miR-137通過TWIST1調(diào)控乳腺癌MDA-MB-231細胞侵襲、遷移及凋亡*

馬 琛， 彭 力△， 陳 靜， 葉佳穎

(1重慶市第四人民醫(yī)院病理科， 重慶 400014； 2浙江卓運生物科技有限公司， 浙江 寧波 315174)

乳腺癌是常見的惡性腫瘤，至今沒有較好的治療方法，隨著分子遺傳學的不斷發(fā)展，基因治療已經(jīng)成為乳腺癌研究的重要內(nèi)容[1]。乳腺癌的發(fā)生與多種微小RNA(microRNA，miRNA，miR)的異常表達有關(guān)，這些miRNAs在乳腺癌組織中異常表達并且參與調(diào)控細胞的凋亡和侵襲等過程[2]。miR-137在正常腦組織、海馬組織等組織中表達，與神經(jīng)分化和精神分裂等有關(guān)[3]。目前的研究顯示，miR-137參與腫瘤進展，其在膠質(zhì)瘤、結(jié)直腸癌、宮頸癌等腫瘤進展中均發(fā)揮抑制作用，對于腫瘤細胞的侵襲和遷移能力有抵抗作用[4-6]。miR-137在乳腺癌中低表達，并且可能參與乳腺癌的侵襲過程，過表達miR-137可以抑制成年小鼠腫瘤形成能力[7]。目前對于miR-137在乳腺癌細胞中的作用和機制研究尚不明確。我們的實驗以乳腺癌MDA-MB-231細胞為體外研究對象，探討miR-137在乳腺癌細胞凋亡、侵襲、遷移中的作用和靶向調(diào)控機制。

材 料 和 方 法

1 材料

抗TWIST1抗體和抗基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)抗體購自Santa Cruz Biotechnology；抗cleaved caspase-3(C-caspase-3)抗體和抗Bax抗體購自BioVision；Lipofectamine 2000購自Invitrogen；miR-137 mimics和mimics control由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司構(gòu)建合成；TWIST1過表達載體(pcDNA3.1-TWIST1)由北京合生基因科技有限公司構(gòu)建；突變型(mutant,MUT)螢光素報告載體和野生型(wild type, WT)螢光素酶報告載體由武漢金開瑞生物工程有限公司構(gòu)建；MicroRNA Reverse Transcription Kit購自上海慧穎生物科技有限公司；SYBR Premix Ex Taq購自TaKaRa；BCA蛋白定量檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；ECL化學發(fā)光檢測試劑盒購自上海康朗生物科技有限公司。乳腺癌MDA-MB-231細胞購自中國醫(yī)學科學院腫瘤細胞庫。

2 方法

2.1細胞轉(zhuǎn)染 MDA-MB-231細胞的生長密度為60%時進行細胞轉(zhuǎn)染。取EP管，以不含血清和雙抗的DMEM與Lipofectamine 2000混合，記為溶液A；另取EP管，將不含血清和雙抗的DMEM與miR-137 mimics和mimics control分別混合，記為溶液B。將上述混合溶液置于室溫中孵育5 min后再混合；30 min后，添加到細胞中，培養(yǎng)6 h，更換新鮮的細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。將轉(zhuǎn)染miR-137 mimics和mimics control的MDA-MB-231細胞分別設(shè)置為miR-137組和miR-NC組，設(shè)置不做轉(zhuǎn)染處理的MDA-MB-231細胞為對照(control)組。

2.2RT-qPCR檢測miR-137表達的變化 取轉(zhuǎn)染48 h后的各組細胞，提取RNA并用MicroRNA Reverse Transcription Kit合成cDNA，采用SYBR Premix Ex Taq進行實時定量PCR，內(nèi)參照為U6，數(shù)據(jù)分析方法為2-ΔΔCt法，PCR條件為95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。miR-137的正向引物序列為5’-GCGCTTATTGCTTAAGAATAC-3’，反向引物序列為5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’；U6的正向引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3’，反向引物序列為5’-ACGCTTCACG-AATTTGCGTGTC-3’。引物均由南京金斯瑞合成。

