螺內(nèi)酯對(duì)慢性房顫模型兔心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的影響

楊 倩， 王立立， 田國(guó)棟， 宋學(xué)蓮， 孟存良

(1河北省人民醫(yī)院心內(nèi)科， 河北 石家莊 050051； 2容城縣人民醫(yī)院心內(nèi)科， 河北 容城 071600)

心房顫動(dòng)(atrial fibrillation，AF)，簡(jiǎn)稱房顫，是臨床上最常見(jiàn)的心律失常[1]，它可以導(dǎo)致心衰和腦卒中等多種并發(fā)癥，并可引起死亡率增加[2]。隨著我國(guó)人口老齡化進(jìn)程的加速，房顫的發(fā)病率逐漸增加， 已經(jīng)成為影響公眾健康和加重社會(huì)負(fù)擔(dān)的重要疾病[3]，但目前房顫的治療效果尚不盡如人意。因此，了解房顫的發(fā)病機(jī)制，從而探索房顫治療的新方法，仍是臨床亟待解決的問(wèn)題。

心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)在房顫的發(fā)生和維持中發(fā)揮重要作用，它可以導(dǎo)致房?jī)?nèi)及房間傳導(dǎo)延遲、傳導(dǎo)異質(zhì)性增加，促進(jìn)折返形成，從而導(dǎo)致房顫[4-5]。近年來(lái)的研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteina-ses，MMPs)，尤其是MMP-2和MMP-9的表達(dá)及活性增加是引起心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的關(guān)鍵因素[6-7]，而螺內(nèi)酯(spironolactone，SP)可以抑制MMPs的表達(dá)[8-9]。本研究通過(guò)快速心房起搏(rapid atrial pacing, RAP)3周建立兔慢性房顫模型，探討螺內(nèi)酯對(duì)于該模型兔心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)及MMPs表達(dá)的影響。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物和材料

選用新西蘭兔24只作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，體重2.5～3.5 kg，由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(合格證號(hào)：11400700277731)。動(dòng)物心臟起搏器購(gòu)自上海復(fù)旦旦華科技有限公司，起搏電壓5 V，起搏頻率為 600次/分。采用Philip IU22超聲診斷儀測(cè)定各項(xiàng)心臟超聲指標(biāo)；采用蘇州東方DF-5A型電生理刺激儀行心房Burst刺激?？耿裥湍z原蛋白(collagenⅠ)和Ⅲ型膠原蛋白(collagenⅢ)抗體購(gòu)自Bioworld;抗MMP-2、MMP-9和內(nèi)參照β-actin抗體均購(gòu)自ProteinTech。

2 主要方法

2.1兔房顫模型的建立 動(dòng)物用3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)經(jīng)耳緣靜脈注射麻醉，仰臥位固定于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上，備皮，于胸骨左緣第3、4肋間打開(kāi)胸腔，暴露心臟，找到左心房，采用結(jié)扎左心耳的方法將起搏電極固定于左心房，引出電極，關(guān)閉胸腔。電極沿皮下隧道移行至右側(cè)后背部，應(yīng)用電生理刺激儀測(cè)試電極，保證裸露導(dǎo)線與心房肌接觸良好，且與胸壁絕緣。于兔右側(cè)背部脊柱旁制作起搏器囊袋，慶大霉素沖洗囊袋后，將動(dòng)物起搏器與起搏電極連接固定，起搏器設(shè)置為關(guān)閉狀態(tài)，置于皮下囊袋中[10]。術(shù)后用青霉素抗感染治療，恢復(fù)1周。

2.2實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為3組：RAP和螺內(nèi)酯組(RAP+SP組)給予開(kāi)胸、固定左心房電極、持續(xù)心房起搏3周，自起搏開(kāi)始前3 d至起搏3周結(jié)束，每日分別給予生理鹽水10 mL和螺內(nèi)酯20 mg/kg(溶解于10 mL生理鹽水中)灌胃；假手術(shù)組(sham組)僅給予開(kāi)胸、固定左心房電極，不起搏，不給藥。每日行心電圖檢查，保證起搏器正常工作。

