CART肽通過(guò)激活ERK抑制氧糖剝奪誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP-4上調(diào)*

劉麗冰， 王 偉， 李 爍， 祝世功△

(1濰坊市益都中心醫(yī)院， 山東 青州 262500； 2北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 北京 100191)

可卡因-苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄(cocaine- and amphetamine-regulated transcript，CART)肽是一種在體內(nèi)廣泛分布的神經(jīng)內(nèi)分泌活性肽，具有廣泛的生理作用[1-2]。近年來(lái)的研究證實(shí)CART肽可通過(guò)多種途徑發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，例如Sha等[3]報(bào)道，CART肽可增加線粒體呼吸鏈復(fù)合物II活性并減輕糖氧剝奪(oxygen-glucose deprivation，OGD)誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷。Jia等[4]證實(shí)CART肽可通過(guò)激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)通路顯著減輕腦缺血再灌注引起的神經(jīng)元損傷。我們前期的部分工作也證實(shí)CART肽能抑制N-甲基門冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid,NMDA)誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡[5]，還可通過(guò)上調(diào)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)的合成與分泌減輕腦缺血再灌注后的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)[6]。

研究顯示，水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP-4)為水通道蛋白家族的重要成員之一，在腦內(nèi)主要分布于腦微血管周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞的終足和室管膜細(xì)胞上，在腦水腫的形成過(guò)程中起著重要作用[7-8]。本研究室前期工作證實(shí)，CART肽能夠抑制缺血再灌注小鼠腦組織水通道蛋白 4的表達(dá)和減輕腦水腫[9]，還觀察到CART肽激活 ERK通路促進(jìn)海馬神經(jīng)元合成腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子[10]。

我們推測(cè)ERK通路可能參與CART肽對(duì)AQP-4表達(dá)的調(diào)節(jié)，但具體的機(jī)制尚待闡明。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)分組

培養(yǎng)的小鼠腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞鑒定成功后接種于培養(yǎng)板，2代星形膠質(zhì)細(xì)胞共分為4組。對(duì)照(control)組加藥時(shí)只添加等量PBS，模型組(OGD組)僅給予OGD處理,CART組給予OGD加用CART肽處理，CART+PD98059組給予OGD、CART肽并加用PD98059處理。CART及CART+PD98059組在OGD開始同時(shí)便加入CART肽，劑量參照實(shí)驗(yàn)室前期工作[11]，選用10 nmol/L，復(fù)氧復(fù)糖后加入含CART肽的高糖培養(yǎng)基。CART+PD98059組在OGD前加入PD98059預(yù)處理30 min，劑量為25 μmol/L[10]。

2 主要試劑

DNA酶Ⅰ、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、山羊血清、DMEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶均購(gòu)自Gibco；CART肽購(gòu)自Phoenix；PD98059(MEK抑制劑)購(gòu)自Calbiochen；兔抗膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(glial fibrilillary acidic protein, GFAP)多克隆抗體、兔抗AQP-4抗體、兔抗-ERK單克隆抗體和兔抗ERK多克隆抗體均購(gòu)自Santa Cruz；兔抗β-actin抗體購(gòu)自CST；Biotin標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗和TRITC標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、MTT、RIPA裂解液和BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；蛋白質(zhì)分子量預(yù)染marker購(gòu)自Pierce。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定 小鼠腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)按本研究室前期實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行并稍加修改[12]。簡(jiǎn)言之，選用出生24 h內(nèi)的ICR小鼠[購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK(京)2016-0041]。無(wú)菌條件下分離小鼠的大腦皮層，在預(yù)冷的DMEM液中去除腦膜和血管，用眼科剪切成約1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，加0.25%的胰蛋白酶溶液，37 ℃水浴消化10 min，再加入含有10% 胎牛血清的高糖 DMEM 進(jìn)行終止消化，然后加入適量 DNA酶Ⅰ(1×105U/L), 進(jìn)行反復(fù)吹打制成細(xì)胞懸液，100目篩網(wǎng)過(guò)濾和離心后; 重懸于培養(yǎng)液中，接種于多聚賴氨酸預(yù)包被的細(xì)胞培養(yǎng)板中。置于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每3 d換液1次。10 d后于37 ℃恒溫?fù)u床 180 r/min 振蕩5 h，去除小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，再使用2.5 g/L 胰蛋白酶消化傳代。將所傳第2代的星形膠質(zhì)細(xì)胞接種于多聚賴氨酸預(yù)包被的蓋玻片上，48 h后取出，PBS 洗3次，每次5 min；4%多聚甲醛固定 30 min，PBS 洗3次，每次5 min；再用10%山羊血清封閉30 min，加兔抗GFAP抗體(1∶500)，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，PBS 洗3次，每次5 min；加入TRITC標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗，室溫下孵育 2 h，PBS 洗3次，每次5 min；細(xì)胞核用DAPI染色顯示，緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