2.3流式細胞術(shù)測定上調(diào)miR-137對細胞凋亡的影響 取轉(zhuǎn)染48 h后的各組細胞經(jīng)胰蛋白酶消化成單細胞，以PBS將細胞洗滌以后，每組收集1×106個細胞，將細胞懸浮于500 μL的結(jié)合緩沖液中，添加5 μL的PI及Annexin V-FITC溶液，上流式細胞儀檢測凋亡。

2.4Transwell小室測定上調(diào)miR-137對細胞侵襲和遷移的影響 遷移實驗取轉(zhuǎn)染后的各組細胞，將細胞密度調(diào)整為5×109/L(用不含血清的培養(yǎng)液懸浮)，在Transwell小室的上室內(nèi)加入100 μL細胞懸浮液，在下室內(nèi)添加含有胎牛血清的細胞培養(yǎng)液500 μL，48 h后取出小室，用PBS洗滌2次以后，將小室上室內(nèi)的液體用棉簽擦掉，添加4%多聚甲醛溶液孵育15 min后，再添加0.1%的結(jié)晶紫染色15 min。隨機選取5個視野計數(shù)穿膜細胞數(shù)目即為遷移數(shù)目。細胞侵襲實驗前將Matrigel添加到小室上室，在37 ℃孵育30 min，其余步驟同遷移實驗。

2.5Western blot檢測上調(diào)miR-137對細胞中MMP-9、C-caspase-3和Bax蛋白水平及TWIST1蛋白表達的影響 取轉(zhuǎn)染48 h后的各組細胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后收集細胞，添加細胞裂解試劑(蛋白酶抑制劑∶細胞裂解液比例為1∶100)，置于冰上反應25 min后，離心，吸取上清溶液保存在-80 ℃。蛋白上清以BCA法定量檢測，步驟參照試劑盒說明書。以10%的分離膠、5%的濃縮膠進行SDS-PAGE，電泳前將蛋白與等量體積的loading buffer混合后煮沸5 min變性。每孔蛋白上樣量為50 μg，設(shè)置電泳電壓為恒壓80 V，觀察溴酚藍進入到玻璃板的底部邊緣后終止電泳。把PVDF膜剪成同轉(zhuǎn)印的蛋白膠同樣大小，設(shè)置400 mA恒流轉(zhuǎn)膜1.5 h。把PVDF膜浸泡于5%脫脂奶粉中室溫孵育1 h，再把PVDF膜浸泡于1∶600稀釋的I抗(MMP-9，C-caspase-3 和Bax)反應液中孵育2 h，最后把PVDF膜放在1∶5 000稀釋的 II 抗反應液中反應2 h，取出PVDF膜，加ECL液化學發(fā)光，掃描分析條帶的灰度值。目的蛋白表達水平=目的蛋白灰度值/內(nèi)參照β-actin灰度值。取轉(zhuǎn)染48 h后的各組細胞，以Western blot方法測定TWIST1蛋白表達水平，步驟同上，TWIST1抗體稀釋倍數(shù)為1∶400，檢測上調(diào)miR-137對TWIST1蛋白表達的影響。

2.6靶基因預測及螢光素酶報告系統(tǒng)鑒定 用生物信息學軟件TargetScan預測到miR-137與TWIST1的3’-UTR端有結(jié)合位點，將TWIST1的3’-UTR端互補結(jié)合位點突變，構(gòu)建MUT螢光素報告載體，同時構(gòu)建野生型WT熒光素報告載體，熒光素酶報告載體為pMIR-PEPORT。將MUT和WT分別與miR-137 mimics、mimics control用Lipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染至乳腺癌細胞中，培養(yǎng)48 h后，用螢光素酶活性測定試劑盒檢測螢光素酶活性變化。