2.3超聲心動(dòng)圖指標(biāo)的測(cè)定 采用超聲診斷儀于起搏前、后行經(jīng)胸?zé)o創(chuàng)心臟超聲檢查，測(cè)量左心房?jī)?nèi)徑(left atrial diameter，LAD)。于心尖4腔切面及心尖兩腔切面，應(yīng)用雙平面面積長(zhǎng)度法，在二尖瓣開(kāi)放前測(cè)量左心房最大容量(left atrial maximal volume，LAVmax)；在舒張末期(二尖瓣關(guān)閉后)測(cè)量左心房最小容量(left atrial minimal volume，LAVmin)。左心房射血分?jǐn)?shù)(left atrial ejection fraction，LAEF)通過(guò)應(yīng)用公式計(jì)算得出：LAEF(%)=(LAVmax-LAVmin)/LAVmax×100%[11]。

2.4房顫誘發(fā)率的測(cè)定 采用電生理刺激儀于起搏前、后行心房Burst刺激測(cè)定房顫誘發(fā)率。給予S1S1刺激，周長(zhǎng)50 ms，電壓為2倍舒張期閾值電壓+0.5 V，重復(fù)8次(前4次每次6 s，后4次每次12 s)[12]。應(yīng)用公式：房顫誘發(fā)率(%)=誘發(fā)房顫成功兔只數(shù)/行Burst刺激兔總只數(shù)×100%進(jìn)行計(jì)算。

2.5心房間質(zhì)纖維化程度的測(cè)定 采用4%多聚甲醛溶液固定左心房組織，石蠟包埋后制成厚度約為5 μm的石蠟切片，行Masson染色。顯微鏡下，心肌間質(zhì)纖維呈藍(lán)色，心肌細(xì)胞呈紅色。每個(gè)標(biāo)本選取5個(gè)視野，使用Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)獲得的圖片進(jìn)行圖像分析，心房纖維化百分比(%)=心房纖維組織面積/(心房纖維組織面積+心房肌組織面積)×100%[12]。

2.6心房collagenⅠ、collagenⅢ、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平的測(cè)定 取左心房心肌組織剪碎，用RIPA裂解液抽提心房肌組織總蛋白，Bardford比色法測(cè)定抽提蛋白的濃度。按照說(shuō)明書進(jìn)行操作，蛋白樣品與4×蛋白質(zhì)凝膠電泳上樣緩沖液混合后電泳，然后采用半干轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)移到PVDF膜，PVDF膜經(jīng)5% BSA封閉2 h，于經(jīng)PBS稀釋的Ⅰ抗工作液中4 ℃反應(yīng)過(guò)夜，再經(jīng)1×PBST稀釋3 000倍的Ⅱ抗工作液處理90 min，蛋白條帶通過(guò)顯影定影液顯色后，采用UVP分析儀器，對(duì)膠片進(jìn)行掃描分析，系統(tǒng)自動(dòng)生成灰度值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS 19.0軟件包分析處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，各組組內(nèi)前后測(cè)量數(shù)據(jù)比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，3組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 動(dòng)物的一般情況

Sham組家兔因手術(shù)死亡1只，RAP組和RAP+SP組各有1只因起搏電極脫位未完成實(shí)驗(yàn)而剔除。

2 超聲心動(dòng)圖中各項(xiàng)指標(biāo)的變化

起搏前3組兔心房的各項(xiàng)超聲指標(biāo)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)。起搏3周后，RAP組和RAP+SP組兔左心房較假手術(shù)組明顯擴(kuò)張，LAD、LAVmax和LAVmin明顯增加(P<0.05)，LAEF明顯下降(P<0.05)，但RAP組和RAP+SP組相比較，LAD、LAVmax、LAVmin和LAEF的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 左心房結(jié)構(gòu)和功能的變化

*P<0.05vsbaseline;#P<0.05vssham group.

3 房顫誘發(fā)率的變化

起搏前對(duì)3組兔經(jīng)心房Burst刺激均未能誘發(fā)房顫。起搏3周后，經(jīng)心房Burst刺激后，sham組的動(dòng)物均未誘發(fā)房顫，RAP組7只兔均誘發(fā)持續(xù)性房顫(誘發(fā)率100%)，RAP+SP組7只兔中有5只誘發(fā)持續(xù)性房顫(誘發(fā)率71%)。

4 心房纖維化程度的變化

起搏3周后，RAP組心房纖維化百分比較sham組明顯增加(P<0.05);RAP+SP組心房纖維化百分比較sham組明顯增加(P<0.05)，但較RAP組明顯下降(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

Figure 1. The left atrial myocardium with Masson trichrome-staining of the 3 groups after 3 weeks of RAP (×200). Mean±SD.n=7.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsRAP group.

