沉默XIST對結(jié)直腸癌細(xì)胞阿霉素耐藥性的抑制作用及其機(jī)制*

舒 濤， 王曉梅， 付曲波， 黃利興， 謝斌輝

(贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 1消化內(nèi)科, 2普外科, 江西 贛州 341000)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是消化道系統(tǒng)常見腫瘤，在癌癥相關(guān)死亡率中排名第2位[1]。近年來，由于遺傳和環(huán)境因素，CRC的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢[2-3]。化療是CRC患者的重要輔助治療手段之一。蒽環(huán)類藥物阿霉素(adriamycin; 又稱多柔比星，doxorubicin，DOX)廣泛用于治療包括CRC在內(nèi)的多種惡性腫瘤，但DOX的耐藥性是導(dǎo)致DOX化療失敗的主要原因[4-5]。因此，對DOX耐藥分子機(jī)制的進(jìn)一步闡明及有效逆轉(zhuǎn)CRC化療DOX耐藥干預(yù)策略的研究是勢在必行的。

X染色體失活特異轉(zhuǎn)錄物(X-inactive specific transcript，XIST) 的失調(diào)與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)，提示XIST可作為腫瘤的前驅(qū)標(biāo)致性因子[6-7]。最新研究表明XIST在CRC中表達(dá)顯著增加，且通過促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移及侵襲來發(fā)揮致癌因子的作用[8]。XIST也在5-氟尿嘧啶(fluorouracil, 5-FU)耐藥的CRC中高表達(dá)，過表達(dá)XIST可通過促進(jìn)胸腺嘧啶的合成從而抑制5-FU對細(xì)胞的毒性[9]，但XIST是否參與CRC的DOX耐藥還有待進(jìn)一步研究。因此，本研究觀察沉默XIST對DOX耐藥CRC細(xì)胞的作用，并進(jìn)一步分析其潛在機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

人結(jié)直腸癌細(xì)胞系LoVo和HCT116細(xì)胞購自美國培養(yǎng)物保藏中心。胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)液購自Gibco；XIST小干擾RNA(XISTsmall interfering RNA, si-XIST)和陰性對照(si-control)、miR-124小干擾RNA(anti-miR-124)和陰性對照(anti-miR-control)、miR-124和陰性對照(miR-control)由上海吉瑪基因公司合成；抗P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)抗體購自Abcam；抗谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶π(glutathioneS-transferase π, GST-π)抗體購自CST；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和雙螢光素酶試劑盒購自Thermo Scientific。細(xì)胞線粒體分離試劑盒、RIPA和MTT試劑購于江蘇碧云天生物研究所。

2 方法

2.1DOX耐藥細(xì)胞構(gòu)建 按照文獻(xiàn)[8]方法，HCT116和LoVo細(xì)胞通過反復(fù)暴露于濃度遞增(0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32和0.50 mg/L)的DOX，獲得最終在0.50 mg/L DOX穩(wěn)定生長的DOX耐藥的CRC細(xì)胞(HCT116/DOX和LoVo/DOX)。

2.2細(xì)胞培養(yǎng) HCT116、LoVo、HCT116/DOX和LoVo/DOX細(xì)胞均接種在含有10%胎牛血清、100 mg/L鏈霉素和1×105U/L青霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5% CO2和95% O2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 濃度為1×109/L的細(xì)胞置于6孔板，細(xì)胞貼壁后，無血清培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)12 h，按照說明書方法，利用Lipofectamine 3000分別轉(zhuǎn)染si-XIST、si-control、anti-miR-124、anti-miR-control、miR-124和miR-control，將混合物加入細(xì)胞，無血清培養(yǎng)液處理6 h后，換上新鮮完全培養(yǎng)液，繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)48 h。

2.4MTT檢測細(xì)胞對DOX敏感性 每樣本以5 000個細(xì)胞置于96孔板，細(xì)胞貼壁后，對細(xì)胞進(jìn)行(0.05、0.1、0.5、1、5和10 mg/L) DOX處理24 h，按照MTT說明書檢測細(xì)胞活性。往細(xì)胞培養(yǎng)液加入20 μL MTT試劑(5 g/L)，37 ℃孵育2 h后，吸棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min后，酶標(biāo)儀490 nm波長檢測吸光度(A值)。

