncoding RNAs，lncRNAs)是一類長度超過200個核苷酸的非編碼RNA。越來越多的證據(jù)表明，lncRNAs在基因組印跡、轉(zhuǎn)錄激活或失活、RNA剪接、翻譯控制和RNA干擾等多個水平上對基因組的調(diào)控起著至關重要的作用。LncHIFCAR(long noncoding HIF-1α co-activating RNA)通過直接結(jié)合與HIF-1α形成復合物，并促進HIF-1α和p300輔助因子向靶啟動子的募集，來共同激活HIF-1α[29]。 lncRNA CPS1-IT1(CPS1 intronic transcript 1)通過與熱休克蛋白90(heat shock protein 90，HSP90)競爭性結(jié)合抑制HIF-1α的表達[30]，從而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移和腸上皮細胞的轉(zhuǎn)分化[31]。lncRNA-NUTF2P3-001 可以調(diào)節(jié)HIF與HRE的上游啟動原件 RAS，并在腫瘤中呈高表達[32]。

由此可見，HIF受到多種多層次、多位點、多過程調(diào)控，為多種疾病治療提供很多潛在靶點。

3 HIF與相關疾病

HIF在腸道中持續(xù)表達，是調(diào)節(jié)腸道代謝的重要轉(zhuǎn)錄因子，腸道多種疾病的發(fā)生常常伴隨HIF活性增強或降低，影響腸道機械屏障功能、生物屏障以及黏液屏障等，從而出現(xiàn)各種病理或者病理生理改變。

3.1炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD) IBD如潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn disease，CD)等的患者對腸腔內(nèi)微生物的炎癥反應加劇，腸道黏膜產(chǎn)生大量炎癥細胞因子和炎癥介質(zhì)，IECs被破壞、甚至發(fā)生凋亡，致使腸黏膜屏障功能障礙，加重病情。臨床研究顯示，在UC或者CD患者的IECs中，黏膜缺氧促進HIF-1α的高表達[33]。HIF-1α激活能促進炎癥消退，還能通過促進腸黏膜屏障的修復，防止上皮細胞凋亡，從而可能減輕病情。

HIF-1α的穩(wěn)定在腸道中具有保護性作用。在小鼠結(jié)腸炎模型中，腸道上皮HIF-1α突變的小鼠，HIF-1α條件性功能喪失，IECs的條件性損傷加劇，結(jié)腸炎的癥狀加重，比如死亡率升高，體重減輕，結(jié)腸長度縮短；而腸道上皮pVHL突變的小鼠，DNA堿基水平發(fā)生改變，pVHL條件性功能失活，HIF-1α持續(xù)激活，腸道屏障保護基因(比如多藥耐藥基因1α、腸三葉因子、CD73等)的表達水平增加，體內(nèi)結(jié)腸炎期間腸道屏障功能的損傷減輕[34]。另一研究中，HIF-1α缺失的小鼠體重下降明顯，腸道炎癥程度加重，促炎細胞因子水平升高，黏蛋白增加[35]。而通過抑制HIF-1α的降解，增加HIF-1α的穩(wěn)定性能顯著降低炎癥所致的IECs損傷程度[36]。這些研究表明，HIF-1α是腸道屏障的保護性因素。因此，HIF-1α是一種很有希望作為治療藥物靶點的候選分子。

3.2腸道腫瘤 缺氧是幾乎所有實體腫瘤微環(huán)境中的一種主要現(xiàn)象，因為腫瘤細胞的膨脹速度迅速地超過滋養(yǎng)血管的發(fā)生，再加之腫瘤血管的功能紊亂，進一步加重缺氧。研究表明，HIF-1α在腸道腫瘤中高表達，與腫瘤的發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移、化療耐藥和輻射抗性高度相關[37]。HIF-1α高表達是結(jié)腸癌總體生存率和無進展生存率的獨立影響因素，抑制HIF-1α表達可顯著抑制腫瘤生長[38]。研究顯示，HIF-1α在腫瘤血管生成中起著重要作用。缺氧條件下，HIF-1α是VEGF表達的關鍵調(diào)節(jié)因子，HIF-1α通過與HREs結(jié)合激活VEGF的轉(zhuǎn)錄[39]。直結(jié)腸癌進展中，腫瘤出牙與直結(jié)腸癌形成前的低氧誘導的小血管形成有關，出芽細胞表達HIF-1α介導缺氧性腫瘤表型[40]。在裸鼠中，過表達PHD1 可明顯抑制腫瘤生長，腫瘤生長受抑與壞死增加和微血管密度顯著降低有關[41]。

EMT是上皮細胞轉(zhuǎn)化為具有間充質(zhì)表型細胞的過程，是癌癥轉(zhuǎn)移的關鍵步驟之一。HIF-1α在EMT中同樣發(fā)揮重要作用。在體或離體實驗中，通過抑制HIF-1α誘導的自噬作用抑制大腸癌EMT和轉(zhuǎn)移[31]。