圖1 起搏3周后3組兔左心房的Masson染色觀察

5 心房collagenⅠ和collagenⅢ蛋白表達(dá)水平的變化

起搏3周后，RAP組和RAP+SP組的collagenⅠ和collagenⅢ蛋白表達(dá)水平較假手術(shù)組均明顯增加(P<0.05)，但RAP+SP組collagenⅠ和collagenⅢ的蛋白水平較RAP組下降(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

Figure 2. The protein expression of collagenⅠand collagen Ⅲ in the left atria. Mean±SD.n=7.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsRAP group.

圖2 左心房Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)水平

6 心房MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平的變化

起搏3周后，RAP組和RAP+SP組的MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平較sham組均明顯增加(P<0.05)，但RAP+SP組MMP-2和MMP-9的蛋白水平較RAP組下降(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

Figure 3. The protein expression of MMP-2 and MMP-9 in the left atria. Mean±SD.n=7.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsRAP group.

圖3 左心房MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平的變化

討 論

房顫發(fā)生和維持的主要機(jī)制是心房重構(gòu)，包括電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)。相較于電重構(gòu)，結(jié)構(gòu)重構(gòu)不完全可逆，其在房顫的發(fā)生和維持中發(fā)揮更為重要作用，主要表現(xiàn)為心房擴(kuò)張和間質(zhì)纖維化[4]。左房擴(kuò)張是房顫的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[13]，相對(duì)于左心房?jī)?nèi)徑而言，左心房容積在預(yù)測(cè)房顫復(fù)發(fā)方面是更準(zhǔn)確的參考指標(biāo)。心房間質(zhì)纖維化是結(jié)構(gòu)重構(gòu)的特征性改變，持續(xù)性房顫患者心房間質(zhì)纖維化程度明顯增加[14]。我們既往的研究表明[10]，快速起搏兔心房3周可引起左心房容積明顯擴(kuò)張，間質(zhì)纖維化程度明顯增加，但左心室的結(jié)構(gòu)和功能均不受影響，因此兔慢性房顫模型是研究藥物對(duì)心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的理想模型。本研究應(yīng)用兔慢性房顫模型進(jìn)行研究，結(jié)果顯示：螺內(nèi)酯能夠抑制心房Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)，抑制兔心房間質(zhì)纖維化，從而抑制心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)；螺內(nèi)酯對(duì)于心房擴(kuò)張無(wú)明顯作用，這可能與心房擴(kuò)張明顯(LAVmax約為假手術(shù)組4倍)，而藥物干預(yù)時(shí)間相對(duì)較短有關(guān)。

MMPs是一組存在于細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白水解酶，生理狀態(tài)下，激活的MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，維持心肌間質(zhì)纖維蛋白穩(wěn)定性；病理狀態(tài)下，MMPs的過(guò)度激活則與心肌間質(zhì)纖維化密切相關(guān)。多項(xiàng)臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，MMPs，特別是MMP-2和MMP-9的表達(dá)和活性增加與心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)密切相關(guān)，其可以引起心房細(xì)胞外膠原沉積增加，導(dǎo)致心肌纖維化水平增加[10, 15]；抑制MMPs可以使心肌纖維化水平下降，進(jìn)而降低房顫誘發(fā)率和誘發(fā)房顫的持續(xù)時(shí)間[9]； MMPs水平不僅與心血管人群房顫的發(fā)生相關(guān)[16]，還與射頻消融術(shù)后房顫的復(fù)發(fā)相關(guān)[17]。

醛固酮受體拮抗劑螺內(nèi)酯可能通過(guò)抑制醛固酮所致的氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制心肌組織MMPs的表達(dá)和活性，從而發(fā)揮抑制心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的作用。Zhao等[9]的研究顯示，螺內(nèi)酯可以抑制慢性房顫模型犬心房MMP-9的表達(dá)，增加金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)-1的表達(dá)，從而抑制心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)，但其未評(píng)估螺內(nèi)酯對(duì)于心肌組織MMP-2的作用。本研究評(píng)估了螺內(nèi)酯對(duì)慢性房顫模型兔心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的作用，并對(duì)MMP-2和MMP-9可能發(fā)揮的作用進(jìn)行了探討，結(jié)果顯示,螺內(nèi)酯能夠下調(diào)慢性房顫模型兔心房MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)，這可能是其抑制心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的潛在作用機(jī)制。