2.5RT-qPCR檢測RNA表達(dá)量 按照RNA提取試劑盒步驟抽提總RNA，并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后根據(jù)引物和各樣本cDNA對XIST與miR-124進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。RT-qPCR反應(yīng)設(shè)置為95 ℃反應(yīng)10 min；92 ℃反應(yīng)15 s， 55 ℃持續(xù)30 s，72 ℃持續(xù)30 s, 40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，miR-124以U6為內(nèi)參照，XIST以GAPDH為內(nèi)參照，以2-ΔΔCt法量化基因相對表達(dá)量。XIST的上游引物序列為5’-ACGCTGCATGTGTCCTTAG-3’，下游引物序列為5’-GAGCCTCTTATAGCTGTTTG-3’；miR-124的上游引物序列為5’-GCTTAAGGCACGCGG-3’，下游引物序列為5’-GTGCAGGGTCCGAGG-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’，下游引物序列為5’-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3’；U6的上游引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

2.6螢光素酶報告基因?qū)嶒?擴(kuò)增包含預(yù)測的miR-124結(jié)合位點(diǎn)的野生型或突變型XIST，與螢光素酶報告載體pMIR-Report融合，即XIST-WT(XIST-WT1或XIST-WT2)和XIST-MUT(XIST-MUT1或XIST-MUT2)，再與miR-control或miR-124共轉(zhuǎn)染HCT116/DOX和LoVo/DOX細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48 h，收集細(xì)胞，報告分析系統(tǒng)檢測雙螢光素酶，測定螢光素酶相對活性。

2.7Western blot法檢測蛋白表達(dá)水平 按照實驗?zāi)康模眉?xì)胞線粒體分離試劑盒提取線粒體和去除線粒體成分的細(xì)胞質(zhì)蛋白，或利用RIPA裂解液萃取細(xì)胞全蛋白。利用BCA法將各組蛋白樣品定量至相同濃度后，取20 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE。電泳結(jié)束后，濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至甲醇預(yù)活化的PVDF膜，轉(zhuǎn)膜條件為恒壓100 V，時間為2 h。之后利用5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h并以1 ∶1 000的稀釋比例孵育Ⅰ抗體， 4 °C過夜。次日，以TBST洗滌后室溫孵育相應(yīng)的HRP標(biāo)記的II抗1 h，以TBST洗滌后利用化學(xué)發(fā)光成像儀顯影。采用ImageJ軟件掃描各條帶灰度值后，以β-actin為內(nèi)參照，對目的蛋白進(jìn)行量化。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，并使用GraphPad Prism 7.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。對于兩組定量資料的比較采用雙尾t檢驗；對于多組定量資料比較采用單因素方差分析后的LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 XIST在DOX耐藥細(xì)胞系中高表達(dá)而miR-124在DOX耐藥細(xì)胞系中低表達(dá)

用RT-qPCR檢測XIST與miR-124在2種DOX耐藥結(jié)直腸癌細(xì)胞系LoVo/DOX及HCT116/DOX中的表達(dá)。結(jié)果顯示，與親本細(xì)胞系LoVo和HCT116相比，在2種DOX耐藥細(xì)胞系中XIST均顯著上調(diào)(P<0.05)，見圖1A、B，而miR-124均顯著下調(diào)(P<0.05)，見圖1C、D。

2 下調(diào)XIST可減弱結(jié)直腸癌細(xì)胞的DOX耐藥

通過MTT實驗檢測DOX對2種DOX耐藥結(jié)直腸癌細(xì)胞系LoVo/DOX、HCT116/DOX及其親本細(xì)胞系LoVo、HCT116的IC50,結(jié)果顯示DOX對LoVo/DOX及HCT116/DOX 2種耐藥細(xì)胞系的IC50均顯著高于其親本細(xì)胞系LoVo和HCT116 (P<0.05)，見圖2A～D。為了研究XIST在耐藥中的作用，利用小干擾RNA方法在LoVo/DOX及HCT116/DOX細(xì)胞系中沉默XIST，利用RT-qPCR證明沉默效果均較好 (P<0.05)，見圖2E、F；同時檢測耐藥蛋白P-gp及GST-π的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，在沉默XIST后，P-gp及GST-π蛋白水平均顯著降低(P<0.05)，見圖2G、H。