2.7TWIST1過表達載體對上調(diào)miR-137后的乳腺癌細胞凋亡、侵襲及遷移的影響 取乳腺癌細胞，用Lipofectamine 2000將miR-137 mimics分別與TWIST1過表達載體(pcDNA3.1-TWIST1)和陰性對照載體(pcDNA3.1)共轉(zhuǎn)染至細胞中，記為miR-137+TWIST1組和miR-137+vector組，轉(zhuǎn)染后48 h，以Western blot檢測TWIST1、MMP-9、C-caspase-3和Bax的蛋白水平，流式細胞術(shù)測定細胞凋亡，Transwell小室檢測細胞侵襲和遷移能力，步驟均同上。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 21.0軟件分析所有實驗數(shù)據(jù)，計量資料用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，兩組數(shù)據(jù)用獨立樣本t檢驗，多組差異比較用單因素方差分析，組間比較用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 miR-137 mimics提高乳腺癌MDA-MB-231細胞中miR-137的表達水平

MDA-MB-231細胞中轉(zhuǎn)染miR-137 mimics后，細胞中的miR-137水平升高，見圖1。

Figure 1. The expression of miR-137 in breast cancer MDA-MB-231 cells transfected with miR-137 mimics. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-NC group.

圖1 各組乳腺癌MDA-MB-231細胞中miR-137的表達

2 上調(diào)miR-137可抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞侵襲和遷移并誘導細胞凋亡

MDA-MB-231細胞中轉(zhuǎn)染miR-137 mimics后，細胞凋亡率升高，細胞侵襲數(shù)目和遷移數(shù)目降低(P<0.05)，見圖2。

3 上調(diào)miR-137可上調(diào)乳腺癌MDA-MB-231細胞中C-caspase-3和Bax的蛋白水平并抑制MMP-9的表達

MDA-MB-231細胞轉(zhuǎn)染miR-137 mimics后，細胞中C-caspase-3和Bax蛋白水平升高，MMP-9蛋白水平降低(P<0.05)，見圖3。

4 miR-137靶向調(diào)控TWIST1

生物信息學軟件分析miR-137與TWIST1的3’-UTR端有互補結(jié)合位點，miR-137 mimics和WT共轉(zhuǎn)染后的乳腺癌MDA-MB-231細胞中螢光素酶活性降低(P<0.05)，見圖4。

5 上調(diào)miR-137可抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞中TWIST1蛋白的表達

MDA-MB-231細胞中轉(zhuǎn)染miR-137 mimics后，細胞中TWIST1蛋白水平降低(P<0.05)，見圖5。

6 過表達TWIST1可逆轉(zhuǎn)miR-137 mimics對乳腺癌MDA-MB-231細胞侵襲、遷移和凋亡的影響

MDA-MB-231細胞中共轉(zhuǎn)染 TWIST1過表達載體和miR-137 mimics后，細胞中TWIST1蛋白水平升高，細胞凋亡率降低，細胞侵襲和遷移數(shù)目增多，細胞中C-caspase-3和Bax蛋白水平降低，MMP-9蛋白水平升高(P<0.05)，見圖6。

討 論

miR-137在海馬齒狀回顆粒細胞的下層高表達，對于神經(jīng)元分化成熟、骨髓發(fā)育和樹突發(fā)生等有重要意義，miR-137基因定位在1p21.3染色體上，其含有大量的CpG島，miR-137表達水平的高低受到啟動子甲基化影響[8]。miR-137參與了不同組織來源的惡性腫瘤進展，在膠質(zhì)瘤和胰腺癌等腫瘤中均表達下降，miR-137可能參與腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移[4,9]。在胰腺癌細胞中上調(diào)miR-137表達可以降低腫瘤細胞的侵襲和遷移能力，在宮頸癌細胞中上調(diào)miR-137能夠誘導細胞凋亡，這些研究結(jié)果均表明，miR-137在腫瘤中可能發(fā)揮抑制作用[6,10-12]。既往的研究報道顯示，miR-137表達上調(diào)可以抑制乳腺癌小鼠腫瘤生長，miR-137在乳腺癌中可能發(fā)揮抗癌作用[7]。本次實驗證實了miR-137表達上調(diào)可以抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞的侵襲、遷移并誘導凋亡，說明miR-137在體外乳腺癌細胞惡性表型中發(fā)揮抑制作用。

Figure 2. The effects of miR-137 mimics transfection on apoptosis (A), invasion and migration abilities (B) of the MDA-MB-231 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-NC group.