3.2OGD模型制作 參照實(shí)驗(yàn)室前期工作[6]，需要行OGD處理的細(xì)胞培養(yǎng)板更換無(wú)糖的DMEM培養(yǎng)液，放入含有95% N2和5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h；然后復(fù)氧復(fù)糖，更換高糖DMEM培養(yǎng)基，再置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

3.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 參考本實(shí)驗(yàn)室前期所使用方法[5]。簡(jiǎn)言之，培養(yǎng)在 96孔板的細(xì)胞，每孔加入MTT溶液。活細(xì)胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶能將淡黃色的MTT還原為藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜，所以甲臜的數(shù)量與活細(xì)胞成正比，酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔的吸光度(absorbance，A;檢測(cè)波長(zhǎng) 560 nm,參比波長(zhǎng) 630 nm)。相對(duì)細(xì)胞活力(%)=A(各組)/A(control)×100%。

3.4Western blot檢測(cè) 同樣參照實(shí)驗(yàn)室前期使用方法[10]，簡(jiǎn)言之，經(jīng)過(guò)處理后的各組細(xì)胞，棄去上清液，用預(yù)冷的PBS清洗 2 次，加入RIPA裂解液，冰面上裂解15 min，然后12 000 r/min，4 ℃離心15 min，取上清，通過(guò)蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。以 10% SDS-PAGE分離，半干電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移至NC膜，裁剪相應(yīng)分子量的NC膜條帶，室溫下用封閉液封閉1 h，然后加入使用封閉液稀釋的相應(yīng)的Ⅰ抗，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜，然后用封閉液稀釋的相應(yīng)Ⅱ抗室溫孵育1 h，TBST洗膜后加入適當(dāng)?shù)缺壤旌虾玫腅CL發(fā)光試劑，孵育1 min，暗室中曝光。曝光后的膠片經(jīng)顯影定影處理后,獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以GraphPad Prism 5.0軟件分析作圖。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，若方差齊，則選用Bonferroni法進(jìn)行組間比較；若方差不齊，則選用Tamhane法進(jìn)行組間比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CART肽提高OGD后星形膠質(zhì)細(xì)胞的活力

所傳的第2代細(xì)胞，以GFAP抗體標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞，以DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，培養(yǎng)的細(xì)胞中，星形膠質(zhì)細(xì)胞比例在90%以上，見圖1A。以MTT法檢測(cè)OGD處理后各組星形膠質(zhì)細(xì)胞的活力，OGD組細(xì)胞相對(duì)活力為63.32%±7.42%，較control組顯著降低(P<0.01)，而CART肽顯著提升了OGD處理后的星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率(P<0.01)，見圖1B。

Figure 1. CART peptide induced a significant increase in the cell viability after OGD. A: DAPI and GFAP staining (×400); B: cell viability was determined by MTT assay. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsOGD group.

圖1 CART肽提高OGD后星形膠質(zhì)細(xì)胞的活力

2 CART肽促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞ERK的磷酸化

Western blot檢測(cè)各組星形膠質(zhì)細(xì)胞ERK磷酸化的程度，結(jié)果顯示，各組的ERK總量并無(wú)明顯差異；而在ERK磷酸化方面，與control組量化后，OGD組的p-ERK蛋白水平為106.9%±11.51%，給予CART肽能顯著引起星形膠質(zhì)細(xì)胞p-ERK蛋白水平(126.4%±12.55%)的增加(P<0.05);而采用ERK上游激酶MEK的拮抗劑PD98059處理后， p-ERK的蛋白水平(102.2%±12.73%)顯著減少(P<0.01)，見圖2。

3 PD98059減弱CART肽抑制OGD后星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP-4表達(dá)的作用

Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞AQP-4的含量，結(jié)果顯示，OGD組的AQP-4蛋白水平為171.4%±15.9%，CART肽能夠抑制OGD后星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP-4的表達(dá)(138.8%±16.89%；P<0.01)，而給予PD98059后，CART肽的作用顯著受到抑制，AQP-4的表達(dá)(162.1%±18.79%)較CART組升高(P<0.05)，見圖3。

Figure 2. CART peptide enhanced the phosphorylation level of ERK after OGD, which was inhibited by PD98059 pretreament. Mean±SD.n=6.##P<0.01vsCART group;*P<0.05vsOGD group.