3 XIST通過與miR-124直接結(jié)合抑制其在DOX耐藥結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)

為了探尋XIST致CRC細(xì)胞DOX耐藥的機(jī)制，本研究利用miRcode數(shù)據(jù)庫來尋找XIST可能調(diào)控的miRNAs，結(jié)果顯示miR-124的2段序列可能與XIST結(jié)合，見圖3A。為了確定兩者的相互作用，本研究構(gòu)建了野生型及突變型XIST與miR-124結(jié)合。雙螢光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染miR-124和野生型XIST的細(xì)胞中螢光素酶活性顯著降低(P<0.05)，而突變型XIST則沒有顯著差異(P>0.05)，見圖3B～E。

Figure 1. The expression level of XIST and miR-124 in DOX-resistant CRC cells were analyzed by RT-qPCR. A：the mRNA expression of XIST in LoVo and LoVo/DOX cells；B：the mRNA expression of XIST in HCT116 and HCT116/DOX cells；C：the expression of miR-124 in LoVo and LoVo/DOX cells；D：the expression of miR-124 in HCT116 and HCT116/DOX cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsLoVo cells;△P<0.05vsHCT116 cells.

圖1 XIST與miR-124在DOX耐藥細(xì)胞中的表達(dá)情況

4 下調(diào)XIST可通過miR-124提高DOX耐藥結(jié)直腸癌細(xì)胞的化療效果

為了探尋XIST是否通過miR-124來影響CRC細(xì)胞DOX耐藥，本研究將miR-124、si-XIST或si-XIST+anti-miR-124轉(zhuǎn)染LoVo/DOX及HCT116/DOX細(xì)胞。Western blot顯示轉(zhuǎn)染miR-124或沉默XIST顯著降低耐藥蛋白P-gp及GST-π的表達(dá)(P<0.05)；而共轉(zhuǎn)染si-XIST+anti-miR-124則可逆轉(zhuǎn)由沉默XIST導(dǎo)致的LoVo/DOX細(xì)胞及HCT116/DOX細(xì)胞的P-gp及GST-π表達(dá)降低(P<0.05)，見圖4。

Figure 2. XIST down-regulation impaired DOX resistance in DOX-resistant CRC cells. A～D： the viability was measured by MTT assay after LoVo, HCT116, LoVo/DOX and HCT116/DOX cells were exposed to DOX at various concentrations (0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, and 10 mg/L) for 24 h; E and F： the relative mRNA expression of XIST was detected by RT-qPCR in LoVo/DOX and HCT116/DOX cells after transfection with si-XIST or si-control; G and H: the protein levels of P-gp and GST-π in LoVo/DOX and HCT116/DOX cells transfected with si-XIST or si-control were analyzed by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsLoVo cells;△P<0.05vsHCT116 cells;#P<0.05vssi-control group.

圖2 下調(diào)XIST可減弱結(jié)直腸癌細(xì)胞的DOX耐藥

Figure 3. XIST repressed miR-124 expression in DOX-resistant CRC cells by direct binding. A： two miR-124 binding sites were predicted on XIST by miRcode; B～E: luciferase reporter assay was performed in LoVo/DOX and HCT116/DOX cells after cotransfection with miR-124 or miR-control and XIST-WT (XIST-WT1 or XIST-WT2) or XIST-MUT (XIST-MUT1 or XIST-MUT2). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsXIST-WT+miR-control.