圖2 miR-137 mimics轉(zhuǎn)染對乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡率、侵襲數(shù)和遷移數(shù)的影響

Figure 3. Western blot was used to determine the protein levels of MMP-9, C-caspase-3 and Bax in the breast cancer MDA-MB-231 cells transfected with miR-137 mimics. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-NC group.

圖3 Western blot檢測miR-137 mimics轉(zhuǎn)染后各組乳腺癌MDA-MB-231細胞中MMP-9、C-caspase-3和Bax蛋白水平的變化

Figure 4. miR-137 targeted regulation of TWIST1. A: bioinformatics software was used to analyze the 3’-UTR binding sites of miR-137 and TWIST1; B: luciferase activity. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-NC group.

圖4 miR-137靶向調(diào)控TWIST1

Figure 5. Western blot was used to determine the TWIST1 protein levels in the breast cancer MDA-MB-231 cells transfected with miR-137 mimics. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-NC group.

圖5 Western blot檢測miR-137 mimics轉(zhuǎn)染后各組乳腺癌MDA-MB-231細胞中TWIST1的蛋白水平

腫瘤細胞的侵襲、遷移和凋亡等生物學特性的發(fā)揮與細胞內(nèi)多種調(diào)控因子的復雜調(diào)控過程有關(guān)[13]。Caspase是一個與細胞凋亡有關(guān)的蛋白家族，其含有多個成員，其中caspase-3位于該凋亡反應的下游，也是細胞凋亡的執(zhí)行因子[14]。Caspase-3在正常情況下沒有活性，只有被激活后形成C-caspase-3才可以發(fā)揮促進凋亡的作用[15]。Bax是屬于Bcl-2家族成員，在細胞凋亡中發(fā)揮促進作用[16]。MMP-9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員，其表達水平升高后是腫瘤侵襲和遷移能力升高的標志，MMP-9可以將細胞外基質(zhì)降解，為腫瘤的轉(zhuǎn)移提供條件[17]。我們的實驗發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-137能夠促進乳腺癌MDA-MB-231細胞中C-caspase-3和Bax蛋白表達，并抑制MMP-9蛋白表達，這與上述凋亡和侵襲、遷移結(jié)果一致，提示上調(diào)miR-137能夠抑制乳腺癌細胞侵襲、遷移并誘導細胞凋亡。

miRNA發(fā)揮多種生物學作用與靶向調(diào)控基因的表達有關(guān)，其可以通過作用于靶基因的3’-UTR端而抑制其翻譯過程[18]。目前對于miR-137的研究報道顯示，其可以通過作用于多個靶基因發(fā)揮腫瘤抑制作用，如EGFR、SDC42和CDK6等[19-21]。我們的實驗證實，miR-137可以通過抑制TWIST1的表達發(fā)揮抗乳腺癌MDA-MB-231細胞侵襲、遷移并誘導凋亡的作用，說明miR-137參與腫瘤發(fā)生過程與TWIST1表達有關(guān)。TWIST1在乳腺癌等腫瘤中高表達，其可以正調(diào)控腫瘤細胞侵襲、遷移，對于腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有促進作用[22]。

Figure 6. The changes of apoptosis (A), invasion, migration abilities (B) and the protein levels of MMP-9, C-caspase-3, Bax and TWIST1 (C) in the breast cancer MDA-MB-231cells after co-transfection of TWIST1 over-expression vector and miR-137 mimics. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-137+vector group.

圖6 TWIST1過表達載體和miR-137 mimics共轉(zhuǎn)染后乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡、侵襲、遷移和MMP-9、C-caspase-3、Bax和TWIST1蛋白水平的變化

綜上所述，miR-137具有抑制乳腺癌細胞惡性表型的作用，在乳腺癌中重建miR-137可能是乳腺癌治療的途徑之一，miR-137抗乳腺癌機制與靶向抑制TWIST1的表達有關(guān)，這為研究miR-137在腫瘤中的作用提供了參考。本次實驗研究只在乳腺癌細胞MDA-MB-231中進行了初步探討，在以后的實驗中會繼續(xù)研究其具體的靶向調(diào)控作用，并且會在多株乳腺癌細胞及體內(nèi)進行驗證。