圖2 CART肽促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞ERK的磷酸化

Figure 3. PD98059 inhibited down-regulation of AQP-4 expression induced by CART peptide after OGD. Mean±SD.n=6.#P<0.05vsCART group;**P<0.01vsOGD group;△△P<0.01vscontrol group.

圖3 PD98059減弱CART 肽對(duì)OGD后星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP-4表達(dá)的抑制作用

討 論

缺血性腦血管疾病是目前臨床上常見的一類疾病，具有高致殘和并發(fā)癥難以治愈等特點(diǎn)，而腦缺血所引起的腦水腫，是目前導(dǎo)致患者死亡的最主要原因，因此防治腦水腫一直是臨床上治療相關(guān)疾病的重點(diǎn)。研究證明AQP-4在腦內(nèi)的表達(dá)與腦水腫的形成密切相關(guān)[7]，其上調(diào)可加重腦缺血后腦水腫的形成[13-14]。

CART肽是近些年新發(fā)現(xiàn)的在體內(nèi)廣泛分布的神經(jīng)內(nèi)分泌活性肽，具有多種生物學(xué)作用，近年來(lái)對(duì)于其與一些臨床疾病的相關(guān)研究已經(jīng)積累了大量資料。我們的前期工作發(fā)現(xiàn)CART肽具有腦保護(hù)作用，可以起到神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用，并通過(guò)多種途徑可以提高神經(jīng)元在受到損傷后的生存率[5-6, 10]。我們近期的研究還發(fā)現(xiàn)，CART肽可以通過(guò)抑制AQP-4的上調(diào)，減輕腦缺血再灌注后的腦水腫[9]，這證明AQP-4是CART肽在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮腦保護(hù)作用的重要靶點(diǎn)之一。本文進(jìn)一步探索CART肽調(diào)節(jié)AQP-4的分子機(jī)制。

AQP-4在腦內(nèi)主要分布于腦微血管周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞的終足和室管膜細(xì)胞上[8]，故本實(shí)驗(yàn)通過(guò)小鼠腦星形膠質(zhì)細(xì)胞氧葡萄糖剝奪誘導(dǎo)損傷模型進(jìn)行研究。我們先前的研究已經(jīng)證明了CART肽的腦保護(hù)作用，但實(shí)驗(yàn)對(duì)象多為神經(jīng)元，本實(shí)驗(yàn)證明，CART肽同樣能夠提高氧糖剝奪后星形膠質(zhì)細(xì)胞的活力，進(jìn)一步完善了對(duì)CART肽腦保護(hù)作用的認(rèn)識(shí)。 我們先前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明[9]，CART肽能夠減輕腦缺血再灌注后的腦水腫及抑制AQP-4的表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)采用小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行OGD實(shí)驗(yàn)，取得結(jié)果與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)保持了一致。本實(shí)驗(yàn)室的前期工作證實(shí)，CART肽能夠通過(guò)激活ERK促進(jìn)海馬神經(jīng)元合成 BDNF，進(jìn)而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減少腦缺血再灌注引起的神經(jīng)元凋亡[6, 10, 12]，Jia等[4]的相關(guān)研究也指出，CART肽可通過(guò)激活ERK通路減輕小鼠腦缺血再灌注后的損傷。本研究證明CART可以提高星形膠質(zhì)細(xì)胞在予氧糖剝奪-再灌注處理后ERK的磷酸化水平，而這種變化可被ERK上游激酶MEK的拮抗劑PD98059拮抗。目前的國(guó)內(nèi)外資料已經(jīng)證實(shí)了CART肽的腦保護(hù)作用，可以調(diào)節(jié)AQP-4并減輕腦水腫，但目前對(duì)于CART肽如何調(diào)控AQP-4尚未有報(bào)道，本研究通過(guò)星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪模型并加入PD98059證實(shí)，CART肽可通過(guò)激活ERK通路抑制AQP-4的上調(diào)，進(jìn)而減輕腦水腫，起到腦保護(hù)作用。

綜上所述，CART肽作為一種內(nèi)源性肽，可以提高氧糖剝奪后星形膠質(zhì)細(xì)胞的活力，并可通過(guò)激活ERK通路抑制AQP-4的表達(dá)。這些結(jié)果對(duì)于探尋腦缺血再灌注損傷的治療可能具有重要意義。