圖3 XIST通過與miR-124直接結(jié)合抑制其在DOX耐藥結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)

Figure 4. XIST down-regulation reduced chemoresistance of DOX-resistant CRC cells to DOX via regulating miR-124. LoVo/DOX and HCT116/DOX cells were transfected with miR-control, miR-124, si-control, si-XIST, si-XIST+anti-miR-control or si-XIST+anti-miR-124. Western blot was performed to detect the protein levels of P-gp and GST-π in transfected LoVo/DOX (A) and HCT116/DOX (B) cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-control group;#P<0.05vssi-control group;△P<0.05vssi-XIST+anti-miR-control group.

圖4 下調(diào)XIST可通過miR-124提高DOX耐藥結(jié)直腸癌細(xì)胞的化療效果

討 論

XIST在胃癌、乳腺癌和直腸癌等腫瘤中具有致癌作用[6-8]。而臨床結(jié)直腸癌的治療過程中，腫瘤耐藥性是化療失敗的常見原因。研究發(fā)現(xiàn)，XIST在耐5-FU的CRC細(xì)胞中顯著上調(diào)，XIST的過表達(dá)可抑制5-FU導(dǎo)致的CRC細(xì)胞毒性[9]。DOX也常用于CRC的化療，但XIST是否也影響CRC細(xì)胞對DOX的耐藥性研究尚少。為了解決這個問題，本研究檢測XIST在耐DOX的CRC細(xì)胞中的表達(dá)，顯示在DOX耐藥的CRC細(xì)胞中，XIST表達(dá)異常上調(diào)。此外，XIST基因沉默降低了DOX耐藥的CRC細(xì)胞中P-gp和GST-π蛋白水平。而P-gp及GST-π是導(dǎo)致細(xì)胞DOX耐藥的關(guān)鍵蛋白，可將DOX泵出胞外[10]。因此，XIST沉默可增加細(xì)胞對DOX的化療敏感性。

XIST可通過調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)，最終導(dǎo)致miRNA的靶mRNA失活或增強(qiáng)活性而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[6,11-13]。沉默XIST可以扮演miR-101的分子海綿作用，作為zeste同源基因EZH2的增強(qiáng)子來起到抗腫瘤的作用[11-12]。XIST的過表達(dá)可通過上調(diào)miR-34a-5p的表達(dá)來增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞的增殖[13]。miR-124表達(dá)參與調(diào)節(jié)多種腫瘤化療藥物敏感性[14-18]。上調(diào)miR-124可抑制P-gp介導(dǎo)的腎癌FZD5耐藥性[15]。最近研究表明，在非小細(xì)胞肺癌中，miR-124過表達(dá)可提高吉非替尼的敏感性[16]。另外，miR-124-3p可作為潛在的增強(qiáng)乳腺癌阿霉素化療敏感性的治療靶點(diǎn)[17]。在CRC中，miR-124可以通過抑制靶基因DNMT3B和DNMT1促進(jìn)CRC細(xì)胞對順鉑和5-FU的敏感性[18]?；诖?，本研究旨在了解XIST是否可以與miR-124相互作用，以參與CRC耐DOX的調(diào)節(jié)，同時闡明XIST對CRC耐DOX的潛在機(jī)制，為逆轉(zhuǎn)CRC的DOX耐藥提供治療靶點(diǎn)。在本研究中，發(fā)現(xiàn)XIST與miR-124存在結(jié)合區(qū)域；miR-124在耐DOX的CRC細(xì)胞中低表達(dá)，且過表達(dá)miR-124可抑制CRC的DOX耐藥細(xì)胞中P-gp和GST-π蛋白水平；進(jìn)一步研究表明，共轉(zhuǎn)染si-XIST+anti-miR-124則可逆轉(zhuǎn)由沉默XIST導(dǎo)致的CRC的DOX耐藥細(xì)胞中的P-gp及GST-π的降低。這些結(jié)果提示，沉默XIST可能通過調(diào)節(jié)miR-124進(jìn)而抑制下游P-gp和GST-π蛋白水平來發(fā)揮抗DOX耐藥性。

綜上所述，本研究證明了XIST在DOX耐藥細(xì)胞系中高表達(dá)，而沉默XIST可起到miR-124的分子海綿作用，從而提高CRC對DOX的敏感性。因此，XIST可作為治療DOX耐藥的CRC患者的潛在干預(yù)靶點(diǎn)。