3.3缺血再灌注(ischaemia-reperfusion，I/R)損傷 I/R是引起腸道損傷常見原因，可導致組織損傷、炎癥反應以及IECs凋亡。腸道I/R常見病因有絞窄性疝、腸系膜動脈阻塞或循環(huán)衰竭等。研究表明，在腸道I/R中，HIF-1α主要通過腺苷調(diào)節(jié)腸道的保護功能。低氧環(huán)境下HIF-1α能誘導細胞外腺苷生成，增加信號傳導，具體是通過A2B腺苷受體，發(fā)揮對腸道的保護作用[42]。

腸系膜上動脈閉塞(superior mesenteric artery occlusion，SMAO)60 min的小鼠模型中，條件性敲除腸道HIF-1α會加重I/R誘導的損傷；應用PHDs抑制劑DMOG能減輕I/R對腸道的損傷作用[42]。在HIF-1α條件性缺失的小鼠和體外條件性敲除HIF-1α的IECs中，缺氧對平衡性核苷轉(zhuǎn)運體的抑制作用消失，表明HIF-1α還能通過抑制核苷轉(zhuǎn)運體抑制腺苷再攝取和通過腺苷激酶抑制腺苷代謝以增加細胞外腺苷濃度[43]。

Kannan等[44]研究在SMAO的腸I/R損傷模型(45 min SMAO再灌注3 h)中，使用部分HIF-1α缺陷的小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HIF-1α激活與腸道I/R損傷直接相關；HIF-1α部分缺陷通過降低SMAO誘導的腸通透性增加、脂質(zhì)過氧化、黏膜caspase-3活性及IL-1β水平的升高，減輕腸I/R損傷的作用，表明I/R損傷的持續(xù)時間和嚴重程度決定HIF-1α是否具有腸道保護或有害作用。因此，HIF-1α是腸道I/R的保護因子，有可能成為治療I/R損傷的潛在靶點。

3.4腸道細菌與感染 腸道內(nèi)多種微生物共生，形成一個動態(tài)的微生物環(huán)境。IECs對病原菌的入侵具有高度的警惕性，是抵抗病原體入侵和感染的重要屏障。當大量的外源性致病菌入侵腸道或者內(nèi)源性菌群失調(diào)，會進一步損傷IECs，甚至誘導發(fā)生凋亡，成為腸道疾病的來源。發(fā)生感染時，細胞的氧需大于氧供是低氧應激反應的一種常見現(xiàn)象。低氧條件下，細菌大量攝取鐵，抑制PHDs活性，使HIF-1α穩(wěn)定，誘導HIF靶基因的表達[45]。另一研究揭示，在一些腸道菌屬(如沙門氏菌、耶爾森菌、腸桿菌)中的鐵載體也具有穩(wěn)定HIF-1α的作用[46]。

腸道HIF-1α可通過誘導多種腸道保護因子抵抗病原菌的侵襲作用。髓系細胞系中條件性缺失HIF-1α小鼠的殺菌活性降低，容易導致感染在全身擴散；相反，通過敲除pVHL或激活HIF-1α能使髓系細胞產(chǎn)生防御因子，提高殺菌能力[47]。腸道上皮細胞缺失HIF-1α的小鼠對口服小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的易感性增高，細菌介導的HIF-1α激活可能代表宿主啟動對病原菌的防御機制[46]。在離體Caco-2細胞模型中，HIF-1α穩(wěn)定劑DMOG通過減少宿主β-1整合素在細胞表面的定位，減少小腸結(jié)腸炎耶爾森菌對腸上皮細胞的內(nèi)化而降低其侵襲力[48]。

腸道微生物能產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，尤其是短鏈脂肪酸，包括丁酸鹽、丙酸鹽和醋酸鹽，對腸道起保護作用。丁酸鹽是細菌首要代謝產(chǎn)物，在正常的腸道組織中，高達30%的能量可能來自丁酸鹽的代謝，并在結(jié)腸黏膜中起到多種功能。丁酸鹽能刺激IECs代謝，增加O2的消耗，使HIF-1α保持穩(wěn)定，增強IECs功能[49]。通過使用抗生素，減少微生物，能降低結(jié)腸的丁酸水平和HIF-1α的表達，而通過補充丁酸能恢復恢復HIF-1α的表達水平[50]。此外，在條件性缺失HIF的細胞中，丁酸失去了對屏障的保護作用，表明丁酸對腸黏膜屏障的保護功能可能通過HIF起作用[49]。這表明短鏈脂肪酸通過HIF-1α信號軸促進腸道的保護功能。

4 總結(jié)與展望

近年來，分析工具和基因組技術發(fā)展的進步實現(xiàn)了對缺氧和缺氧誘導轉(zhuǎn)錄因子的生物學研究，提高了人們對生理和病理狀態(tài)中氧穩(wěn)態(tài)的認知。HIF在組織氧代謝中的作用一直是許多學者關注的焦點。HIF對IECs代謝的作用越來越受到重視，其對維持腸黏膜細胞的正常功能、腸道屏障的完整性及腸道微環(huán)境的穩(wěn)定性具有重要意義。對HIF結(jié)構(gòu)、作用機制及其影響因素的深入研究為腸道炎癥、感染、腫瘤、缺血再灌注等發(fā)病機制提供新的思路，并通過對HIF調(diào)節(jié)機制的進一步研究探索上述疾病新的治療靶點。